全 文 ：辽宁省白头翁叶斑病菌的遗传多样性*
苏摇 丹摇 傅俊范**
(沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)
摘摇 要摇 白头翁叶斑病是近年来我国新报道发生的一种白头翁叶部病害,在辽宁省保护地白
头翁生产中病害尤为严重. 对采自辽宁省 5 个白头翁主产区的 25 株白头翁叶斑病菌(Asco鄄
chyta anemones)菌株及中国农业科学院惠赠的 5 个壳二孢属(Ascochyta spp. )菌株进行 RAPD
分析.结果表明: 11 条随机引物共扩增得到条带清晰并呈多态性的 108 条谱带,单个引物扩
增 DNA片段集中分布在 200 ~ 2000 bp.采用 NTSYS软件进行病原菌的聚类分析,发现供试的
30 株壳二孢菌的遗传相似系数为 0. 56 ~ 0. 98,当相似系数为 0. 62 时,30 个菌株被划分为 4
个类群,说明辽宁省白头翁叶斑病菌具有丰富的遗传多样性. RAPD遗传聚类组群与白头翁叶
斑病菌菌株的地理来源有一定的相关性,不同寄主来源的菌株之间存在明显的遗传差异.
关键词摇 白头翁叶斑病菌摇 遗传多样性摇 RAPD分析摇 壳二孢菌
文章编号摇 1001-9332(2012)12-3409-05摇 中图分类号摇 S432. 1摇 文献标识码摇 A
Genetic diversity of Ascochyta anemones isolates in Liaoning Province of Northeast China.
SU Dan, FU Jun鄄fan (Department of Plant Pathology, College of Plant Protection, Shenyang Agri鄄
cultural University, Liaoning 110866, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(12): 3409-3413.
Abstract: Windflower leaf spot is a newly reported leaf disease in China, and becomes very serious
in the protected field of windflower (Pulsitilla chinensis) in Liaoning Province. In this study, a ran鄄
dom amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was made on the 25 Ascochyta anemones isolates
from 5 main P. chinensis production areas in the Province and 5 Ascochyta spp. isolates presented
by the Chinese Academy of Agricultural Sciences. A total of 108 polymorphic DNA bands sized
200-2000 bp were obtained by using 11 random primers. The NTSYS cluster analysis showed that
the genetic similarity coefficient of the 30 Ascochyta isolates was 0. 56 -0. 98, and these isolates
could be divided into 4 genetic groups when the similarity coefficient was 0. 62, suggesting that the
pathogens of windflower leaf spot in the Province had rich genetic diversity. There existed definite
correlations between the RAPD clustering groups and their geographic distribution, and an obvious
genetic difference among the isolates from different host sources.
Key words: Ascochyta anemones; genetic diversity; RAPD; Ascochyta spp.
*中鄄韩合作项目(sk2007005)资助.
**通讯作者. E鄄mail: fujunfan@ 163. com
2012鄄06鄄11 收稿,2012鄄09鄄27 接受.
摇 摇 白头翁(Pulsitilla chinensis)为毛茛科白头翁属
多年生草本植物,根可入药[1-2] .白头翁作为中药始
载于《神农本草经》,其性寒,味苦,具有凉血止痢、
燥湿杀虫的功效[3-5],药理研究表明有抗微生物、抗
蔗糖酶、抗肿瘤等活性[6-9] . 有研究发现,其所含的
某些活性成分对治疗老年性痴呆(阿尔茨海默病)
效果显著[10] .近几年来,从白头翁中提取了多种化
学成分,主要为三萜皂苷类,分别属于羽扇豆烷型和
齐墩果烷型[11-13] .随着辽宁农业产业结构调整的不
断深入,野生白头翁的归圃栽培越来越受到人们的
重视.在此过程中发现白头翁病害日趋严重,白头翁
叶斑病是其主要病害之一,迄今国内外尚未见该病
的系统研究报道.我国对白头翁叶斑病的研究仅限
于病原学和药剂防治方面[14-17],而关于白头翁叶斑
病菌遗传多样性方面研究未见报道.
