全 文 ：长期施肥对稻田土壤细菌、古菌多样性
和群落结构的影响∗
袁红朝１，２　 吴　 昊２， ３　 葛体达１，２∗∗　 李科林３　 吴金水１　 王久荣１
（ １中国科学院亚热带农业生态研究所 ／亚热带农业生态过程重点实验室， 长沙 ４１０１２５； ２中国农业科学院农业环境与可持续
发展研究所 ／农业部农业环境重点实验室， 北京 １０００８１； ３中南林业科技大学林学院， 长沙 ４３００００）
摘　 要　 稻田土壤是“迷失碳”的重要吸纳场所之一，也是温室气体（ＣＨ４和 Ｎ２Ｏ 等）的重要
排放源．大气温室气体的动态变化与土壤碳氮转化的微生物过程紧密相关．以湖南桃江国家级
稻田肥力变化长期定位试验点为平台，采用 ＰＣＲ⁃克隆测序和实时荧光定量 ＰＣＲ技术，研究不
施肥（ＣＫ）、施氮磷钾肥（ＮＰＫ）和氮磷钾肥＋秸秆还田（ＮＰＫＳ）３种长期施肥制度（＞２５ ａ）对稻
田土壤细菌和古菌群落结构及数量的影响．细菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因文库分析结果表明： 稻
田土壤细菌主要类群为变形菌、酸杆菌、绿弯菌，而古菌主要为泉古菌和广古菌．长期施肥导
致土壤细菌和古菌种群结构产生明显差异，与 ＣＫ 相比，ＮＰＫ 和 ＮＰＫＳ 处理稻田土壤的变形
菌、酸杆菌和泉古菌相对丰度增加． ＬＩＢＳＨＵＦＦ 软件分析结果也表明，１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因文库在
ＣＫ、ＮＰＫ及 ＮＰＫＳ处理间存在显著差异．３种施肥处理的稻田土壤细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因拷贝数
为每克干土 ０．５８×１０１０ ～ １．０６×１０１０个，古菌为每克干土 １．１６×１０６ ～ １．７２×１０６个．施肥（ＮＰＫ 和
ＮＰＫＳ）后，细菌和古菌的多样性和数量增加，且 ＮＰＫＳ＞ＮＰＫ．说明长期施肥显著影响土壤细菌
和古菌群落结构、多样性及数量．
关键词　 稻田土壤； 施肥； 细菌； 古菌； 多样性
∗国家自然科学基金项目（４１３０１２７５，４１０９０２８３）、农业部农业环境重点实验室开放基金项目及中国科学院仪器功能开发项目（Ｙ３２３０１８０１０）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｇｔｄ＠ ｉｓａ．ａｃ．ｃｎ
２０１４⁃ ０７⁃３１收稿，２０１５⁃０４⁃０１接受．
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）０６－１８０７－０７　 中图分类号　 Ｓ１５２．７， Ｓ５１２．１　 文献标识码　 Ａ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｗｉｔｈｉｎ ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ ｒｅｄ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ． ＹＵＡＮ Ｈｏｎｇ⁃ｚｈａｏ１，２， ＷＵ Ｈａｏ２，３， ＧＥ Ｔｉ⁃ｄａ１，２， ＬＩ Ｋｅ⁃ｌｉｎ３，
ＷＵ Ｊｉｎ⁃ｓｈｕｉ１， ＷＡＮＧ Ｊｉｕ⁃ｒｏｎｇ１ （ １Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｏ⁃Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｒｅ⁃
ｇｉｏｎ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２５， Ｃｈｉｎａ；
２Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ
Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，
Ｃｈｉｎａ； ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ
４１０００４， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（６）： １８０７－１８１３．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｉｎｋ ｆｏｒ “ｍｉｓｓｉｎｇ ｃａｒｂｏｎ” ｂｕｔ ａｌｓｏ ｐｌａｙ ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｇａｓｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｎ２Ｏ ａｎｄ ＣＨ４ ． Ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ
ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｇａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ａｒｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ｓｏｉｌ． Ｕｓｉｎｇ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｉｔｅ ｉｎ Ｔａｏｊｉａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｈｉｎａ （ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ １９８６）， ｗｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ （＞２５ ｙｅａｒｓ） ｎｏｎ⁃ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ （ＣＫ）， ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ （ＮＰＫ）， ａｎｄ ＮＰＫ
ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ ｒｅｓｉｄｕｅｓ （ＮＰＫＳ） ｏｎ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｔｈｅ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｓｏｉｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ９ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｈｙｌｏｔｙｐｅｓ，
ｍａｉｎｌｙ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ， Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ， Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ， ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ ｏｆ Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ ａｎｄ Ｅｕ⁃
ｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ， Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ＮＰＫ ａｎｄ ＮＰＫＳ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｂｅｉｎｇ ｇｒｅａｔｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
ＬＵＢＳＨＵＦＦ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｌｓｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｍｉ⁃
ｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ＣＫ⁃， ＮＰＫ⁃ ａｎｄ ＮＰＫＳ⁃ｔｒｅａｔｅｄ ｓｏｉｌｓ． Ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 ６月　 第 ２６卷　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｊｕｎ． ２０１５， ２６（６）： １８０７－１８１３
ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０．５８ × １０１０ ｔｏ １．０６ × １０１０ ｃｏｐｉｅｓ·ｇ－１ ｄｒｙ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｆｒｏｍ
１．１６ × １０６ ｔｏ １．７２ × １０６ ｃｏｐｉｅｓ·ｇ－１ ｄｒｙ ｓｏｉｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｓｏｉｌｓ， ｗｉｔｈ ＮＰＫＳ＞ＮＰＫ． Ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ， ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｐａｄｄｙ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌ； ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ； ｂａｃｔｅｒｉａ； ａｒｃｈａｅａ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．
　 　 减缓大气“温室效应”是全球环境问题中最重
要且亟待解决的问题之一．我国面临极大的 ＣＯ２减
排压力，增加陆地生态系统的“碳汇”功能是重要的
ＣＯ２减排机制之一． ＩＰＣＣ 在 １９９５ 和 ２００７ 年的报告
中，两次提到稻田生态系统是一个重要的碳汇，可能
是消纳“未知碳”的主要场所之一，对减缓大气 ＣＯ２
浓度升高起着不可忽视的作用［１－２］ ．稻田土壤有机碳
变化关键过程与控制机制的研究必将成为全球变化
研究中凸显地球科学表面过程的关键问题．
土壤微生物在全球生态系统功能（如养分运
转、有机质分解、土壤结构维持、温室气体产生［３－４］
等方面）的调节发挥着重要作用．同时，土壤微生物
群落结构和数量受多种因素的影响而发生演变，其
中包括土壤理化性质、植被类型、土壤类型、农田管
理制度等［５－７］ ．特别是不同农田管理方式会对土壤的
物质组成和营养平衡等产生一系列的作用，很可能
会影响到土壤中微生物的多样性、群落组成和数量，
进而对土壤中物质和能量的转化、土壤和肥料中营
养物质的有效性产生影响［８］ ．土壤微生物数量巨大、
种类繁多，传统分离培养的方法遗漏了土壤中绝大
多数微生物，难以反映土壤微生物群落的丰度及其
作用机制［９］ ．因此，土壤微生物多样性及其功能常被
认为是尚未解密的黑箱．２０ 世纪 ９０ 年代后期，随着
ＰＣＲ、ＤＧＧＥ、克隆文库、ＤＮＡ 测序、Ｔ⁃ＲＦＬＰ 和实时
荧光定量 ＰＣＲ（ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ）等为代表的分子生物
技术引入土壤微生物研究中，为研究环境样品中微
生物种群结构和数量分布提供了可能，越来越多的
研究采用这项技术揭示环境微生物群落多样性及丰
度特点［１０］ ．本研究拟采用实时定量 ＰＣＲ、克隆文库
和 ＤＮＡ测序等现代分子生物技术，探讨不同施肥处
理对稻田土壤土壤微生物（细菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ
