全 文 ：土壤污染的生态毒理诊断研究进展*
刘摇 凤1**摇 滕洪辉1 摇 任百祥1 摇 石淑云2
( 1吉林师范大学环境科学与工程学院, 吉林四平 136000; 2南京大学环境学院, 南京 210046)
摘摇 要摇 土壤生态毒理学是污染土壤生态风险评价以及土壤污染控制的理论依据,土壤环境
中有毒物质的生态毒理效应及其分子机制的研究是土壤生态毒理学的核心内容.土壤污染生
态毒理诊断集合了土壤污染的全部信息,提供了土壤的整体毒性效应.因此,开展土壤污染生
态毒理诊断研究有重要的理论意义和现实意义.本文在参考国内外土壤污染生态毒理诊断研
究成果的基础上,介绍了常用土壤污染生态毒理效应诊断方法和指标,并探讨了不同方法的
利弊.传统毒理诊断方法往往只能表征胁迫的程度,不能解释损伤和响应发生分子机理.污染
土壤毒性评估的生物标记物和土壤污染分子诊断技术,可深入探讨外源胁迫下生物的解毒机
制.本文对其进行了较为系统的介绍,并对未来的研究趋势进行展望.
关键词摇 土壤生态毒理学摇 生物标记物摇 分子诊断摇 解毒机制
文章编号摇 1001-9332(2014)09-2733-12摇 中图分类号摇 S158. 4摇 文献标识码摇 A
Research advances in eco鄄toxicological diagnosis of soil pollution. LIU Feng1, TENG Hong鄄
hui1, REN Bai鄄xiang1, SHI Shu鄄yun2 ( 1 College of Environmental Science and Engineering, Jilin
Normal University, Siping 136000, Jilin, China; 2School of the Environment, Nanjing University,
Nanjing 210046, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(9): 2733-2744.
Abstract: Soil eco鄄toxicology provides a theoretical basis for ecological risk assessment of contami鄄
nated soils and soil pollution control. Research on eco鄄toxicological effects and molecular mecha鄄
nisms of toxic substances in soil environment is the central content of the soil eco鄄toxicology. Eco鄄
toxicological diagnosis not only gathers all the information of soil pollution, but also provides the
overall toxic effects of soil. Therefore, research on the eco鄄toxicological diagnosis of soil pollution
has important theoretical and practical significance. Based on the research of eco鄄toxicological diag鄄
nosis of soil pollution, this paper introduced some common toxicological methods and indicators,
with the advantages and disadvantages of various methods discussed. However, conventional bio鄄
markers can only indicate the class of stress, but fail to explain the molecular mechanism of damage
or response happened. Biomarkers and molecular diagnostic techniques, which are used to evaluate
toxicity of contaminated soil, can explore deeply detoxification mechanisms of organisms under exo鄄
genous stress. In this paper, these biomarkers and techniques were introduced systematically, and
the future research trends were prospected.
Key words: soil eco鄄toxicology; biomarkers; molecular diagnosis; detoxification mechanism.
*国家自然科学基金项目(21077041)和吉林省科技厅青年科研基
金项目(201101133)资助.
**通讯作者. E鄄mail: liufengkelvin@ 163. com
2013鄄12鄄20 收稿,2014鄄06鄄09 接受.
摇 摇 土壤生态毒理诊断集合了土壤整体毒性效应,
提供土壤污染的全部信息,是污染土壤的清洁与安
全利用的重要环节[1-3] . 土壤生态毒理学是生态毒
理学学科体系中最为年轻的分支,是生态毒理学和
现代土壤学相互交叉形成的边缘学科[4] . 尽管土壤
生态毒理学在生态毒理学研究体系中占有很重要的
地位,但其学科方向和研究重点比较含糊,尤其在对
分子水平上土壤生态毒理学规律的认识上,与其他
分支学科存在着较大的差距[5] . 土壤生态毒理学研
究在国内外还处于起步阶段,有必要对其进行广泛
及深入的研究.
1摇 土壤生态毒理诊断方法
1郾 1摇 植物法
植物扮演着生产者的重要角色,其生长状况是
诊断土壤污染的重要指标. 目前建立的比较成熟的
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 9 月摇 第 25 卷摇 第 9 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Sep. 2014, 25(9): 2733-2744
高等植物毒理方法主要有植物早期生长、种子发芽、
根伸长抑制试验.植物对污染物产生毒性响应的生
理生化指标主要有酶活性、生物量、根伸长、发芽率、
叶绿素含量等,研究的污染物由先前的纯化学品逐
渐扩展到污染的土壤,采取的研究手段主要有土壤
栽培(包括室外大田试验和室内栽培)、水培、滤纸
法等,从污染物的剂量鄄反应关系,混合污染毒性与
土壤营养物质浓度水平等关系方面,探讨污染物在
植物体内的迁移、积累、转化规律,为土壤毒理诊断
研究提供了依据[6-8] . 但植物生态毒理诊断方法尚
存在很多局限,由于植物的生长易受到各种环境因
素的干扰,且生长周期较长,所需的测试仪器和分析
技术较复杂,不适合于土壤污染的快速检测.