随机扩增多态性 DNA 标记( random amplified
polymorphic DNA,RAPD)技术已经广泛用于植物病
原菌的遗传多样性分析研究[18-24] .辽宁省为白头翁
叶斑病重发区,弄清该病病原菌的遗传多样性具有
重要的理论价值和实际意义.为此,本文采用 RAPD
分子标记技术,对采自辽宁省不同地区的白头翁叶
斑病菌株的遗传多样性进行分析,以期为病害的进
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 12 月摇 第 23 卷摇 第 12 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Dec. 2012,23(12): 3409-3413
一步研究及防治工作提供科学依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试菌株
2010 和 2011 年,对辽宁省主要白头翁种植区
进行全面调查并采集病样(病叶或病茎),进行组织
分离并单孢纯化后,从中选取有代表性的 25 个菌株
进行 RAPD分析,最后与中国农业科学院惠赠的 5
个壳二孢属(Ascochyta spp. )菌株(含 2 个黄瓜枯萎
病菌菌株、2 个南瓜枯萎病菌菌株、1 个番茄褐斑病
菌菌株)的 RAPD 图谱进行了综合聚类分析. 30 个
菌株的寄主及采集地见表 1.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 DNA提取摇 供试菌株接种于 PDA 培养基上,
放在20 益条件下培养7 d,用内径5 mm的打孔器
表 1摇 供试壳二孢属菌株来源
Table 1摇 Source of Ascochyta spp. isolates
编号
Code
菌株编号
Strain code
采集时间
Collecting date
采集地
Sampling site
寄主
Host
1 XA11090802 2011 沈阳市 兴安白头翁1)
2 XJP鄄E 2011 抚顺市清源县 朝鲜白头翁2)
3 MJZ鄄A 2011 抚顺市抚顺县 朝鲜白头翁
4 CX鄄11090801 2011 沈阳市 朝鲜白头翁
5 SY鄄C 2011 沈阳市 朝鲜白头翁
6 SY鄄M 2011 本溪市 朝鲜白头翁
7 M 2011 本溪市 朝鲜白头翁
8 XA11090801 2011 抚顺市清源县 兴安白头翁
9 SY鄄A 2011 本溪市 朝鲜白头翁
10 YEM 2010 抚顺市清源县 朝鲜白头翁
11 11 年 SY鄄C 2011 本溪市 朝鲜白头翁
12 CX11090805 2011 抚顺市清源县 朝鲜白头翁
13 520鄄1 2011 抚顺市清源县 朝鲜白头翁
14 MJZ鄄C 2011 抚顺市抚顺县 朝鲜白头翁
15 10 年 07 2010 沈阳市 兴安白头翁
16 10 年 16鄄2 2010 沈阳市 朝鲜白头翁
17 10 年兴安 2010 抚顺市新宾县 兴安白头翁
18 SY鄄C 2010 本溪市 朝鲜白头翁
19 MJZ鄄C 2011 抚顺市抚顺县 朝鲜白头翁
20 XJP 2011 抚顺市清源县 朝鲜白头翁
21 SY鄄Dn1 2011 抚顺市新宾县 朝鲜白头翁
22 兴安 2010 抚顺市新宾县 兴安白头翁
23 中国 B 2011 抚顺市新宾县 中国白头翁3)
24 野生 a 2011 野生 野生白头翁4)
25 SY鄄4 2011 抚顺市新宾县 朝鲜白头翁
26 HG鄄A 2010 - 黄瓜5)
27 HG鄄B 2010 - 黄瓜
28 NG鄄A 2010 - 南瓜6)
29 NG鄄B 2010 - 南瓜
30 FQ 2010 - 番茄7)
1)Pulsatill dahurica; 2)P. koreana; 3)P. chinensis; 4)Pulsatilla sp. ;
5)Cucumis sativus; 6)C. moschata; 7)Solanum lycopersicum.
于菌落边缘打取菌碟,转接到 PD培养液中,25 益条
件下摇床振荡培养 7 d,4 层纱布过滤菌丝体,用无
菌水冲洗,3 层纱布过滤后,再用灭菌的滤纸吸干水
分,放在 50 益温箱中将菌丝烘干,-80 益保存备用.
使用新型植物基因组 DNA 提取试剂盒(TIANGEN)
提取基因组 DNA.
1郾 2郾 2 PCR 扩增 摇 反应体系:10 伊PCR 缓冲液 2郾 5
滋L,2郾 5 mmol dNTP 2 滋L,10 滋mol·L-1随机引物 1
滋L,10 ng·滋L-1 DNA 1 滋L,5 U·滋L-1 Taq DNA 聚
合酶 0. 5 滋L,超纯水(ddH2O) 18 滋L,总反应体积为
25 滋L.
扩增程序:95 益变性 5 min;94 益变性 1 min;37
益退火 45 s,72 益延伸 90 s,共 40 个循环,72 益延
伸 7 min.