基因）群落结构和数量的影响，以期揭示土壤微生
物群落结构、多样性及数量特征与农田管理制度的
内在联系，可以为我国稻田土壤科学施肥、稻田固碳
和温室气体减排的共轭双赢作用提供重要的理论
依据．
１　 研究区域与研究方法
１􀆰 １　 研究区概况
湖南省桃江国家级稻田土壤肥力变化长期定位
监测点（２８°２８′ Ｎ，１１１°５４′ Ｅ）试验始于 １９８６ 年，供
试土壤为板页岩发育的潴育性水稻土．定位施肥试
验开始前耕作层（０ ～ ２０ ｃｍ）土壤的基本理化性状：
土壤容重 １．０７ ｇ·ｃｍ－３，有机碳 ２０􀆰 １０ ｇ·ｋｇ－１，全氮
２􀆰 ０１ ｇ· ｋｇ－１，全磷 ０． ６０ ｇ· ｋｇ－１，碱解氮 １５６􀆰 ０
ｍｇ·ｋｇ－１，有效磷 ７．１０ ｍｇ·ｋｇ－１，ｐＨ ６．１．大田试验
详细情况及化肥施用量等参数见文献［１１］．所有处
理均实行早稻⁃晚稻⁃冬作的种植制度，小区按国家
土壤肥力长期定位试验点标准统一设置为 ６６．７ ｍ２，
随机排列未设重复．本研究于 ２０１０ 年 ９ 月（土壤处
于淹水期）采集长期定位施肥试验中的不施肥对照
（ＣＫ）、氮磷钾（ＮＰＫ）和氮磷钾加秸秆还田（ＮＰＫＳ）
３个处理土壤样品．每个大田处理平分成 ３个小区采
样，小区面积为 ２２．２ ｍ２，采用 ５点取样法取（专用的
稻田土采样器）表层 ０ ～ １５ ｃｍ 土壤并混匀．一部分
土壤样品（约 ２００ ｇ）用液氮冷冻后－８０ ℃保存，供分
子生物学研究，另一部分土壤样品供常规分析，土壤
样品的基本理化性状见表 １．
１􀆰 ２　 土壤微生物总 ＤＮＡ的提取
参照 Ｐｏｒｔｅｏｕｓ等［１２］ 的方法 ，采用 ＳＤＳ ⁃ ＧＩＴＣ ⁃
表 １　 不同施肥处理稻田土壤的基本理化性质
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ （ｍｅａｎ±ＳＥ）
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｐＨ 有机碳
Ｓｏｉｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｒｂｏｎ
（ ｇ·ｋｇ－１）
全氮
Ｔｏｔａｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
（ｇ·ｋｇ－１）
碱解氮
Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｎ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
有效磷
Ｏｌｓｅｎ Ｐ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
速效钾
Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｋ
（ｍｇ·ｋｇ－１）
ＣＫ ６．０±０．１ａ ２０．８５±０．３９ｂ １．９９±０．０２ｃ １５５．７６±４．２２ｂ ４．６７±１．０１ｃ ３６．６４±２．４７ｃ
ＮＰＫ ５．９±０．１ａ ２２．０７±０．１３ｂ ２．５４±０．０２ｂ １９８．１７±３．６９ａ １５．０５±０．９９ｂ ４８．４１±２．００ｂ
ＮＰＫＳ ５．６±０．１ｂ ２６．０９±０．５７ａ ２．６２±０．０５ａ ２０５．６４±６．５３ａ １９．４４±０．４０ａ ５８．０５±５．６７ａ
不同小写字母表示处理间差异显著（Ｐ＜０．０５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｍｅａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ ｌｅｖｅｌ ａｍｏｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
８０８１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ＰＥＧ法，并作适当修改．对每个处理 ３个重复土壤样
品分别进行 ＤＮＡ提取，共 ９ 个土壤样品 ＤＮＡ 样品
所提取的土壤总 ＤＮＡ 的浓度和纯度用紫外分光光
度计测定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ， ＰｅｑＬａｂ， Ｇｅｒｍａｎｙ）．
１􀆰 ３　 土壤微生物 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因克隆、测序及多样
性分析
细菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因上游引物 ７９９ ｆ［１３］：
５′⁃ＡＡＣＭＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＫＧ⁃３′，下游引物 １４９２ｒ［１４］：
５′⁃ ＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ⁃３′（上海英骏生物技
术有限公司合成），片段长度为 ７００ ｂｐ左右．
ＰＣＲ反应体系（５０ μＬ）：ＴａｑＤＮＡ聚合酶缓冲液
５．０ μＬ，ＭｇＣｌ２ ２．５ ｍｍｏｌ·Ｌ
－１，ｄＮＴＰｓ ０．２ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，
上游和下游引物各 ０．４ μｍｏｌ·Ｌ－１，ＤＮＡ 模板 ５０ ～
１００ ｎｇ， ＴａｑＤＮＡ 聚合酶 （ ＴａＫａＲａ ） １ Ｕ，超纯水
（ｄｄＨ２Ｏ）补至 ５０ μＬ．ＰＣＲ反应条件：９５ ℃ ５ ｍｉｎ；３５
个循环为 ９５ ℃ ４５ ｓ，５２ ℃ ４５ ｓ，７２ ℃ ６０ ｓ；７２ ℃终
延伸 １０ ｍｉｎ． ＰＣＲ 扩增反应仪：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙ⁃
ｃｌｅｒ．
扩增的 ＰＣＲ产物用 ＰＣＲ纯化试剂盒（ＴａＫａＲａ）
纯化，方法按说明书进行． ＰＣＲ 产物纯化后连接到
ｐＧＥＭ⁃Ｔ载体，构建重组质粒，通过蓝白斑筛选，随
