全 文 ：21 株马特组镰刀菌遗传多样性的 ISSR分析*
李新凤1 摇 张光明1 摇 畅引东1 摇 王建明1**摇 李蕊倩2 摇 李亚立1
( 1山西农业大学农学院, 山西太谷 030801; 2山西农业大学成人教育学院, 山西太谷 030801)
摘摇 要摇 为明确马特组镰刀菌种间和种内的遗传差异与亲缘关系,本文利用 ISSR 分子标记
技术对 21 个马特组菌株进行了遗传多样性分析.结果表明: 利用筛选出的 15 条引物对 3 种
供试菌株进行扩增,共扩增出 239 条条带,其中多态性条带 230 条,多态性位点比例为
96郾 2% ,平均每条引物产生条带数为 15. 3 条. 21 个菌株间的遗传相似系数范围为 0. 494 ~
0郾 933,平均为 0. 640.在遗传相似系数为 0. 593 时,供试的 21 株马特组镰刀菌可明显分成 2
个 ISSR类群( IG),IG鄄玉包括 1 ~ 17 号菌株,为 Fusarium solani 和 F. solani var. coeruleum;
IG鄄域包括 18 ~ 21 号菌株,全部为 F. ventricosum.在遗传相似系数为 0郾 933 时,供试的 21 个菌
株可被全部区分开.供试的镰刀菌基因组在 SSR区域具有丰富的多态性;ISSR类群划分与菌
种分类之间存在一定相关性,但与菌株的地理来源没有相关性;而同一类群中,不同菌株之间
的遗传相似性与菌株的地理来源存在一定的相关性.同一地区同种寄主的相同菌种,其菌株
间也存在一定的遗传差异.
关键词摇 马特组镰刀菌摇 分子标记摇 ISSR鄄PCR摇 遗传多样性
文章编号摇 1001-9332(2012)05-1339-06摇 中图分类号摇 S43摇 文献标识码摇 A
Genetic diversity of 21 Fusarium strains in Section Martiella based on ISSR analysis. LI Xin鄄
feng1, ZHANG Guang鄄ming1, CHANG Yin鄄dong1, WANG Jian鄄ming1, LI Rui鄄qian2, LI Ya鄄li1
( 1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China; 2College of
Adult Education, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China) . 鄄Chin. J. Appl.
Ecol. ,2012,23(5): 1339-1344.
Abstract: In order to understand the genetic difference and phylogenic relationship within and
among the Fusarium species in Section Martiella, the genetic diversity of 21 Fusarium strains in the
section was examined by inter鄄simple sequence repeats (ISSR). Fifteen selected ISSR primers were
adopted to do amplification, and a total of 239 bands were amplified, among which, 230 (96. 2% )
were polymorphic, with an average of 15. 3 polymorphic bands per primer. The genetic similarity
ranged from 0. 494 to 0郾 933, with an average of 0. 640. All the test strains were clustered into two
groups at genetic similarity of 0. 593. The strains 1-17 were grouped into IG鄄I, belonging to Fusar鄄
ium solani and F. solani var. coeruleum, while the strains 18-21 were grouped into IG鄄II, belong鄄
ing to F. ventricosum. All the 21 strains could be entirely distinguished at genetic similarity of
0郾 933. The SSR loci in the Fusarium genomes were rich in polymorphism. The ISSR grouping had
definite correlation with the species classification, but less correlation with the geographic origin of
the strains. Within the same ISSR groups, there existed definite correlation between the genetic
similarity and the geographic origin of the strains. Within the same species collected from the same
regions and same host plants, there existed definite genetic difference among the strains of the same
species.
Key words: Fusarium strains in Section Martiella; molecular marker; ISSR鄄PCR; genetic diversity.
*山西省自然科学基金项目(2006011080)和山西农业大学科技创新基金项目(412556)资助.