1郾 2郾 3 引物筛选 摇 用 20 条 10 bp 的随机引物(表
2),对具有代表性的 DNA进行 PCR扩增,筛选出条
带清晰且重复性好的引物进行遗传多态性分析. 最
后,筛选出 11 个能够扩增出较多 DNA片段、谱带清
晰、带型稳定、具有多态性的随机引物,用于 PAPD鄄
PCR反应.
1郾 2郾 4 电泳检测摇 取 5 滋L扩增产物与 2 滋L 上样缓
冲液混匀,在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳,经 EB
染色后,80 V稳压电泳 1 h,在紫外成像仪上观察并
拍照.
1郾 3摇 数据处理
参照琼脂糖凝胶电泳图谱,根据电泳条带的有、
无 ,分别记为1或0 . 采用NTSYS鄄PC 2 . 0软件进行
表 2摇 RAPD引物对壳二孢属菌株的扩增结果
Table 2 摇 Results of amplification with RAPD primers for
Ascochyta spp. isolates
引物编号
Primer No.
核苷酸序列
Nucleotide
sequence
扩增条带
No. of
amplified
band
多态性
条带数
No. of
polymorphic
band
多态性比例
Percentage of
polymorphic
band
(% )
OPG03 GAGCCCTCCA 12 12 100
SD12 ACGGTGCCTG 9 9 100
SD1 CAGCACCCAC 7 7 100
SD2 GGTGACGCAG 8 8 100
SD3 GTTAGTGCGG 11 11 100
SD6 GAAACAGCGG 11 11 100
SD7 CTCGACACTG 9 9 100
SD8 GTCCTCAACG 12 12 100
OPG03 GAGCCCTCCA 11 11 100
OPE20 AACGGTGACC 10 10 100
OPH07 CTGCATCGTG 8 8 100
合计 Total - 108 108 100
平均 Average - 10 10 100
0143 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
聚类分析 0 / 1 矩阵,计算菌株之间的相似系数.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 白头翁叶斑病菌菌株模板 DNA提取结果
由图 1 可以看出,供试的 30 个壳二孢属菌株基
因组 DNA条带单一且无弥散拖尾现象,说明提取的
DNA样品完整性好且纯度高,基本无降解和 RNA
污染,可满足进一步试验要求.
2郾 2摇 引物扩增结果分析
由表 2 可以看出,从供试 20 条引物中筛选出
11 条扩增条带较多、信号强、条带清晰、多态性显著
的引物.用筛选的 11 条引物对供试菌株进行扩增,
共扩增出 108 条谱带,平均每条引物多态性 10 条,
单个引物扩增出来的 DNA 片段大多分布在 200 ~
2000 bp,所扩增出的 DNA条带均为多态带,说明辽
宁省白头翁叶斑病菌存在着丰富的遗传多样性. 其
中,引物 OPG03 扩增的条带数最多、多态性最好.
2郾 3摇 白头翁叶斑病病原菌 RAPD分析
通过 11 条引物对 30 个菌株的 RAPD鄄PCR扩增
均可取得较好的效果,扩增条带清晰稳定. 因此,所
筛选的 11 条引物均可用于壳二孢菌株的遗传多态
性分析.由图 2 可以看出,不同菌株在扩增条带之间
存在显著差异,表明辽宁省白头翁叶斑病菌存在丰
富的多态性.其中,白头翁叶斑病菌与黄瓜蔓枯病菌
(A. citrullina)、南瓜蔓枯病菌(A. cucumis)、番茄褐
斑病菌(A. lycopersici)之间的相似系数较小(图 3),
说明不同寄主上的壳二孢菌株在遗传上差异显著,
亲缘关系较远.
2郾 4摇 聚类分析
由图 3 可以看出,30 株供试菌株之间的遗传相
似系数为 0. 56 ~ 0. 98,表明菌株间存在明显的遗传
分化现象.在遗传相似系数为 0. 56 时,供试的 30 株
壳二孢菌株可明显地分为 2 个 RAPD类群.其中,类
群 1 包括 1 ~ 25 号菌株以及 30 号菌株;类群 2 包括
26 ~ 29 号菌株.这说明白头翁叶斑病菌菌株间的亲
缘关系最近,而与其他寄主壳二孢菌菌株的遗传差
异较大、亲缘关系较远、同源性较低,不同寄主来源
图 1摇 壳二孢属菌株基因组 DNA提取电泳结果
Fig. 1 摇 Extraction results of Ascochyta spp. isolates genomic
DNA.