机从每个施肥处理克隆文库中分别挑选 ２００个含有
目的条带大小的阳性克隆子，送至华大基因湖北分
公司测序．
通过 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ软件比较 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列的
相似性，将相似性大于 ９８％的序列归为同一种可操
作分类单元（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ， ＯＴＵ）．将所
得的 ＯＴＵ 序列分别在 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ． ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ ／ Ｂｌａｓｔ． ｃｇｉ）和 ＲＤＰ 数据库（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｒｄｐ． ｃｍｅ．
ｍｓｕ．ｅｄｕ ／ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ⁃ ／ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ．ｊｓｐ）中进行同源性比对．
比对后将获得的土壤微生物 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列提
交至 ＧｅｎＢａｎｋ中（登录号为 ＪＦ７０８５７７～ ＪＦ７０８８６４）．
覆盖率（ｃｏｖｅｒａｇｅ， Ｃ） ［１５］评估所构建的文库对
环境微生物多样性的体现程度，计算公式：Ｃ ＝ １－ｎｌ ／
Ｎ．式中： Ｎ为所分析的克隆总数；ｎｌ为仅有 １个克隆
的操作分类单位数（ＯＴＵ）．采用 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数（Ｈ）
和 Ｅｖｅｎｎｅｓｓ 指数反映基因的多样性［１６］ ． Ｈ ＝
－∑Ｐ ｉ ｌｎＰ ｉ （其中，Ｐ ｉ 为同一种 ＯＴＵ 的克隆数占总
克隆数的比例）．以 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数的计算结果为基
础，Ｐｉｅｌｏｕ 均匀度指数（Ｅ）的算式为：Ｅ ＝ Ｈ ／ Ｈｍａｘ ．其
中，Ｈｍａｘ ＝ ｌｎＳ，Ｓ为不同 ＯＴＵ的种类数．
１􀆰 ４　 ＬＵＢＳＨＵＦＦ分析处理间的差异
利用 ＬＵＢＳＨＵＦＦ 软件（ｈｔｔｐ： ／ ／ ＬＵＢＳＨＵＦＦ．ｍｉｂ．
ｕｇａ．ｅｄｕ ／ ）比较不同施肥处理下细菌和古菌群落组
成是否存在差异［１７］ ．
１􀆰 ５　 土壤细菌和古菌数量测定
采用实时荧光定量（ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ）扩增土壤细
菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因，分别测定细菌和古菌 １６Ｓ
ｒＲＮＡ基因拷贝数．细菌通用引物为 ２７Ｆ ／ １４９２Ｒ，古
菌为 Ａｒ１０９ｆ ／ Ａｒ９１５ｒ．１０ μＬ 反应体系组成：２×ＳＹＢＲ
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ５ μＬ，１０ μｍｏｌ·Ｌ－１上游和下游引物
各 ０．５ μＬ，各浓度梯度的质粒标准样品 ＤＮＡ １ μＬ，
ｄｄＨ２Ｏ ３ μＬ．荧光定量 ＰＣＲ程序：按（ＴａＫａＲａ ）试剂
盒操作说明书进行两步法 ＳＹＢＲ Ｉ 荧光定量 ＰＣＲ扩
增，定量分析土壤细菌和古菌数量．荧光定量实时
ＰＣＲ仪为 ＡＢＩ ７９００（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）．
标准曲线制作：将测序获得的已知种属的阳性
克隆子扩增培养后提取质粒 ＤＮＡ，紫外吸收定量法
（ＯＤ２６０）检测浓度后，将其进行 １０倍梯度稀释，形成
１０４ ～１０１０ ｃｏｐｉｅｓ·μＬ－１，作为 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因的荧光
定量的标准样品．所有样品均 ３ 次重复．以初始模板
ＤＮＡ量的对数为横坐标，以 ＰＣＲ 反应过程中每个
稀释样品的 Ｃ ｔ值为纵坐标，绘制定量的标准曲线．细
菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因的标准曲线分别为 Ｃ ｔ ＝
－３．６６２ｌｇＣ ＋ ４２． ０６８ （ Ｒ２ ＝ ０． ９９５， Ｅ ＝ ０． ８９）， Ｃ ｔ ＝
－３􀆰 １４６ｌｇＣ＋３７．００９（Ｒ２ ＝ ０．９９４，Ｅ ＝ １．０９），扩增效率
在 ０􀆰 ８５～１．１０，满足基因丰度定量试验要求．
土壤细菌和古菌的数量检测：将土壤微生物
ＤＮＡ样品稀释至 ５ ｎｇ·μＬ－１左右作为模板，反应程
序和反应体系同上．
１􀆰 ６　 数据处理
所有测定结果均为 ３ 次重复的平均值，所得数
据采用 Ｅｘｃｅｌ ２００３ 和 ＳＰＳＳ １６．０ 软件进行处理与统
计分析，各处理差异显著性检验采用 Ｄｕｎｃａｎ 法，相
关性分析采用 Ｐｅａｒｓｏｎ 法．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同施肥处理的土壤理化性质
由表 １ 可以看出，长期不同施肥制度导致土壤
理化性质发生了较大分异，与不施肥相比，施肥后土
壤有机质和 Ｎ、Ｐ、Ｋ 等速效养分含量增加，ｐＨ 值降
低．其中，秸秆还田处理的土壤有机质、速效养分含
量均高于不施肥和化肥处理，而 ｐＨ值最低．
２􀆰 ２　 多样性和系统发育分析
通过 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ软件比较序列的相似性，将相似
性大于９８％的序列归为同一种可操作分类单元
９０８１６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 袁红朝等： 长期施肥对稻田土壤细菌、古菌多样性和群落结构的影响　 　 　 　 　 　