**通讯作者. E鄄mail: jm. w@ sohu. com
2011鄄06鄄19 收稿,2012鄄02鄄01 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 5 月摇 第 23 卷摇 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, May 2012,23(5): 1339-1344
摇 摇 镰刀菌属(Fusarium Link)是一类具有重要经济
意义的真菌,该属在自然界中分布广、数量多、变异
快,因而其分类较复杂[1] . 自 Wollenweber 和 Rein鄄
king[2]于 1935 年首次提出该属的分类系统后,不同
学者相继提出了至少 10 个镰刀菌属的分类系统[3] .
关于镰刀菌以往主要是根据形态学及培养特征等进
行分类,这种方法在一定程度上不可避免地要受到
人为因素的干扰,因此难以准确揭示物种的进化关
系,而且还需进行同种内不同专化型、不同生理小种
的划分,以及大量的致病性及营养体亲和群试验,这
给分类鉴定带来了诸多不便.因此,形态学分类不仅
难以科学地反映其系统发育和亲缘关系,且致病性
测试费时费力.
运用分子生物学相关技术分析镰刀菌的遗传多
态性,能从 DNA水平上反映菌株之间本质的差异.
分子系统学所反映的镰刀菌系统发育关系与以形态
学为基础的镰刀菌分类系统相比较,两者之间存在
许多差异,形态学与系统发育学中种的概念存在许
多不一致的地方,而系统学中的亲缘种能够更科学
地反映镰刀菌属的系统发育与亲缘关系[4-7] . 自
1989 年 Guadet 等[8]将分子系统学方法应用于镰刀
菌属种的鉴定以来,人们用分子系统学澄清了该属
中许多种间、种内的系统发育关系、有性型鄄无性型
的联系[9-10],其中变化最大的是藤仓赤霉菌复合种
(Gibberella fujikuroi species complex,GFC) [11-13] . 同
时,结合形态学与分子系统学方法,发表了多个镰刀
菌新种[14-16],这使得分子系统学本身得到了进一步
发展.目前,应用于镰刀菌遗传多样性分析的分子标
记技术主要有限制片段长度多态性(restriction frag鄄
ment length polymorphism, RFLP)、扩增片段长度
多态性(amplified fragment length polymorphism,
AFLP)、随机扩增多态性 DNA ( random amplified
polymorphic DNA,RAPD)、核糖体核酸內转录间隔
区(rDNA鄄internal transcribed spacer, rDNA鄄ITS)等.
简单序列重复区间 ( inter鄄simple sequence repeats,
ISSR)标记技术在分析镰刀菌的遗传多态性方面,
特别是种内遗传多样性上有其独特的优势. 国内外
已将该技术成功应用于尖孢镰刀菌 ( F. oxyspo鄄
rum) [17-21]、梨孢镰刀菌(F. poae) [22]、黄色镰刀菌
(F. culmorum) [23] 及禾谷镰刀菌 ( F. graminea鄄
rum) [24]的种内遗传分化研究.因此在传统分类基础
上,应用 ISSR分子标记技术研究镰刀菌各菌种间和
种内的系统发育与亲缘关系,对镰刀菌属分类鉴定
和相关领域的研究具有重要的科学意义.
马特组(Section Martiella)是镰刀菌属中一个重
要的组[25-26],该组中的茄病镰刀菌(F. solani)及其
变种可侵染多种植物,造成根腐、茎腐、果实腐烂等
病害[27-28],有些还是人体病原菌,可引起皮肤溃疡、
眼睛角膜炎、大关节等疾病.该组由 Wollenweber 和
Reinking[2]于 1935 年首次建立,并得到了大多数镰
刀菌分类专家的认可,但目前对于该组的分类仍存
在很大分歧[25],且尚未见到有关该组镰刀菌的遗传
差异与亲缘关系的系统研究报道. 为明确该组镰刀
菌基因组在 SSR区域的遗传差异与亲缘关系,本研
究采用 ISSR鄄PCR技术分析了 21 株镰刀菌属马特组
菌株及其变种的遗传分化,并探讨了其遗传多样性
与地理分布的关系,旨在为今后深入开展镰刀菌的
分类鉴定和系统发育等研究,提供科学的分子依据
与技术措施.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 试验材料
供试菌株:21 株镰刀菌属马特组菌株由山西农
业大学植物病理实验室提供,其寄主及采集地见表
1.依据 Booth分类系统[26]进行形态学鉴定.