1郾 2摇 动物法
土壤动物在土壤有机质分解、养分循环、改善土
壤结构以及微环境的稳定与健康等方面发挥着重要
作用,因此动物常被作为土壤质量评价的重要模式
生物[9] .
1郾 2郾 1 土壤无脊椎动物 摇 无脊椎动物具有分布广
泛、体积小、与土壤紧密接触、对污染物敏感和世代
周期短等特点,可以作为土壤毒理学诊断的模式生
物[10-12] .蚯蚓是土壤中生物量最大的一类动物,在
维持土壤生态系统功能方面起着不可替代的作
用[13-15] .蚯蚓毒理学研究方法比较灵活,可以从野
外现场收集蚯蚓进行毒性测试,或者将实验室饲养
的蚯蚓暴露于土壤污染物中,因而适合作为土壤污
染的指示生物[15] .
相对于急性毒性,外源胁迫对蚯蚓慢性毒性的
相关研究较多,生物毒性测试终点主要包括死亡率
和生长发育两大类指标[13-15],其中生长发育指标主
要包括繁殖率、产卵率和生物量等[13-16] .但是,以这
些传统的指标作为毒性终点的测试操作复杂且需要
消耗大量的时间[17] . 近年来,回避试验由于具有操
作简便、快速(测试周期不超过 2 d)、灵敏度高等优
点,被广泛用于土壤生态毒理学研究中[18] . ISO 已
经制定了蚯蚓和弹尾类动物标准化的回避试验方
法,还有一些物种(如线蚓、甲螨、等足类动物等)也
可用于回避试验研究[18-21] .
土壤无脊椎动物试验方法也有一定的局限性,
如试验成本较高,且费时较多,不能准确反映土壤污
染的毒性等.
1郾 2郾 2 土壤原生动物摇 原生动物是继细菌和真菌之
后的第三大土壤动物类群,主要包括纤毛虫、鞭毛虫
和壳变形虫,具有高度的形态和功能多样性,且有一
些其他高等动物不可代替的优势,如形体微小,结构
简单,世代时间短暂和繁殖速度快等[22-23],因而已
被广泛应用于指示土壤污染,其评价与监测主要通
过研究原生动物个体数量变化、群落结构变化、细胞
分子水平变化来进行[23-26] .但原生动物在土壤监测
中也有它的不足之处,表现为:一是种类多,鉴定困
难.不同的培养基诱导出来的土壤原生动物数量和
种类往往不同,从而影响可比性;二是数量大,计数
费时,常会过高或过低地估计个体丰度.目前已知的
土壤原生动物仅占实际种类的 20% ~30% [26],在分
类学上的欠缺也是原生动物毒理学研究的瓶颈.
1郾 3摇 土壤生物特性诊断法
植物和动物的试验周期都比较长,费用也较高,
需要特殊仪器装置和专业操作人员;而土壤生物特
性诊断法与其他高等生物试验相比具有很多优点,
如简便、快速、准确、重现性好等.目前常用的方法主
要包括:土壤生物量、土壤呼吸、酶活性、硝化势(硝
化势通常指土壤中基质饱和时的硝化速率)、群落
多样性和固氮等指标[27-31] .
1郾 3郾 1 土壤酶法摇 土壤酶活性能反映土壤生物化学
反应程度,从非专一的脱氢酶或称电子转移系统,到
催化专一反应的酶(诸如蛋白酶和脲酶等),都有过
报道.其中,土壤脲酶和磷酸酶能够有效地评价土壤
肥力状况[32-33] .而脱氢酶是典型的胞内酶,其活性
大小直接反映土壤微生物的生存状况. 有研究对比
了土壤脱氢酶、脲酶和微生物生物量等生理指标对
PAHs 污染的响应,发现脱氢酶灵敏度最高[34] . 另
外,土壤酶对重金属也较为敏感,是监测和评价重金
属污染的有效指标[35] . 相对于单一酶活性而言,土
壤中多种酶活性的同时监测能更全面反映总微生物
活性和外源胁迫的毒性效应[36-37] . 然而,此方法并
不能确定土壤污染程度的大小,只能初步判断土壤
污染情况.