表 ２　 稻田中土壤细菌和古菌的群落组成
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ ｉｎ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ
细菌和古菌类群（门）
Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ
ａｒｃｈａｅａ （ｐｈｙｌａ）
比例
Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
（％）
相似序列（编号）∗
Ｍｏｓｔ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）
变形细菌门 Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ２７．７ 红螺菌 Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ ＥＵ１９３０８３） ／伯克氏菌 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＥＵ１９３０４５） ／假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＥＵ１９３０５１） ／
黏球菌 Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＦＪ４１８１２４）
酸杆菌门 Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ １６．１ 酸微菌 Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＡＭ７４９７５６）
绿弯菌门 Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ １３．４ 绿屈 挠 菌 Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ｓｐ． （ ＦＪ４８１３５６ ） ／球 形 杆 菌 Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．
（ＧＱ４２１０２９） ／脱卤拟球菌 Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｓｐ． （ＧＱ１４３７６９）
放线菌门 Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ５．３ 红色杆菌 Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ ＥＵ１９３０８７） ／放线菌 Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＥＵ２７６５４３）
厚壁菌门 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ３．８ 梭菌 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． （ＤＱ１９６６２９）
疣微菌门 Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ３．８ 疣微菌 Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． （ＤＱ０８４３０７）
绿细菌门 Ｃｈｌｏｒｏｂｉ ３．２ 绿菌 Ｃｈｌｏｒｏｂｉ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＡＢ２５２９５０）
芽单胞菌门 Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ ２．４ 芽单胞菌 Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＥＦ１２５９４３）
浮霉菌门 Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ １．２ 浮霉菌 Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （ＡＭ９３４９５７）
泉古菌 Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ １０．２ 泉古菌 Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ （ＤＱ２７８１３７）
广古菌 Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ １２．３ 甲烷微菌 Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ ａｒｃｈａｅｏｎ （ＡＢ２３６１１５） ／ 甲烷八叠球菌 Ｍｅｔｈａｎｏ⁃
ｓａｒｃｉｎａｌｅｓ ａｒｃｈａｅｏｎ （ＤＱ０８４４５２）
不确定 Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ０．６ ／
∗基因库已知的种属细菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因 Ｔｈｅ ｋｎｏｗｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．
（ＯＴＵ）．３种施肥处理共得到 ２９４ 个 ＯＴＵ，其中属于
细菌域的 ＯＴＵ 有 ２３６ 个，分别属于 ９ 个细菌类群
（表 ２）：变形细菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、放线菌
门、厚壁菌门、疣微菌门、绿细菌、芽单胞菌门和浮霉
菌门．它们在克隆文库中所占比例分别为 ２７􀆰 ７％、