供试引物:ISSR鄄PCR反应的 21 个 ISSR 引物从
加拿大英属哥伦比亚大学(University of British Co鄄
lumbia)公布的序列中选出[29],由北京天根生物技
术有限公司合成.
试验仪器: PCR 基因扩增仪 ( MJReasearch
USA)、DYY鄄11 型电脑三恒多用电泳仪(北京六一
仪器厂)、超低温离心机(Sigma 公司)、超低温冰箱
(Sigma公司)、凝胶成像分析系统( Sigma 公司)和
紫外可见分光光度计等.
试验试剂: RNaseA、 DNA maker、 TaqDNA 和
dNTP购于北京天根生物技术有限公司.
1郾 2摇 试验方法
1郾 2郾 1 菌体培养与模板 DNA 的制备摇 菌体培养:将
镰刀菌菌种接到查彼培养液中,27 益恒温振荡培养
7 d,然后抽滤菌丝,将其烘干.
模板 DNA 的制备:采用改进的 SDS 法[20]抽提
镰刀菌基因组 DNA,所提取的 DNA经 0郾 8%的琼脂
糖凝胶电泳后,在 GIS凝胶成像分析系统中拍照,分
析荧光强度,以标准 DNA 分子量作对照,并用紫外
吸收法检测 DNA 浓度,然后将 DNA 浓度稀释成 20
ng·滋L-1,贮存于-20 益冰箱中备用.
1郾 2郾 2 ISSR扩增反应摇 ISSR 扩增反应体系:PCR 反
应体系为20 滋L,其中包含1郾 0 U TaqDNA聚合酶、
0431 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
表 1摇 供试菌株及来源
Table 1摇 Tested strains and their sources in the study
编号
No郾
寄主
Host
菌株
Strain
采集地
Collected site
1 甜瓜 Cucumis melo 茄病镰刀菌 F郾 solani 太谷 Taigu
2 黄瓜 Cucumis sativus 茄病镰刀菌 F郾 solani 太谷 Taigu
3 茄子 Solanum melongena 茄病镰刀菌 F郾 solani 阳城 Yangcheng
4 番茄 Lycopersicon esculentum 茄病镰刀菌 F郾 solani 临汾 Linfen
5 辣椒 Capsicum annuum 茄病镰刀菌 F郾 solani 汾阳 Fenyang
6 大豆 Glycine max 茄病镰刀菌 F郾 solani 太谷 Taigu
7 豇豆 Vigna unguiculata 茄病镰刀菌 F郾 solani 太谷 Taigu
8 绿豆 Vigna radiata 茄病镰刀菌 F郾 solani 祁县 Qixian
9 豌豆 Pisum sativum 茄病镰刀菌 F郾 solani 祁县 Qixian
10 地豆 Phaseolus vulgaris 茄病镰刀菌 F郾 solani 阳城 Yangcheng
11 绿豆 Vigna radiata 茄病蓝色变种 F郾 solani var郾 coeruleum 阳城 Yangcheng
12 胡麻 Linum usitatissimum 茄病蓝色变种 F郾 solani var郾 coeruleum 交口 Jiaokou
13 胡麻 Linum usitatissimum 茄病蓝色变种 F郾 solani var郾 coeruleum 交口 Jiaokou
14 大豆 Glycine max 茄病镰刀菌 F郾 solani 神池 Shenchi
15 番茄 Lycopersicon esculentum 茄病蓝色变种 F郾 solani var郾 coeruleum 怀仁 Huairen
16 大豆 Glycine hispidax 茄病镰刀菌 F郾 solani 河曲 Hequ
17 番茄 Lycopersicon esculentum 茄病蓝色变种 F郾 solani var郾 coeruleum 大同 Datong
18 番茄 Lycopersicon esculentum 腹状镰刀菌 F郾 ventricosum 阳城 Yangcheng
19 番茄 Lycopersicon esculentum 腹状镰刀菌 F郾 ventricosum 阳城 Yangcheng
20 番茄 Lycopersicon esculentum 腹状镰刀菌 F郾 ventricosum 阳城 Yangcheng
21 番茄 Lycopersicon esculentum 腹状镰刀菌 F郾 ventricosum 临汾 Linfen
1郾 5 mmol·L-1 MgCl2、0郾 15 mmol·L -14伊dNTP、0郾 4
滋mol·L-1引物和 20 ng模板 DNA[20] .
