全 文 ：基于 PLFA指纹图谱表征浓香型酒糟醅
微生物群落结构*
刘琨毅1 摇 陈摇 帅1 摇 郑摇 佳1 摇 黄摇 钧1 摇 张宿义3 摇 易摇 彬3 摇 周荣清1,2,3**
( 1四川大学轻纺与食品学院, 成都 610065; 2四川大学制革清洁技术国家工程实验室, 成都 610065; 3国家固态酿造工程技术
研究中心, 四川泸州 646000)
摘摇 要摇 以 9 株白酒酿造过程中常见的菌株为对象,研究了不同种属菌株的细胞膜特征组分
磷酸脂肪酸(PLFA)的特征,以及检出量与菌株生物量之间的关系.结果表明:供试细菌、放线
菌、霉菌和酵母菌的 PLFA指纹图谱存在显著差异,各菌株的 PLFA指纹图谱可作为区别种属
的依据.不同供试菌株生物量在一定范围内与检出的总 PLFA 量或 16:0 含量呈线性关系.将
不同生物量的革兰氏阳性菌 G+、革兰氏阴性菌 G-和真菌分别加入糟醅后,检出的 PLFA相对
含量与对照差异显著.基于 PLFA的指纹图谱能够定量或半定量地表征糟醅微生物群落结构
特征及动态变化.经对多家酿酒企业糟醅 PLFA组成的检测及微生物群落结构的剖析,该方法
具有普适性.
关键词摇 磷脂脂肪酸摇 糟醅摇 微生物群落
文章编号摇 1001-9332(2012)06-1620-09摇 中图分类号摇 Q547; TS261. 1摇 文献标识码摇 A
Microbial community structure in strong aromatic liquor fermented grains characterized by
PLFA fingerprints. LIU Kun鄄yi1, CHEN Shuai1, ZHENG Jia1, HUANG Jun1, ZHANG Su鄄yi3, YI
Bin3, ZHOU Rong鄄qing1,2,3 (1College of Light Industry, Textile & Food Engineering, Sichuan Univer鄄
sity, Chengdu 610065, China; 2National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather
Manufacture, Chengdu 610065, China; 3National Engineering Research Center of Solid鄄State Brew鄄
ing, Luzhou 646000, Sichuan, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(6): 1620-1628.
Abstract: Taking the nine common microbial strains in liquor鄄making process as test objects, this
paper studied the characteristics of phospholipid fatty acid (PLFA), a characteristic component of
the strains cell membrane, and the relationships between the detected amount of PLFA and the bio鄄
mass of the strains. There existed significant differences in the PLFA fingerprints between test bac鄄
teria, actinomycetes, molds, and yeasts, and the PLFA fingerprint of each strain could be used as
the basis to distinguish species and genus. Within a certain range of the strains biomass, the detec鄄
ted amount of total PLFA or 16:0 was linearly correlated with the biomass. After adding different
biomass Gram positive ( G+ ) bacteria, Gram negative ( G- ) bacteria, and fungi in fermented
grains, a significant difference was observed in the relative amount of PLFA between experimental
and control samples. It was suggested that the fingerprint of PLFA could quantitatively or semi鄄
quantitatively characterize the microbial community structure and its dynamic variation in fermented
grains. By detecting the PLFA profiles of fermented grains in various liquor industries and by analy鄄
zing the microbial community structure in the fermented grains, it was substantiated that PLFA fin鄄
gerprinting was of general applicability.
Key words: phospholipid fatty acid; fermented grain; microbial community.
*国家自然科学基金项目(31171742)和四川省重大科技攻关项目
(09ZC0735)资助.
**通讯作者. E鄄mail: rqzhou@ 163. com
2011鄄09鄄14 收稿,2012鄄04鄄09 接受.
摇 摇 由于栖息在环境中的大部分微生物(90% ~ 99% )都处于存活而不可培养的状态[1],因此采用
可培养法剖析微生物的群落结构获得的信息缺乏真
实性和整体性[2] .以 PCR技术为核心的现代分子生
物学方法及 Biolog 法[3-4]等免培方法能有效克服群
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 6 月摇 第 23 卷摇 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jun. 2012,23(6): 1620-1628
落中各种微生物生长速度非均匀、受营养条件限制
等因素的影响,能较客观地揭示其群落特征. 但是,
由于 PCR扩增受到引物特异性、DNA 提取条件[5-6]
以及微生物群落结构复杂等因素的影响, Biolog 法
仅能粗略反映群落结构特征及动态变迁规律,所以
两种方法都难以全面剖析生境中微生物的群落结构
特征及动态变迁规律.
磷脂脂肪酸(phospholipids fatty acid, PLFA)是
微生物细胞膜的主要组成部分,仅存在活细胞中,细
胞死亡后,则被迅速降解.所以常作为微生物多样性
生物标记来探讨不同生境中微生物群落结构组成及
其变化规律.同时,PLFA 的组成特征也因环境条件
的改变呈现出显著的变化[7-9] . 因此,PLFA 指纹图
谱法被广泛用于表征诸如活体[10]、土壤[11-18]和堆
肥[19]的微生物群落结构变化,是一种有效的免培生
物化学方法[20-21] . 中国白酒的酿造历史悠久,且在
浓香型白酒长期不间断的生产中形成了特有的“千
年老窖,万年糟冶现象,窖池内高酸度、高乙醇浓度
的特殊微生态环境不仅赋予了微生物生理生化的特
殊性,而且使微生物群落结构具有特异性.以酿酒过
程中常见菌株的纯培养物为内标,比较检出的特征
PLFA种类及含量与其生物量之间的关系,解决了
属间群落特征 PLFA 重叠的影响,并能客观地表征
主要功能菌的相对生物量,为探究白酒酿造微生物
群落结构特征提供了一种可以借鉴的方法.