１６􀆰 １％、１３􀆰 ４％、５． ３％、３． ８％、３． ８％、３． ２％、２． ４％和
１􀆰 ２％．其余的基因型与已知类群相似性较低，在
ＧｅｎＢａｎｋ数据库中未找到与其相似的已知细菌序
列，尚不能确定分类地位．属于古菌域的 ５８ 个基因
型分别属于泉古菌（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）和广古菌（Ｅｕｒ⁃
ｙａｒｃｈａｅｏｔａ），在克隆文库中的比例为 １０． ２％ 和
１２􀆰 ３％．
　 　 长期施肥使细菌和古菌各类群结构产生了明显
变化（图 １）．与 ＣＫ相比， ＮＰＫ和 ＮＰＫＳ 处理的变形
菌、酸杆菌和泉古菌多样性增加，其中 ＮＰＫＳ 处理最
为明显． ＬＵＢＳＨＵＦＦ 软件统计结果显示，１６Ｓ ｒＲＮＡ
基因克隆文库在 ＣＫ与 ＮＰＫ及 ＮＰＫＳ处理之间存在
显著性差异（Ｐ＜０．０５），说明化肥或者化肥和秸秆联
合施用能够对细菌和古菌群落组成造成显著影响．
　 　 通过 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数反映群落的物种多样性，
Ｅｖｅｎｎｅｓｓ 指数揭示物种的均匀度． Ｓｈａｎｎｏｎ 指数和
Ｅｖｅｎｎｅｓｓ指数均为 ＮＰＫＳ＞ＣＫ＞ＮＰＫ（表 ３）．在 ３种不
同施肥处理的土壤环境中，ＮＰＫＳ 处理土壤的细菌、
古菌多样性指数和均匀度指数最高；而 ＮＰＫ处理的
多样性指数和均匀度指数均最低；ＣＫ 略大于 ＮＰＫ
处理．可能是施 ＮＰＫ后土壤环境的改变使某些微生
物无法生存或是趋同进化，以致与 ＣＫ 相比，土壤微
生物多样性有所下降．而秸秆等外源有机质（包括外
源微生物）的输入，为稻田土壤微生物带来了丰富
的碳源和能源物质，促进了微生物的生长和代谢，使
微生物多样性增加．
２􀆰 ３　 施肥对稻田土壤细菌和古菌数量的影响
用实时荧光定量 ＰＣＲ 对不同处理稻田土壤细
菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因丰度进行分析．从图 ２ 可以
看出，稻田土壤 ３种施肥处理细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因拷
贝数为每克干土 ０．５８×１０１０ ～ １．０６×１０１０个，古菌为每
克干土 １．１６×１０６ ～ １．７２×１０６个．施肥处理土壤（ＮＰＫ
和ＮＰＫＳ ）细菌和古菌数量均高于不施肥处理
图 １　 不同施肥处理土壤细菌和古菌类群在基因文库中所
占比例
Ｆｉｇ．１ 　 Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ ｐｈｙｌｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｌｏｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｓｏｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．
Ⅰ： 泉古菌 Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ； Ⅱ： 广古菌 Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ； Ⅲ： 变形细菌
门 Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ； Ⅳ： 酸杆菌门 Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ⅴ： 绿弯菌门 Ｃｈｌｏ⁃
ｒｏｆｌｅｘｉ； Ⅵ： 放线菌门 Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ； Ⅶ： 厚壁菌门 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ； Ⅷ：
疣微菌门 Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ； Ⅸ： 绿细菌门 Ｃｈｌｏｒｏｂｉ； Ⅹ： 芽单胞菌门
Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ； Ⅺ：浮霉菌门 Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ； Ⅻ：不确定 Ｕｎｃｌａｓ⁃
ｓｉｆｉｅｄ．
０１８１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
表 ３　 不同施肥处理土壤微生物 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因文库的多样性指数
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｉｃｅｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅｓ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
克隆数
Ｃｌｏｎｅｓ
总基因型
Ｔｏｔａｌ
ｇｅｎｏｔｙｐｅ
ＯＴＵｓ
细菌 Ｂａｃｔｅｒｉａ
基因型数
ＯＴＵｓ
覆盖率
Ｃｏｖｅｒａｇｅ
（％）
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｓｈａｎｎｏｎ
ｉｎｄｅｘ
均匀度指数
Ｅｖｅｎｎｅｓｓ
ｉｎｄｅｘ
古菌 Ａｒｃｈａｅａ
基因型数
ＯＴＵｓ
覆盖率
Ｃｏｖｅｒａｇｅ
（％）
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｓｈａｎｎｏｎ
ｉｎｄｅｘ
均匀度指数
Ｅｖｅｎｎｅｓｓ
ｉｎｄｅｘ
ＣＫ ２００ ９５ ８１ ３１．７ ４．２１ ０．９４ １４ ８１．５ １．８８ ０．７１
ＮＰＫ ２００ ９２ ７５ ３８．５ ４．０６ ０．９４ １７ ７６．７ １．７８ ０．６３