1郾 3郾 2 土壤呼吸法摇 土壤呼吸强度是衡量土壤微生
物总的活性指标. 微生物的基础呼吸强度、代谢熵、
ATP 含量等指标能够灵敏反映土壤污染程度[38-39] .
基础呼吸是指单位生物量的微生物 CO2的产量,而
CO2代谢熵(qCO2)指单位生物量的微生物在单位时
间的呼吸作用的大小,一般认为代谢熵随污染程度
的增加而上升.它是微生物对逆境的反应机理,可作
为微生物活性反应的敏感指标之一[40-42] . 然而,对
于完全不同类型的土壤比较 qCO2是没有意义的,且
污染物和 qCO2之间的毒性机理尚不清楚,因此需要
进一步研究.
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1郾 3郾 3 微生物群落摇 土壤微生物群落数量和活性是
评价土壤健康的重要指标. 了解微生物群落的功能
是认识土壤生态过程的核心问题,因此,研究土壤微
生物代谢功能的多样性是了解微生物在生态系统中
功能的关键.目前测定土壤微生物代谢功能的多样
性的方法有基于单一碳源检测技术的 Biolog 方法,
多重底物诱导呼吸(Multi鄄SIR)和 MicroRespTM方法.
它们都是利用土壤微生物群落中每种微生物所能利
用的底物各有不同的特性,通过添加不同种类的碳
源底物来获得 “微生物群落水平生理特征
(CLPP)冶. 与传统方法相比,MicroRespTM具有明显
的优势,既克服了 Biolog 法依赖土壤悬浮液提取物
和细胞后续生长状况、Multi鄄SIR 自动化程度低、操
作繁琐等缺点,还保留了 Biolog 方法的快速、简便,
Multi鄄SIR 方法利用全土等优势,被认为是一种具有
广阔应用前景的微生物活性及群落结构的分析方
法[43-44],可以用于诊断土壤污染物的生态毒
性[45-46] .
土壤生物特性诊断指标在评价土壤污染方面也
有一些缺陷,由于不同土壤中微生物结构和数量不
同,对污染物的敏感程度各异,再加上专一性差,造
成不同土壤的研究结果之间无可比性.
1郾 4摇 土壤污染水生态毒理学诊断方法
1郾 4郾 1 藻类试验摇 藻类扮演着初级生产者的重要角
色,且相对于高等植物,培养方便、个体小、繁殖快、
对毒物反应敏感,因此成为广泛应用的毒理测试生
物.尽管藻类试验已经被列入 OECD(经济合作与发
展组织)标准水生态毒理方法体系,但是仍然不能
简单套用到土壤污染毒理诊断中,因此其应用存在
一定的局限性.由于藻类试验方法主要用于检测水
污染毒性,因而对污染土壤的毒性评价通常在提取
液中进行[47],检测的主要指标有光密度、细胞数、叶
绿素及细胞干质量等. 但是采用提取液进行毒性评
价的缺陷是忽略了被土壤吸附的污染物质的生物有
效性及与水相的再分配,可能低估毒性效应. 鉴于
此,有学者提出了一种固相藻类毒性试验方法:将含
有处在对数生长期的藻类培养基按照一定比例和污
染土壤混合,培养一段时间后,从土壤提取液中将藻
类分离出来进行毒性检测.但此法也存在不足之处,
例如土壤对藻类产生吸附作用,最终会导致检测结
果产生偏差[48] .
1郾 4郾 2 发光菌试验摇 发光细菌对环境中的污染物较
敏感,有毒物会干扰发光细菌的正常新陈代谢过程,
此时发光强度减弱或者熄灭,在一定的范围内,发光
强度与污染物浓度间呈现一定的剂量鄄效应关系,发
光强度变化可用检测仪进行测定[49] .目前国内常用
的 3 种发光细菌为:明亮发光杆菌(Photosbacterium
phosphoreum)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)、青海弧菌
(Vibrio qinghaiensis),可以监测各种环境介质. 国外
的发光菌毒理学研究开展得较早,成套方法一般称
之为 Microtox 检验[37] .虽然 Microtox 方法对大范围
的化合物毒性检测表现出快速、可重现性高和灵敏
等优点[42-43],但应用于土壤毒性诊断还存在一些不
足,例如 Microtox 对样品的 pH 范围要求严格(6 ~
8),但这样会改变样品中污染物的形态,且检测期
间发光强度本底值差异较大,发光变化幅度宽,从而
影响毒性的测定[50] .
1郾 4郾 3 大型蚤毒性试验 摇 大型蚤对大多数毒物敏
感,是孤雌生殖,且繁殖周期短,培养方便,分布广
泛,是国际上普遍应用的标准毒性试验生物[51-53] .