PCR扩增反应程序:94 益预变性 5 min,94 益
变性 45 s,52 益退火 45 s,72 益延伸 2 min,35 个循
环,最后 72 益延伸 7 min. 反应结束后,用 1郾 5%琼
脂糖凝胶(含 0郾 5 mg·L-1核酸染色剂)将扩增产物
进行分离,并用 GIS凝胶成像分析系统观察拍照.
1郾 2郾 3 引物筛选摇 随机选取 3 个供试菌株的基因组
为模板,利用合成的 ISSR 引物进行扩增,然后对扩
增结果进行比较,从中选择多态性和稳定性较好的
引物对供试菌株的基因组进行 PCR扩增.
1郾 2郾 4 电泳谱带的记录及数据统计分析摇 ISSR鄄PCR
产物经电泳分离后,记录每条引物每个菌株的扩增
结果.电泳图谱中每条扩增带均代表了引物与模板
DNA互补的 1 对结合位点,可记为 1 个分子标记.
将 PCR扩增的 DNA 条带转换成二进制数据,有带
的记为 1,无带的记为 0. 利用 NTSYSpc ( Version
2郾 10e)软件进行聚类分析并构建种间及种内的系统
聚类图.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 ISSR引物筛选与 PCR扩增结果
从表 2 可以看出,退火温度是影响 ISSR鄄PCR
表 2摇 21 条 ISSR引物对 21 株镰刀菌的扩增结果
Table 2摇 Amplification results of 21 Fusarium strains with
21 ISSR primers
引物
Primer
序列
Sequence
退火温度
Annealing
temperature
(益)
扩增条
带数
Number
of
amplified
bands
多态性
条带数
Number
of
polymorphic
bands
多态性
比例
Percentage
of
polymorphic
bands
801 (AT)8T 52 - - 0
807 (AG)8T 54 20 20 100
808 (AG)8C 54 21 21 100
809 (AG)8G 54 18 16 88郾 9
810 (GA)8T 54 13 13 100
811 (GA)8G 52 15 15 100
812 (GA)8A 52 19 19 100
831 (AC)8YA 52 16 16 100
835 (AG)8YC 52 16 16 100
895 AGAGTTGGT鄄
ACGTCTTGAT
54 - - 0
847 (CA)8RC 52 - - 0
881 (GGGGT)3 54 12 10 83郾 3
882 VBV(AT)7 54 - - 0
883 BVB(TA)7 54 - - 0
884 HBH(AG)7 54 20 19 95郾 0
885 BHB(GA)7 52 7 7 100
887 DVD(TC)7 52 14 14 100
888 BDB(CA)7 54 17 17 100
889 DBD(AC)7 54 13 13 100
891 HVH(TG)7 52 18 14 77郾 8
898 GATCAAGCTTN鄄
NNNNNATGTGG
54 - - 0
合计
Total
239 230 96郾 2
14315 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李新凤等: 21 株马特组镰刀菌遗传多样性的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇
扩增效果的重要因素,不同引物要求的退火温度不
同,当退火温度为 52 益或 54 益时,从供试的 21 条
引物中共筛选出 15 条多态性明显、条带清晰、反应
稳定的引物.这些引物对 21 株镰刀菌属马特组菌株
进行 ISSR鄄PCR分析都具有良好的多态性,共扩增
出 239 条条带,多分布在 400 ~ 2000 bp之间(图 1),
其中特征性条带(多态性位点)为 230 条,多态性位
点比例为 96郾 2% . 不同引物扩增条带数不同,多数
为 15 ~ 20 条,平均每个引物产生多态性条带 15郾 3
条.其中,808 号引物扩增出的条带数最多,为 21
条;引物 885 号扩增出的条带数最少,为 7 条.