本文以白酒酿造过程中常见微生物菌株为对
象,解析了其 PLFA 组成特征,探讨了 PLFA 含量与
菌体生物量的相关性. 同时探讨了待研究对象加入
纯培养菌株(微生物内标)后,其 PLFA 生化指纹图
谱的变化特征,通过主成分分析(PCA)揭示其变化
规律,并通过剖析不同区域与生产工艺的糟醅的
PLFA组成,佐证了该法在白酒糟醅中应用的普
适性.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
1郾 1郾 1 微生物菌株 摇 细菌:丙酮丁醇棱状芽孢杆菌
(Clostridium acetobytylicum) SICC1. 13,中国工业微
生物菌保藏管理中心四川站;植物乳酸杆菌(Lacto鄄
bacillus planetarium)沪 1. 08,上海市酿造科学研究
所;恶臭醋酸杆菌(Acetobacter rancens)AS1. 41,中国
工业微生物菌保藏管理中心天津站;大肠杆菌
(Escherichia coli)DH5琢,四川省微生物资源保藏中
心;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC20633,中国
工业微生物菌保藏管理中心.
放线菌:细黄链霉菌 ( Actinomyces microflavus)
5406,本研究室保藏菌株.
真菌:米根霉(Rhizopus oryzae) M11,本研究室
保藏菌株;米曲霉(Aspergillus oryzae) AS3. 042,中国
普通微生物保藏管理中心. 酵母菌:异常毕赤酵母
(Pichia anomala)SICC3398,中国工业微生物菌保藏
管理中心四川站;酿酒酵母( Saccharomyces cerevisi鄄
ae)CICC31482,中国工业微生物菌保藏管理中心四
川站.
1郾 1郾 2 培养基 摇 高氏一号培养基;乙酸钠培养基;
MRS培养基;LB 培养基;醋酸菌培养基;牛肉膏蛋
白胨培养基;麦芽汁培养基;YPD培养基[22] .
1郾 1郾 3 仪器与试剂 摇 高速冷冻离心机 TGL16M(湘
麓离心机);SW鄄CJ鄄2FD 型超净工作台(苏州净化设
备有限公司);光学显微镜 CX鄄31(Olympus,日本);
电热恒温培养箱 DHP鄄9162(上海一恒实验仪器有限
公司);气鄄质联用仪 Trace GC Ultra DSQ域(Thermo,
美国);氮气吹扫仪 MD200(杭州奥盛仪器有限公
司);硅胶层析小柱 3 mL鄄250 mg (Hardwee,德国).
定性标准品:37 种脂肪酸甲酯 ( FAME C4 ~
C24), Accustandard,美国;定量标准品:正十九酸甲
酯(190), Accustandard,美国;其他有机试剂均为国
产色谱纯.
1郾 1郾 4 样品采集摇 糟醅样品分别采自泸州老窖股份
有限公司、剑南春股份有限公司和四川全兴股份有
限公司的窖池,窖池窖龄均为 20 a. 窖池取样方法:
从出窖池不超过 1 h的糟醅堆四角及顶面中心分别
取 500 g糟醅,混合均匀,等分为 3 份,各取 100 g待
测.所有的样品均在 24 h内完成预处理.
1郾 2摇 试验方法
1郾 2郾 1 微生物培养摇 SICC1. 13: 采用乙酸钠培养基,
(37依1) 益,厌氧培养 120 h;沪 1. 08: 采用 MRS培养
基,(37依1) 益,培养 48 h;DH5琢: 采用 LB 培养基,
(37依1) 益,培养 48 h;AS1. 41: 采用醋酸菌培养基,
(37依1) 益,培养 48 h;CICC20633: 采用牛肉膏蛋白
胨培养基, (37 依 1) 益,培养 48 h; SICC3398 和
CICC31482:采用YPD培养基,(28依1) 益,培养48 h.
5406:采用有玻璃纸的高氏一号培养基,(28 依
1) 益,培养 72 h;M11: 采用有玻璃纸的麦芽汁培养
基,(28依1) 益,培养 48 h;AS3. 042: 采用有玻璃纸
的麦芽汁培养基,(28依1) 益,培养 48 h.
按上述条件对细菌(SICC1. 13、沪 1. 08、DH5琢、
AS1. 41 和 CICC20633 ) 和酵母菌 ( SICC3398 和
12616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘琨毅等: 基于 PLFA指纹图谱表征浓香型酒糟醅微生物群落结构摇 摇 摇 摇 摇
CICC31482)培养至对数初期计数后制备成不同细
胞浓度的纯种微生物. 将培养后覆盖于玻璃纸上的
放线菌(5406)和霉菌(M11 和 AS3. 042)菌丝体剥
离称量,制备成不同生物量的纯种微生物样品.
1郾 2郾 2 微生物纯培养物及糟醅的预处理
1) 微生物纯培养物的预处理:准确吸取
SICC1郾 13、沪 1郾 08、DH5琢、CICC20633、SICC3398 和
CICC31482 菌悬液,10000 r·min-1冷冻离心(4 益)
10 min,倾去上清液,收集菌团,并用柠檬酸缓冲液
(0. 1 mol·L-1,pH 4郾 0)洗涤 2 次后备用.准确称取
5406、M11 和 AS3郾 042 菌丝体,用 10 mL 柠檬酸缓
冲液 ( 0郾 1 mol · L-1, pH 4郾 0 ) 洗涤 3 次, 10000
r·min-1冷冻离心(4 益)10 min,收集菌团备用.