M: DNA标记 DL2000 DNA marker DL 2000.
图 2摇 引物 SD2 和 OPG03 的壳二孢属菌株 RAPD扩增结果
Fig. 2 摇 RAPD Amplification results of Ascochyta spp. isolates
with primers SD2 and OPG03.
图 3摇 30 个壳二孢属菌株的 RAPD聚类分析树状图
Fig. 3 摇 RAPD dendrogram of cluster analysis of 30 Ascochyta
spp. isolates.
的菌株之间存在明显的遗传差异.
当相似系数为 0. 62 时,30 个菌株被划分为 4
组.组玉有 2 个菌株,来自沈阳市和抚顺市抚顺县;
组域有 19 个菌株,来源于除本溪市的其他 4 个地
点;组芋有 5 个菌株,均来源于本溪市;组郁有 4 个
菌株,包括 2 株黄瓜枯萎病菌和 2 株南瓜枯萎病菌.
从聚类分析结果看,RAPD 类群划分与菌株的地理
来源存在一定的相关性,同时,辽宁省不同地区部分
菌株存在交叉聚类现象,来源于同一地点的菌株不
完全在一个类群中,说明各地病原菌存在一定的亲
缘关系,同时也存在一定的遗传变异.
3摇 讨摇 摇 论
通过对所分离的 30 株壳二孢菌株进行 RAPD
遗传多样性分析,可以看出辽宁省白头翁叶斑病菌
菌株之间存在丰富的遗传多样性. 聚类分析结果表
114312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 苏摇 丹等: 辽宁省白头翁叶斑病菌的遗传多样性摇 摇 摇 摇
明,辽宁省内 RAPD 类群划分与菌株的地理来源存
在一定相关性,同时,辽宁省不同地区部分菌株存在
交叉聚类现象,来源于同一地点的菌株不全在一个
类群中,说明各地病原菌存在一定的亲缘关系,同时
也存在一定的遗传变异.
随着分子生物学技术的发展,利用分子特征进
行真菌遗传多样性分析已经逐步被人们采纳,在对
遗传背景了解甚少的情况下,采用随机引物扩增多
态性 DNA 分子标记对植物病原真菌进行遗传多样
性分析是行之有效的. Wang 等[19]对加拿大西部省
份亚伯达的 86 个壳二孢属菌株进行了 RAPD 分析
和致病力测定,并应用 RAPD 技术快速诊断和检测
豌豆枯萎病. Fischer 等[25]对采自意大利的 30 个鹰
嘴豆枯萎病致病菌(A. rabiei)菌株进行了 RAPD 分
析,结果表明遗传聚类组群划分与菌株的致病力没
有明显的相关性. 杨龙祥等[26]对来自云南省 24 个
烟草赤星病菌株((Alternaria alternata)进行 RAPD
分析,发现不同地区赤星病菌的遗传结构之间有一
定的差异,生态环境相似性越大的地区,赤星病菌的
遗传结构相似程度越高,这与本研究结果一致.在我
国,RAPD技术已被广泛应用到种质资源鉴定和种
群遗传多样性研究.王辉等[27]利用 SRAP 技术对辽
宁省 25 个辣椒疫病菌菌株(Phytophthora capsici)进
行聚类分析,认为菌株间没有表现出明显的区域性
特征, 菌株致病力强弱分化区域特征性规律不明
显.孙文秀等[28]利用 RAPD 技术对广东、湖北、云
南、山东、浙江、重庆和湖南 7 个省份的辣椒疫病的
遗传多样性进行研究,结果表明,同一区域的菌株表
现出丰富的遗传多样性.易克贤等[29]利用 RAPD 分
子标记技术对 43 个代表性菌株进行了基因组 DNA
分析,结果发现,同一 RAPD聚类组内的菌株通常来
自于同一寄主基因型或同一地理区域,这与本研究
结果一致.
用 RAPD技术可以进行病原菌一般水平上的遗
传多样性及亲缘关系的研究,但相似种的亲缘关系
划分还需借助其他的遗传多样性分析手段,如
AFLP、SSR等. 此外,筛选合适高效的分子标记方
法,用于分析群体遗传多样性和致病性分化有待进
一步研究.
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作者简介摇 苏摇 丹,女,1984 年生,博士研究生. 主要从事药
用植物病理学研究. E鄄mail: sdsyau@ 163. com
责任编辑摇 孙摇 菊
314312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 苏摇 丹等: 辽宁省白头翁叶斑病菌的遗传多样性摇 摇 摇 摇