2郾 2摇 供试镰刀菌聚类分析结果及遗传相似性分析
2郾 2郾 1 供试菌株的聚类分析 摇 聚类分析结果表明,
供试 21 株镰刀菌属马特组菌株类群间的遗传相似
系数在 0郾 593 ~ 0郾 933 之间. 在遗传相似系数为
0郾 593 时,供试菌株可明显分成 2 个 ISSR 类群( IS鄄
SR group,IG),IG鄄玉包括 1 ~ 17 号菌株,为茄病镰刀
菌和茄病蓝色变种(F郾 solani var郾 coeruleum);IG鄄域
包括 18 ~ 21 号 4 个菌株,全部为腹状镰刀菌(F郾
ventricosum)(图 2).可见,供试的马特组 3 种菌株之
间遗传差异明显,其中茄病镰刀菌与茄病蓝色变种
亲缘关系相对较近,而与腹状镰刀菌亲缘关系较远,
同源性较低,遗传相似系数仅为 0郾 593. ISSR类群的
划分与菌株种的分类之间存在一定相关性,但与菌
株的地理来源没有关系.
图 1摇 引物 812、884、888 对 21 个镰刀菌基因组 DNA 的
ISSR鄄PCR扩增效果
Fig. 1摇 ISSR patterns of 21 Fusarium strains with primer 812,
884 and 888郾
1 ~ 21:菌株 Strain; M:标记物 Marker郾
摇 摇 IG鄄玉在遗传相似系数为 0郾 615 时可分为 2 个
亚类群(ISSR subgroup,ISG),其中 1 ~ 11 号菌株为
亚类 ISG鄄玉,包括 10 株茄病镰刀菌和 1 株茄病蓝色
变种;12 ~ 17 号菌株为亚类 ISG鄄域,包括 2 株茄病
镰刀菌和 4 株茄病蓝色变种(图 2).说明茄病镰刀
菌和茄病蓝色变种虽然亲缘关系相对较近,但菌株
间在基因组 DNA 的 SSR 区域遗传差异十分显著.
两个亚类 ISG鄄玉与 ISG鄄域,又可进一步划分为多个
亚群.这说明同种内的 DNA鄄SSR遗传分化现象也十
分明显.分子树状图显示,在遗传相似系数为 0郾 847
时,供试的 21 株马特组镰刀菌中的 15 个菌株可被
区分开,在遗传相似系数为 0郾 933 时,供试的 21 个
菌株可被全部区分开.
2郾 2郾 2 21 株马特组镰刀菌菌株间的遗传相似性分析
摇 利用 NTSYS软件对 21 个菌株(扩增出的 230 条
多态性谱带)两两之间的遗传相似系数进行计算,
结果表明,供试菌株的相似系数范围为 0郾 494 ~
0郾 933,平均为 0郾 640.其中 13、12 和 2 号菌株间的相
似系数最小,遗传距离最大,亲缘关系最远;19 和 20
号菌株间的相似系数最大,遗传距离最小,亲缘关系
最近. IG鄄玉中的 17 个菌株间的平均相似系数为
0郾 653,IG鄄域中的 4 株腹状镰刀菌间的平均相似系
数为 0郾 738. IG鄄玉和 IG鄄域两类群间的平均相似系
数为 0郾 593. 在 IG鄄玉类群中,ISG鄄玉和 ISG鄄域间的
平均相似系数为0郾 616.表明供试镰刀菌的遗传分
图 2摇 镰刀菌 21 个菌株的 ISSR聚类分析图
Fig. 2摇 Dendrogram of 21 Fusarium isolates with ISSR鄄PCR郾
2431 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
化较大,具有比较丰富的遗传多样性.