2)糟醅的预处理:分别准确称取 6 份 5. 0 g 样
品 (糟醅 ), 加入 30 mL 柠檬酸缓冲液 ( 0郾 1
mol·L-1,pH 4. 0),振荡 10 min 后经 4 层纱布过滤,
取其滤清液冷冻低速离心(4 益,2500 r·min-1)15
min,取上清液,10000 r·min-1冷冻离心(4 益)10
min,倾去上清液,收集菌团.柠檬酸缓冲液重复洗涤
3 次后,在其中 5 份样品中分别加入已知浓度 /生物
量的菌团用于表征外加微生物对其 PLFA的影响,另
一份则用于测定其糟醅中 PLFA含量及组成特征.
1郾 2郾 3 PLFA的测定方法摇 PLFA 的提取方法参考文
献[23]. 经配备毛细管柱( TR鄄5MS, 30. 0 m 伊320
滋m伊0. 25 滋m)的 Trace GC Ultra DSQ域检测 FAME
样品. 操作条件:进样口温度 250 益,进样量 0. 5
滋L,分流比 10 颐 1;载气(He)流速 1 mL·min-1;起
始柱温 150 益,保持 3 min;再以 5 益·min-1升至
200 益,保持 10 min;质谱(EI)的电子强度 70 eV;离
子源温度 230 益;扫描范围 35 ~ 400 amu.
1郾 3摇 基于 PLFA 菌株特征及糟醅微生物菌落特征
分析
1郾 3郾 1 PLFA的定性与定量 摇 通过待测样品各组分
质谱图与 NIST 05 标准谱库比对,以及保留时间与
37 种 FAME标准品的保留时间比较,确定其 PLFA
组分;以 19:0 为内标,采用内标法计算各组分的含
量,纯培养的微生物 PLFA 含量用 nmol·mL-1或
nmol·g-1DM 表示,加入微生物纯培养物的糟醅的
PLFA含量则用 nmol·g-1DM表示.
1郾 3郾 2 PLFA 的命名 摇 参考 Frostag覽rd 等[24]的命名
方法,PLFA 的通式用 X:Y棕Z 表示,其中 X 代表脂
肪酸甲酯主链上的总碳原子数,Y 表示含不饱和双
键的数目,棕代表含有双键,Z代表双键距甲基末端
的位置. 前缀 i( iso)表示 PLFA 中含有异构甲基支
链(距甲基末端的第 2 个碳原子),a(anteiso) 表示
PLFA中含有反异构甲基支链(距甲基末端的第 3
个碳原子),cy代表环丙基, OH 前的字母表示羟基
的位置,10Me表示在距甲基末端第 10 个碳原子位
置上含有一甲基. 参考 Zelles 等[25]、Bardgett 等[26]
和 Kieft 等[27]的研究, i13:0、a14:0、 i15:0、a15:0、
a16:0 和 i16:0 等代表革兰氏阳性菌;琢鄄OH鄄10:0、
茁鄄OH鄄10:0、16:1棕5c、16:1棕7c、16:1棕9、cy17:0 和
18:1棕6 代表革兰氏阴性菌;18:3棕6,9,12、18:2棕6,9
和 18:l棕9 代表真菌;10Mel6:0 和 10Mel8:0 代表放
线菌;18:1棕6、18:1棕9、16:1棕5c 和 16:1棕7c 代表好
氧菌; cy19:0、14:0、 i14:0、 a15:0、 i15:0、15:0 和
i16:0 代表厌氧菌.
1郾 4摇 数据处理
采用 SPSS 17郾 0 软件对 PLFA 标记进行方差分
析和主成分分析(PCA).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 不同纯培养微生物菌株的 PLFA 指纹图谱及
与生物量的相关性
对 9 株菌株 PLFA的检测结果表明,SICC1郾 13、
沪 1. 08、 AS1. 41、 DH5琢、 CICC20633、 SICC3398 和
CICC31482 的检测限均大于 105 cfu, 5406、 M11、
AS3郾 042的检测限则分别大于 1、10 和 1 nmol·mL-1 .
5406中检出 C8 ~ C20 PLFA 16种,其中,直链饱和脂肪
酸(SATFA)5种、支链饱和脂肪酸(BRFA)8 种、单不
饱和脂肪酸(MUFA)2 种和 1 种环丙烷脂肪酸(CY鄄
CLO)(图 1A).检出 PLFA的总量及 16:0 与 5406 的
生物量呈正相关,但后者是非线性的. i13:0、a14:0、
i15:0 和 a16:0 也与其生物量呈正相关,但非线性
(图 2A). SICC1. 13 中检出 C8 ~ C20 PLFA 8 种,其
中,SATFA 4 种、BRFA 3 种和 MUFA 1 种(图 1B).