ＮＰＫＳ ２００ １０７ ８０ ２９．５ ４．３５ ０．９６ ２７ ６３．７ ２．３５ ０．７２
图 ２　 不同施肥处理土壤细菌（×１０１０， Ａ）和古菌（×１０６， Ｂ）
１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因数量
Ｆｉｇ．２　 Ｂａｃｔｅｒｉａｌ （ × １０１０， Ａ） ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ （ × １０６， Ｂ） １６Ｓ
ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒ⁃
ｅｎｔ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ （ｃｏｐｉｅｓ·ｇ－１ｄｒｙ ｓｏｉｌ） ．
不同小写字母表示处理间差异显著（Ｐ＜０．０５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ
ｍｅａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ ｌｅｖｅｌ ａｍｏｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．
（ＣＫ），其中，ＮＰＫＳ 处理最多，显著高于 ＣＫ 和 ＮＰＫ
处理（Ｐ＜０．０５）．
　 　 利用 ＳＰＳＳ 软件分析了 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因数量与
土壤理化性质的相关性．结果显示，１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因
数量与土壤有机质和氮磷钾养分含量有显著的正相
关关系（Ｒ＝ ０．７８４，Ｐ＜０．０５，ｎ ＝ ９）， 其中与有机质的
关系最为密切（Ｒ＝ ０．８９０， Ｐ＜０．０１），而与土壤 ｐＨ值
有显著的负相关关系（Ｒ＝ －０．６８３，Ｐ＜０．０５）．
３　 讨　 　 论
本文采用克隆文库技术，利用通用引物 ７９９ｆ⁃
１４９２ｒ分析了土壤细菌及古菌系统发育类群，研究
了土壤微生物群落结构及其对不同施肥处理方式的
响应．结果表明，土壤微生物种群多样性高，覆盖了 ９
个细菌类群和 ２个古菌类群，其中变形菌、酸杆菌和
绿弯菌是稻田土壤优势细菌，其次是放线菌，而古菌
域中广古菌是优势古菌．以前研究多集中于单一细
菌域或古菌域，没有同时对两个群落结构进行分析．
如 Ｊａｎｇｉｄ 等［１８］分析了不同类型的耕作土壤细菌种
群结构，发现变形细菌占统治地位，占 ３０． ６％ ～
４３􀆰 ２％；其次是酸杆菌，占 １７． １％ ～ ２６． ２％．而 Ｇｅ
等［１９］研究了长期施肥的农耕土壤细菌多样性，发现
变形细菌（包括 α⁃， β⁃， γ⁃变形细菌）在细菌类群中
占统治地位 （３０． ５％），第二大优势类群是酸杆菌
（１５．３％）．Ｈａｎｓｅｌ等［２０］在不同地带性土壤中也发现
了 ９种主要类型细菌，其中变形菌和酸杆菌分别占
整个克隆文库的 ３９％和 ２０％．本研究发现，除变形菌
和酸杆菌外，绿弯菌在农田土壤中占绝对优势，多样
性高，且包括了大量未知种属．
不同施肥处理导致稻田土壤微生物群落结构和
多样性差异明显．本研究供试的稻田土壤仅农田管
理制度（施肥处理）不同，造成土壤理化性质差异很
大，从而影响土壤微生物群落结构和多样性．但是这
种多样性差异，可能是外界环境条件综合因素共同
作用的结果．施肥后（主要为秸秆还田），土壤有机质
和氮磷钾等养分含量提高，土壤中变形菌大部分类
群为异养或者兼性营养菌，丰富的有机底物和养分
为这部分微生物类群的生长提供了可溶性的营养物
质和能量［２１－２２］，而且施肥后土壤 ｐＨ值下降，为酸杆
菌提供了适宜的生长环境，其多样性和相对丰度增
加．另外，土壤有机质及矿物质颗粒共同参与土壤团
聚体形成，为土壤微生物提供了良好的栖居环境，调
控土壤微生物群落的代谢功能和结构［２３］，导致秸秆
还田后土壤细菌和古菌的多样性增加．相反，单施化
肥（ＮＰＫ）下土壤有机质没有明显增加，化肥的使用
（特别是氮肥）刺激了某一或几类（群）微生物生长，
特别是 β⁃变形菌、γ⁃变形菌和泉古菌的生长［２４］，而
其他类群微生物相对丰度降低，以致与 ＣＫ 相比，土
壤微生物多样性有所下降．
同样，随着土壤肥力及土壤环境状况的不同，土
壤微生物种群数量也会存在某种程度的差别． Ｓｈｅｎ
等［２５］定量了不同施肥处理旱地土壤的细菌丰度（基
因拷贝数为每克干土 １０９ ～ １０１０个），发现长期施用
氮肥的土壤细菌丰度下降．Ｗｕ 等［２６］发现，稻田土壤
１１８１６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 袁红朝等： 长期施肥对稻田土壤细菌、古菌多样性和群落结构的影响　 　 　 　 　 　
细菌丰度较高，基因拷贝数为每克干土 ５×１０９ ～ １×
１０１０个，与本研究中细菌丰度结果（每克干土 ５．８×
１０９ ～１．６×１０１０个）较为一致．而且，施肥后土壤细菌
和古菌数量增加，秸秆还田的细菌和古菌数量最大．
相关性分析显示，农田土壤细菌和古菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ
基因拷贝数与土壤有机碳（ ＳＯＣ）含量呈显著正相
关，而土壤 ＳＯＣ 与全氮（ＴＮ）也呈显著正相关．一般
情况下，水稻土氮磷钾等营养元素和有机质含量较
高，而秸秆还田为微生物的生长和繁衍提供了丰富
的碳源和能源，因此秸秆还田后土壤细菌和古菌数
量高于不施肥和化肥处理．
Ｋｅｍｎｉｔｚ等［２７］用不同的引物定量了德国马尔堡
附近森林土壤细菌（１０９）和古菌（１０８）１６Ｓ ｒＲＮＡ 基
因数量，发现细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因拷贝数远高于古
菌数量，与本研究结果基本一致．究其原因，可能是
细菌和古菌适应生存的生境不同：很多古菌生存在
极端环境中，仅一些古菌是嗜中性的，能够在沼泽、
废水和土壤中生存；而细菌包含多种代谢种类和营