类群 ISG鄄玉中的 1 株茄病蓝色变种和其他 10
株茄病镰刀菌的平均相似系数为 0郾 654,与类群
ISG鄄域中其他 4 株同种的蓝色变种的平均相似系数
差异不大,为 0郾 653.在 ISG鄄域类群中,2 株茄病镰刀
菌,即 14 号和 16 号与 ISG鄄玉类群中同种菌株
(1 ~ 10 号)的平均相似系数分别为 0郾 617 和 0郾 628;
比它们与同一亚类群中 5 株茄病蓝色变种(11、12、
13、15、17 号)的平均相似系数低,分别为 0郾 664 和
0郾 638.表明茄病镰刀菌和其蓝色变种在 DNA鄄SSR
区域存在一定的差异,但差异相对较小,而二者在培
养性状等方面存在明显差异.
由遗传相似性分析结果还可以看出,在两个类
群中,来源于不同地区的同种菌的遗传相似性与菌
种的地理来源有一定的相关性,来自同一地区的菌
株相似性相对较高,反之较低,如分离自大豆的山西
北部神池 14 号和河曲的 16 号菌株之间的相似系数
较高,为 0郾 782,而分离自山西中部太谷的 6 号菌株
与神池 14 号和河曲 16 号菌株间的相似系数均较
低,为 0郾 636.
此外,来源于同一地区同种寄主的相同菌种,其
菌株间也存在一定的遗传差异,如 IG鄄域类群中分
离自阳城番茄上的 18、19、20 号 3 个菌株,相互间的
相似系数分别为 0郾 858、0郾 849 和 0郾 933.说明供试马
特组菌株种内在 DNA鄄SSR 区域也存在比较明显的
遗传分化.
3摇 结摇 摇 语
本试验用筛选出的 15 条引物对 21 株供试菌株
进行 ISSR鄄PCR分析,均取得了很好的效果,平均每
个引物可产生 15 条条带,多态性条带比例达
96郾 2% ,说明镰刀菌基因组 DNA的 SSR区域遗传差
异明显,多态性高,该技术是一种可靠且有效的镰刀
菌种内遗传多样性分析手段.这与段会军等[21]利用
ISSR技术分析西瓜枯萎病菌的遗传多样性,Dubey
和 Singh[17]研究尖孢镰刀菌及 Dinolfo 等[22]研究梨
孢镰刀菌的遗传分化得出的结论一致. 此外,虽然
ISSR在镰刀菌种内和种间表现了高度的遗传差异,
但菌株间的特异性并不明显,因此,进一步结合开发
特异性明显的镰刀菌 SSR 引物,对于镰刀菌的分子
鉴定等具有重要的研究意义.
聚类分析树状图表明,腹状镰刀菌和茄病镰刀
菌及其变种间存在较大的遗传差异,同源性较低,而
在传统的形态学分类中将其分在同一个马特组
中[25],所反映的亲缘关系较近,可见形态学与分子
系统发育学对种的划分并不一致.供试的 12 株茄病
镰刀菌和 5 株茄病蓝色变种两菌种在培养性状上存
在明显差异[1],而两菌种在 SSR 区域没有明显差
异,因此茄病蓝色变种作为一个“种冶,还是茄病镰
刀菌种下的一个“变种冶或“品种冶还有待进一步
商榷.
Bayraktar等[19]利用 RAPD 和 ISSR技术研究了
鹰嘴豆根腐病菌(Fusarium solani)的遗传多样性,指
出 ISSR类群划分与菌株地理来源具有相关性.本研
究表明,ISSR类群的划分与菌株种的分类存在一定
相关性,而与菌株的地理来源并不相关,但同一类群
中,不同菌株间的遗传相似性与菌株的地理来源有
一定的相关性.因此,不能简单地判断二者之间是否
具有相关性.此外,同一地区、同种寄主上的相同菌
种间存在遗传差异,说明其具有适应寄主的遗传潜
能,对寄主适应所产生的群体遗传结构变化可能是
导致镰刀菌变异快的一个主要原因.
本试验中的供试菌株均采自山西省不同地区,
且数量有限,因此试验结果具有一定的局限性,有关
不同分类单元上 ISSR 类群划分的标准及其与形态
学类群划分标准的相关性,还需要做大量研究.
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作者简介 摇 李新凤,女,1971 年生,博士,讲师. 主要从事镰
刀菌分类及分子标记研究. E鄄mail: lxf1309@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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