当菌体数量低于 107 cfu 时,所检测到总 PLFA 及含
量较大的 a14:0、16:0 和 18:0 3 种 PLFA 均未随菌
体浓度增加而显著增加(图 2B);当菌体浓度增加到
108cfu时,其含量稍有增加;而增加到 109 cfu 时,其
含量显著增加,尤其是 a14:0 和 i15:0 增幅较大.沪
1郾 08 菌体中检出 C8 ~ C20 PLFA 11 种,其中,SATFA
4 种、 BRFA 3 种、MUFA 3 种和 CYCLO 1 种 (图
1C).其菌体浓度与表征生物量的总 PLFA 及 16:0
类似 SICC1郾 13 的规律,但表征其 G+的 a14:0 和
i15:0 没有随其浓度增加而增大(图 2C).在相同菌
体量 ( 107 cfu ) 的革兰氏阳性菌 SICC1郾 13 和沪
1郾 0 8中检出的特征 PLFA组分 (a14:0和 i 1 5 :0 )
2261 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
图 1摇 不同种属菌株纯培养物的 PLFA特征图谱
Fig. 1摇 Typical fingerprint of PLFA in different pure cultured microbes.
A: 5406; B: SICC1. 13; C: 沪 1. 08; D: DH5琢; E: AS1. 41; F: M11; G: AS3. 042; H: SICC3398; I: CICC 31482. 下同 The same below. 1) i13:0;
2) 14:0; 3) 15:0; 4) 10Me16:0; 5) 2鄄OH鄄15:0; 6) i15:0; 7) 16:1棕9; 8)16:0; 9)i16:0; 10)a16:0; 11) cy17:0; 12)17:0; 13)i17:0; 14) 18:3棕6,
9,12; 15) 18:2棕6,9; 16) 18:1棕6; 17) 18:1棕9; 18)18:0; 19) cy19:0.
分别是总 PLFA 的 4郾 62%和 4郾 08% . 前者的 a14:0
含量高达 3郾 08% ,较后者的 a14:0 (2郾 04% ) 高.
DH5琢菌体中检出 C8 ~ C20 PLFA 10 种,其中,SAT鄄
FA 4 种、 BRFA 1 种、 MUFA 3 种、羟基脂肪酸
(PLOH) 1 种和 CYCLO 1 种(图 1D).当菌体浓度小
于 107cfu 时,检出的总 PLFA、16:0 和表征其 G-特
征的 3 种组分(16:1棕9、cy17:0 和 18:1棕6)无显著
变化;浓度增加到 109cfu时,总 PLFA和 16:0 的量显
著增加,但特征性组分仅稍有增加(图 2D). AS1. 41
菌体中共检出 C8 ~ C20 PLFA 9 种,其中,SATFA 4
种、BRFA 1 种、MUFA 2 种和 PLOH 2 种(图 1E).当
菌体浓度小于 107cfu 时,检出的总 PLFA、16:0 和表
征其 G-特征的 2 种组分(16:1棕9和 18:1棕6)无显著
变化;增加到 109 cfu 时,总 PLFA、16:0 及 18:1棕6
的量显著增加, 而组分 16:1棕9 未检出变化 (图
2D).当革兰氏阴性菌菌体量为 107 cfu 时,DH5琢 检
出了 3 种特征 PLFA(16:1棕9、cy17:0和 18:1棕6),三
者都为总 PLFA的 2. 44% ;AS1. 41 仅检出 2 种特征
PLFA(16:1棕9 和18:1棕6),为总 PLFA的 7. 25% ,其
中组分 18:1棕6 的摩尔百分率较高(5. 80% ).
M11 中检出了 C8 ~ C20 PLFA 10 种,其中,SAT鄄
FA 4 种、BRFA 1 种、MUFA 3 种和 PUFA 2 种(图
1F).当菌体量低于 252 mg DM时,表征生物量的总
PLFA及 16:0 均随其生物量呈递增趋势,总 PLFA
的量随其生物量增加呈拟线性;菌体量高于
252 mg DM时反而下降. 表征其真菌特征的组分
18:2棕6,9、18:3棕6,9,12 和 18:1棕9 也呈类似的规
律(图 2F). AS3. 042 中检出 C8 ~ C20PLFA 11 种,其
中,SATFA 4 种、BRFA 1 种、MUFA 3 种、PUFA 1 种
和 CYCLO2 种(图 1G). 在菌体量小于 75 mg DM
时,总 PLFA 及 16:0 和表征其真菌特征的组分
18:2棕6,9和 18:1棕9 均随菌体量的增大呈渐增的趋
势;但当菌体量继续增加,总 PLFA、16:0 及其特征
组分则保持稳定(图 2G). 两种酵母菌 SICC3398 和
CICC31482 中检出的 C8 ~ C20 PLFA 均为 9 种,其
中,SATFA 4 种、BRFA 2 种、MUFA 2 种和 PUFA1 种
(图 1H 和 I) . 总 PLFA、16:0 及特征性的 PLFA
(18:2棕6,9和 18:1棕9)均呈现相同的变化规律,即
菌体量小于 108 cfu 时,PLFA的量基本不变;而浓度
增加到 109 cfu时,总 PLFA 和 16:0 显著增加,而特
征性的 PLFA(18:2棕6,9和 18:1棕9)增幅较小(图 2H
和 I) .在供试的4株真菌菌株中,从10 mg DM M11
32616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘琨毅等: 基于 PLFA指纹图谱表征浓香型酒糟醅微生物群落结构摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 不同种属菌株纯培养物生物量与 PLFA的关系
Fig. 2摇 Relationship between the biomass and PLFA in different pure cultured microbes.