养类型，能够适应更多、更复杂的生态位［２８］ ．因此复
杂环境土壤中的细菌数量远高于古菌．
从以上分析可以发现，长期不同施肥制度导致
稻田土壤理化性状和肥力水平发生显著分异，并对
土壤细菌和古菌群落结构和数量产生了深刻的影
响．其中，单施氮肥后土壤细菌和古菌的多样性下
降，而秸秆还田处理的土壤细菌和古菌多样性及数
量最高．本研究结果对深入理解稻田土壤碳氮循环
过程具有重要意义．
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涛）， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ
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［１２］　 Ｐｏｒｔｅｏｕｓ ＬＡ， Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＪＬ， Ｓｅｉｄｌｅｒ ＲＪ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｆｆｅｃ⁃
ｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ
ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｆｉｎ⁃
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ｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｐｏｎ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ａｇｒｉ⁃
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２１８１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ｒｅｇｉｍｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉ⁃
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Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２０１３， ３７： １１２－１２９
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Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｆａｒｍｉｎｇ ｏｎ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｔ ｄｉｆｆｅ⁃
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ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａｌ ａｍｍｏｎｉａ ｏｘｉｄｉｚｅｒｓ ｔｏ ｓｏｉｌ ｏｒｇａｎｉｃ
ａｎｄ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｏｉｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ， ２０１０， ４５： １９３－２００
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ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ． Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｓｏｉｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ， ２０１０， ４６： １１９－１２４
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ｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌ． Ｂｉｏｌｏ⁃
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ｎａｒｃｈａｅｏｔａ ｉｎ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ａｃｉｄｉｃ ｆｏｒｅｓｔ ｓｏｉｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉ⁃
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏｇｙ， ２００７， ６０： ４４２－４４８
［２８］　 Ｅｌｌｅｇａａｒｄ ＫＭ， Ｋｌａｓｓｏｎ Ｌ， Ｎäｓｌｕｎｄ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａ⁃
ｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｗｏｌｂａｃｈｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ
ｃｏｎｃｅｐｔ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１３， ９： ｅ１００３３８１
作者简介　 袁红朝，女，１９８１年生，博士，助理研究员．主要从
事微生物生态学研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｍａｉｌｘｚ＠ １６３．ｃｏｍ
责任编辑　 肖　 红
３１８１６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 袁红朝等： 长期施肥对稻田土壤细菌、古菌多样性和群落结构的影响