菌丝中检出表征真菌的 3种特征性 PLFA(18:3棕6,9,
12、18:2棕6,9 和 18:1棕9),分别为检出总 PLFA 的
10. 90% 、 40. 29% 和 21. 70% . 而在 1 mg DM
As 3. 042菌丝中仅检出 2种特征的 PLFA,(18:2棕6,9
和 18:1棕9),分别是总 PLFA的48. 53%和24. 43% .两
株酵母菌在 107 cfu 时也仅检出18:2棕6,9和18:1棕9
的 PLFA,SICC的这两种特征 PLFA都为总 PLFA的
2. 16% ,而 CICC 则分别是总 PLFA 的 2郾 22% 和
2. 96% .
不同属间可培养菌株细胞的 PLFA 种类及含量
存在着显著差异,生理生化特征不同的菌株的 PLFA
也存在差别.图 2 表明,在一定范围内,某一菌株不
仅检出的总 PLFA及16:0的量与其生物量的关系是
单调增加,且特定 PLFA 也随生物量变化有类似的
关系.采用微生物内标法不仅有益于辨认其群落结
构特征,也可通过特征 PLFA 的含量与生物量的对
应关系,评估群落生物量的比例特征.
2郾 2摇 不同菌株培养物添加对待测样品 PLFA 图谱
特征的影响
分别加入纯培养的 SICC1. 13、 CICC20633、
DH5琢、SICC3398 和 CICC31482 菌体到糟醅中,其菌
体数分别为 8. 50伊108、2. 90伊109、3. 80伊108、3. 10伊
108和 3. 35伊108 cfu·g-1 DM.糟醅中检出了 C8 ~ C20
PLFA 14 种,其中 SATFA 4 种、BRFA 6 种、MUFA 2
种、PUFA 1 种和 CYCLO 1 种. 方差分析表明,添加
CICC20633、DH5琢、SICC3398 和 CICC31482 前后的
糟醅表征微生物的特征 PLFA 有显著差异;添加
SICC1. 13 的糟醅与对照样之间 i13:0 和 i15:0 有显
著差异,而 a14:0、i16:0 和 a16:0 差异不显著.添加
革兰氏阳性菌 ( G+ ) 后,代表 G+ 的 PLFA 组分
(i13:0、a14:0、i15:0、i16:0 和 a16:0)均有不同程度
的增加(表 1),在添加 SICC1. 13 的糟醅中,i13:0、
a14:0、i15:0、i16:0 和 a16:0 分别增加了 17、21、26、
27 和 9 倍;在添加 CICC20633 的糟醅中, i15:0、
i16:0、a16:0、i16:0 和 a16:0 分别增加了 15、157、
15、239 和 118 倍.添加革兰氏阴性菌(G-)DH5琢 的
样品中检出 C8 ~ C20 PLFA 15 种(SATFA 4 种、BRFA
6 种、MUFA 2 种、CYCLO 2 种和 PUFA 1 种),较对
照的含量均有所增加(表 1),尤其是代表 G-的特征
组分18:1棕6增加了20倍,且检出了cy17:0这个代
4261 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
表 1摇 加入微生物内标前后糟醅中各特征 PLFA标记含量
Table 1摇 Content of PLFA in adding microbes in fermented grains and the blank sample
组分
Component
革兰氏阳性(G+)
Gram positive bacteria
(nmol·g-1 DM)
SICC1. 13 CICC20633 空白 Blank
革兰氏阴性(G-)
Gram negative bacteria
(nmol·g-1 DM)
DH5琢 空白 Blank
真菌
Fungi
(nmol·g-1 DM)
SICC3398 CICC31482 空白 Blank
i13:0 0. 36依0. 04b 0. 32依0. 15b 0. 02依0. 01a
a14:0 2. 40依0. 24a 17. 40依9. 61b 0. 11依0. 02a
i15:0 2. 93依0. 32b 1. 78依0. 89b 0. 11依0. 03a
i16:0 0. 85依0. 09a 7. 21依4. 19b 0. 03依0. 01a
a16:0 0. 61依0. 08a 7. 15依4. 03b 0. 06依0. 02a
cy17:0 1. 86依0. 32b 0. 00依0. 00a
18:1棕6 0. 64依0. 06b 0. 03依0. 01a
18:1棕9 22. 07依0. 36b 19. 58依6. 98b 0. 60依0. 12a
18:2棕6,9 35. 97依1. 09b 29. 02依10. 21b 0. 24依0. 03a
每一大类微生物之间相同小写字母表示差异不显著(P<0. 05) The data in the same column with the same letter indicated no significance in each mi鄄
crobe at 0. 05 level.
表 G-的特征组分.同时在加入酵母菌的两个样品中
也检测出相同种类的 PLFA,且较对照有不同程度的
增加(表 1),添加 SICC3398 的样品中,代表真菌的
2 种特征 PLFA(18:1棕9 和 18:2棕6,9)的含量分别
增加了 36 和 149 倍,而添加 CICC31482 的样品中,
18:1棕9和 18:2棕6,9 分别增加了 32 和 120 倍.表明
种群的变化对样品特征 PLFA 指纹图谱的影响显
著, PLFA指纹图谱可快捷、准确地表征特殊环境中
微生物群落结构特征的变化.
2郾 3摇 菌株纯培养物添加到糟醅的 PLFA主成分分析
主成分分析表明(图 3),15 种 PLFA 可分为主
成分 1(PC1)和主成分 2(PC2)2 种类型. PC1 对加
入微生物糟醅的微生物群落结构组成的贡献率分别
为 67. 79% 、66. 78% 、64. 00% 、54. 81%和 67. 09% ,
贡献度最大.添加 SICC1. 13 菌株待测样品 PLFA 相
对分散, SICC3398 情况类似. SICC3398、DH5琢 和
CICC31482则集中于PC1轴 . 表明单一菌株变化对
图 3摇 加入微生物内标后的 PLFA载荷图
Fig. 3摇 Loading plots of PLFA of adding microbes in fermented
grains.
玉: SICC1郾 13; 域: SICC3398; 芋: DH5琢; 郁: CICC 20633; 吁:
CICC31482.
糟醅中用于表征微生物群落结构的生物量和组成特
征有显著的影响.
摇 摇 加入 SICC1. 13 的糟醅的 PC1 中集中了除
cy17:0 外的所有检测到的 PLFA,其中i13:0、a14:0、
i15:0、i16:0 和 a16:0 等组分在 PC1 中有较高的载
荷值,表明革兰氏阳性菌中这些 PLFA 易随群落结
构变化而变化.添加 CICC20633 后的糟醅的 PC1 中
集中了除 18: 0 外的所有检测到的 PLFA,其中
i13:0、a14:0、i15:0、i16:0 和 a16:0 等组分也在 PC1
中有较高的载荷值.加入 DH5琢 的糟醅的 PC1 主要
集中了所有检测到的 PLFA,18:1棕6 在 PC2 中有较
高的载荷值. 加入 SICC3398 的糟醅的 PC1 中集中
了所有检测到的 PLFA. CICC31482 的糟醅的 PC1
中集中了所有检测到的 PLFA,其中 18:1棕9 和
18:2棕6,9在 PC1 中有较高的载荷值,表明真菌中这
些 PLFA易随群落结构变化而变化.
2郾 4摇 不同企业糟醅 PLFA的指纹图谱
剑南春股份有限公司窖池的糟醅中共检出
C8 ~ C20 PLFA 23 种(SATFA 3 种、BRFA 11 种、MU鄄
FA 6 种、CYCLO 1 种和 PLOH 2 种),全兴股份有限
公司窖池的糟醅中共检出 C8 ~ C20 PLFA 25 种
(SATFA 4 种、BRFA 12 种、MUFA 6 种、CYCLO 1 种
和 PLOH 2种),较剑南春的糟醅中多检出 2 种 PLFA
(a9:0和 10:0);而泸州老窖股份有限公司窖池较其
他两酒厂窖池的糟醅多检出 18:1棕6、15:0、17:0和
9Me14:0 这 4 种 PLFA,与全兴的糟醅相比,未检出
a9:0、10:0、8:0、i9:0、琢鄄OH鄄10:0、br10:0、茁鄄OH鄄10:0、
i14: 0、 a15: 0、 br10: 0、 a15: 0、 16: 1棕11、 16:1棕9、
18:2棕8,11和 18:1棕8 这 15 种 PLFA,其余 PLFA 的
含量除i16:0外都低于全兴. 比较相似生产工艺的
52616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘琨毅等: 基于 PLFA指纹图谱表征浓香型酒糟醅微生物群落结构摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 不同企业糟醅 PLFA的特征图谱
Fig. 4摇 Typical fingerprint of PLFA in different companies爷 fer鄄
mented grains.
玉:剑南春 Jiannanchun;域:全兴 Quanxing; 芋:泸州老窖 Luzhou laojiao.
同类型检测对象 PLFA指纹图谱,结果表明,研究对
象的环境条件及生理条件等对样品的 PLFA 指纹图
谱有较大的影响,所以 PLFA 指纹图谱法可用于研
究环境及工艺条件等胁迫作用对微生物群落结构的
影响.
3摇 讨摇 摇 论
有研究者将 10Mel6:0 和 10Mel8:0 作为放线
菌的特征 PLFA, 而 在 5406 菌 株 中 仅 检 出 了
10Mel6:0[25-27] .类似的现象在细菌纯培养物中也观
察到.由此可见,采用特定环境中常见菌株作为微生
物内标,有益于提高利用特征 PLFA 辨析特殊环境
中微生物群落结构特征及变化的准确性.
目前在酿酒及传统酿造领域中,采用 PLFA 指
纹图谱法研究微生物群落结构特征的报道较少[23],
且环境条件极端,所以利用微生物内标研究检测对
象特征 PLFA的影响规律.结果表明,该方法适用于
剖析微生物群落结构的特征,且可借助转换的相对
关系,认识其生物量的特征. 郑佳等[23]利用 PLFA
指纹图谱法剖析浓香型白酒窖池糟醅微生物群落结
构特征随窖龄变化的研究结果也证明了 PLFA 指纹
图谱法的实用性.
在糟醅中添加 SICC1. 13、 CICC20633、DH5琢、
SICC3398 和 CICC31482 等功能性微生物后,其 PL鄄
FA组成结构与特征变化,以及基于 PCA 的微生物
菌落结构特征变化都可用 PLFA 指纹图谱进行表
征.说明 PLFA指纹图谱法是研究浓香型窖池糟醅
微生物群落结构与变化规律的一种灵敏、快捷的方
法.在土壤微生物群落结构特征的研究中,基于 PL鄄
FA指纹图谱揭示胁迫条件对菌落结构的影响,比群
落水平生理概况(CLPP)或 PCR 更为有效[28] . 比较
3 种浓香型白酒窖池糟醅中微生物的 PLFA 组成特
点,结果表明,PLFA指纹图谱法对剖析窖泥微生物
群落结构有重要的指导意义,采用该方法能有效的
揭示其时空特性.在各种免培技术中,PCR鄄DGGE 或
PCR鄄SSCP等 PCR技术在研究其遗传多样性方面是
一种有效的方法,但是受到电泳技术和引物等客观
条件的限制,其重现性和准确性尚待完善,且不能将
其转换为生物量信息[5-6] .而实时 PCR 方法对检测
设备和条件的要求非常高,且不能从同一样品中获
得各种微生物群落结构特征的信息[29] . 张文学
等[30-31]和潘响亮等[32]通过 PCR对浓香型白酒窖池
糟醅微生物群落结构的分析发现,糟醅中存在 11 个
以上主要的细菌属和 9 个真菌分类属,依然难以揭
示其酿酒微生物群落结构的真实面貌. 而诸如荧光
原位杂交(FISH) [6]等核酸杂交技术受到探针、染料
及杂质等因素的限制,尚未在该领域中应用.在生物
指纹图谱技术中,PLFA 指纹图谱技术具有属的特
异性,特定的磷脂脂肪酸可作为微生物分类的依据,
且具有快捷和重现性高的特点,是一种适合剖析微
生物群落结构特征及相互关系的方法.
本研究中,采用微生物内标法虽然解决了不同
微生物种属之间 PLFA的重叠及环境中酯类组分等
的影响等问题,能较为准确地评估酿酒糟醅微生物
群落结构的多样性. 但目前的研究仍是基于可培养
微生物的 PLFA,只有组合 PCR、FISH和 PLFA等[32]
技术的优势,或许能将评估水平提高到种属水平甚
至亚种水平.
4摇 结摇 摇 论
酿酒中常见功能菌种属间存在较大的差异,糟
醅中添加不同种属的微生物纯培养物后,均引起其
PLFA指纹图谱特征变化,尤其是 PLFA组分显著改
变.通过比较 3 种糟醅的 PLFA组成特征,佐证了基
于 PLFA指纹图谱研究酿酒过程中微生物群落结构
特征演变规律及相互关系. 该方法是一种灵敏而有
效的生物化学方法.
参考文献
[1]摇 Amann R, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic iden鄄
tification and in situ detection of individual microbial
cells without cultivation. Microbiology Reviews, 1995,
59: 143-169
6261 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
[2]摇 Bernard KA, Bellefeuille M, Ewan EP. Cellular fatty
acid composition as an adjunct to the identification of as鄄
porogenous, aerobic gram positive rods. Journal of Clin鄄
ical Microbiology, 1991, 29: 83-89
[3]摇 Mondini C, Insam H. Community level physiological
profiling as a tool to evaluate compost maturity: A kinet鄄
ic approach. European Journal of Soil Biology, 2003,
39: 141-148
[4]摇 Fang M, Wong JWC. Changes in thermophilic bacteria
population and diversity during composting of coal fly
ash and sewage sludge. Water, Air, and Soil Pollution,
2000, 124: 333-343
[5]摇 Hill GT, Mitkowski NA, Aldrich鄄Wolfe L, et al. Meth鄄
ods for assessing the composition and diversity of soil mi鄄
crobial communities. Applied Soil Ecology, 2000, 15:
25-36
[6]摇 Zhong W鄄H (钟文辉), Cai Z鄄C (蔡祖聪). Methods
for studying soil microbial diversity. Chinese Journal of
Applied Ecology (应用生态学报), 2004, 15 (5):
899-904 (in Chinese)
[7]摇 McKinley VL, Peacock AD, White DC. Microbial com鄄
munity PLFA and PHB responses to ecosystem restora鄄
tion in tallgrass prairie soils. Soil Biology and Biochem鄄
istry, 2005, 37: 1946-1958
[8]摇 Frosteg覽rd 魡, Tunlid A, B覽覽th E. Use and misuse of
PLFA measurements in soils. Soil Biology and Biochem鄄
istry, 2011, 43: 1621-1625
[9]摇 S觟derberg KH, Probanza AJ, B覽覽th E. The microbial
community in the rhizosphere determined by community鄄
level physiological profiles (CLPP) and direct soil鄄 and
cfu鄄PLFA techniques. Applied Soil Ecology, 2004, 25:
135-145
[10]摇 Zelles L and Bai QY. Fractionation of fatty acids derived
from soil lipids by solid phase extraction and their quan鄄
titative analysis by GC鄄MS. Soil Biology & Biochemis鄄
try, 1993, 25: 495-507
[11]摇 White DC, Stair JO, Ringelberg DB. Quantitative com鄄
parisons of in situ microbial biodiversity by signature bi鄄
omarker analysis. Journal of Industrial Microbiology,
1996, 17: 185-196
[12]摇 Yan H (颜摇 慧), Zhong W鄄H (钟文辉), Li Z鄄P (李
忠佩), et al. Effects of long鄄term fertilization on phos鄄
pholipid fatty acids and enzyme activities in paddy red
soil. Chinese Journal of Applied Ecology (应用生态学
报), 2008, 19(1): 71-75 (in Chinese)
[13]摇 Feng H鄄M (冯慧敏), He H鄄B (何红波), Bai Z (白
震), et al. Microbial degradation of acetochlor in molli鄄
sol and the effects of acetochlor on the characteristics of
soil phospholipid fatty acids. Chinese Journal of Applied
Ecology (应用生态学报), 2008, 19(7): 1585-1590
(in Chinese)
[14]摇 B覽覽th E, Anderson TH. Comparison of soil fungal / bac鄄
terial ratios in a pH gradient using physiological and PL鄄
FA鄄based techniques. Soil Biology & Biochemistry,
2003, 35: 955-963
[15]摇 Rinklebe J, Langer U. Microbial diversity in three flood
plain soils at the Elbe River. Soil Biology & Biochemis鄄
try, 2006, 38: 2144-2151
[16]摇 Ren R鄄X (任瑞霞), Zhang Y (张摇 颖), Li H (李摇
慧), et al. Pollutant components and microbial commu鄄
nity structure of oil鄄polluted soils after converted from
paddy field to upland. Chinese Journal of Applied Ecolo鄄
gy (应用生态学报), 2007, 18(5): 1107-1112 ( in
Chinese)
[17]摇 Frosteg覽rd 魡, Tunlid A, B覽覽th E. Phospholipid fatty
acid composition, biomass, and activity of microbial
communities from two soil types experimentally to differ鄄
ent metals exposed heavy. Applied and Environmental
Microbiology, 1993, 59(11): 3605-3617
[18]摇 White DC, Davis WM, Nickels JS, et al. Determination
of the sedimentary nicrobial biomass by extractible lipid
phosphate. Oecologia, 1979, 40: 51-62
[19]摇 Yu M (喻 摇 曼), Zeng G鄄M (曾光明), Chen Y鄄N
(陈耀宁), et al. Microbial community changes during
the degradation of straw using phospholipid fatty acid
analysis. Environmental Science (环境科学), 2007, 28
(11): 2603-2608 (in Chinese)
[20]摇 Wang S鄄G (王曙光), Hou Y鄄L (侯彦林). Applica鄄
tion of phospholipid fatty acid method in soil microbial
analysis. Microbiology (微生物学通报), 2004, 31
(1): 114-117 (in Chinese)
[21] 摇 Yan H (颜 摇 慧), Cai Z鄄C (蔡祖聪), Zhong W鄄H
(钟文辉). PLFA analysis and its applications in the
study of soil microbial diversity. Acta Pedologica Sinica
(土壤学报), 2006, 43(5): 851-859 (in Chinese)
[22]摇 Shen P (沈摇 萍), Chen X鄄D (陈向东). Microbiology
Experiment. Beijing: Higher Education Press, 2008:
241-249 (in Chinese)
[23]摇 Zheng J (郑 摇 佳), Zhang L (张 摇 良), Shen C鄄H
(沈才洪), et al. Characteristics of microbial communi鄄
ty structure in Luzhou鄄flavor fermentation pits. Chinese
Journal of Applied Ecology (应用生态学报), 2011, 22
(4): 1020-1026 (in Chinese)
[24]摇 Frosteg覽rd 魡, Tunlid A, B覽覽th E. Phospholipid fatty
acid composition, biomass, and activity of microbial
communities from two soil types experimentally to differ鄄
ent metals exposed heavy. Applied and Environmental
Microbiology, 1993, 59: 3605-3617
[25]摇 Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and li鄄
popolysaccharides in the characterisation of microbial
72616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘琨毅等: 基于 PLFA指纹图谱表征浓香型酒糟醅微生物群落结构摇 摇 摇 摇 摇
communities in soil: A review. Biology and Fertility of
Soils, 1999, 29: 111-129
[26]摇 Bardgett RD, Hobbs PJ, Frosteg覽rd 魡. Changes in soil
fungal: Bacterial ratios following reductions in the inten鄄
sity of management of upland grassland. Biology and
Fertility of Soils, 1996, 22: 261-264
[27]摇 Kieft TL, Ringelberg DB, White DC. Changes in ester鄄
linked phospholipid fatty acid profiles of subsurface bac鄄
teria during starvation and desiccation in a porous medi鄄
um. Applied and Environmental Microbiology, 1994,
60: 3292-3299
[28]摇 Philip WR, Matthias CR, Kevin PF. Choice of methods
for soil microbial community analysis: PLFA maximizes
power compared to CLPP and PCR鄄based approaches.
Pedobiologa, 2006, 50: 275-280
[29]摇 Yu J (于 摇 静), Wen S (文 摇 殊), Tang L (唐 摇
立). A fast quantification for Bifidobacteria in human
feces by real鄄time PCR. Chinese Journal of Microecology
(中国微生态学杂志), 2009, 21(10): 869-873 ( in
Chinese)
[30] 摇 Zhang W鄄X (张文学), Qiao Z鄄W (乔宗伟), Hu C
(胡 摇 承), et al. Analysis of bacterial community in
fermented grains during the production of Chinese strong
aromatic spirits by PCR technique. Journal of Sichuan
University (四川大学学报), 2005, 37(5): 82-87 (in
Chinese)
[31] 摇 Zhang W鄄X (张文学), Qiao Z鄄W (乔宗伟), Hu C
(胡摇 承), et al. Fungal diversity of fermented grains
during the production of Chinese strong aromatic spirits.
Journal of Sichuan University (四川大学学报), 2006,
38(5): 97-101 (in Chinese)
[32]摇 Pan X鄄L (潘响亮), Deng W (邓 摇 伟), Zhang D鄄Y
(张道勇). Application of biomarker PLFA to groundw鄄
ater microbial ecology study and the problems. Scientia
Geographica Sinica (地理科学), 2003, 23(6): 740-
745 (in Chinese)
作者简介摇 刘琨毅,男,1987 年生,硕士研究生.主要从事现
代发酵技术研究. E鄄mail: 524449601@ qq. com
责任编辑摇 肖摇 红
8261 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