目前,大型蚤(Daphnia magna)是一些国际组织(如
OECD及 ISO)正式签署的唯一一种用于毒性试验
的淡水无脊椎动物. 国外已有研究将大型蚤毒性试
验应用到土壤污染诊断中,研究的指标有死亡率、繁
殖率和运动抑制率,其中繁殖率和运动抑制率对重
金属污染土壤的水提液有较高的敏感度[54-55] . 但
是,利用蚤类死亡率作测试指标,虽然试验现象直
观,易观察,但测试灵敏度低,试验时间长.近年来,
一些学者发现采用生理或行为上的变化(如捕食行
为、趋光行为等)作为毒性指标可以缩短试验时间,
提高灵敏度,达到早期预报目的[53-56] . 然而目前的
研究关于污染胁迫对大型蚤新陈代谢系统的影响了
解甚少,以后应更深入研究有关大型蚤的中间代谢
及各种酶对毒物的效应及与种群间的关系.
2摇 土壤污染生态毒理学分子诊断方法
2郾 1摇 生物标记物
传统生物检测技术所采用的指标,大多只能反
映污染物在个体、种群、生态系统水平上的毒性效
应,存在耗时较长、个体差异较大、外推不明确等局
限性.作为目标污染物对生物早期危害效应的信号、
参数,生物标记物可以在个体、细胞、分子等不同水
平上对污染物的毒性进行预报和预测.
2郾 1郾 1 转化酶类摇 有研究表明,生物转化酶类的水平
和活性的变化是最敏感的效应性生物标记物[4] .两大
类酶在土壤污染物的生物转化过程中起重要催化作
用,其中 I阶段酶是指微核单加氧酶(MO),又称混合
53729 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘摇 凤等: 土壤污染的生态毒理诊断研究进展摇 摇 摇 摇 摇
功能氧化酶 (MFO),主要包括细胞色素酶 ( cyt
P450)、芳烃羟化酶(AHH)、 7鄄乙氧基鄄异吩恶唑酮鄄脱
乙基酶(EROD) 等.其中,cyt P450 几乎存在于所有
物种体内,对多种污染物尤其是有机物暴露反应敏
感[57-58],因此是毒理学有价值的生物标记物.
II阶段酶又称结合酶,通常是外源化合物与大
分子量的极性化学基团或化合物的共价结合,如
UDP鄄葡萄糖醛基转移酶、硫转移酶和谷胱甘肽转移
酶等.这些酶的存在有助于将含有极性基团的化合
物排出生物体外.然而与第一阶段酶相比,第二阶段
酶在污染胁迫下的诱导反应相对较弱,且容易被个
体和自然多样性(如年龄、季节、温度等)所干扰.
2郾 1郾 2 代谢产物类摇 代谢产物也可以作为生物标记
物诊断和评价土壤毒性,如生物体内代谢物浓度的
增加或代谢物与蛋白质、RNA 和 DNA 等生物大分
子形成的共价加合物. 其中,DNA 加合物与癌变发
生的多个过程有关,具有底物专一性、预警性和广泛
适用性,能指示出与毒性机理密切相关的毒性动力
学的变化及不同程度的生物学结果及遗传变异后
果,直接揭示有毒物质在分子水平上的作用,因此可
以作为生态毒理学的相关终点[59] .
2郾 1郾 3 抗氧化防御类摇 土壤污染物对生物体产生氧
化胁迫会导致酶失活、脂肪过氧化以及 DNA 损
伤[60] .其中脂肪过氧化是研究最为广泛的一种活性
氧引起的组织损伤,但是由于直接测定内源脂肪过
氧化产物很复杂,大多数方法是测定二级氧化产物
(如醛类和酮类)的水平.丙二醛(MDA)与膜脂过氧
化过程密切相关,其含量与污染物存在明显的剂量鄄
效应关系.另外,8鄄OH鄄dG和 8鄄oxodG及其自由基 8鄄
羟基鸟苷被广泛用作直接指示嘌呤和嘧啶专性修饰
和羟基化以及磷酸脱氧核糖基和蛋白鄄DNA 交联损
伤,因此用作氧化胁迫 DNA损伤的生物标记[61] .蛋
白质氧化的生物标记物主要是蛋白质的羰基衍生
物,尤其是苯丙氨酸和酪氨酸的氧化产物.
此外,抗氧化保护系统中的酶类,如过氧化氢酶
(CAT)、超氧化物歧化酶 ( SOD) 和过氧化物酶
(POD)等,非酶抗氧化小分子量的物质如维生素 C
和 E、尿酸、蜡质物、茁鄄胡萝卜素、谷胱苷肽等,它们
含量的维持和提高,是生物体耐受污染胁迫的物质
基础之一,这些毒理学指标可以作为指示污染土壤
毒性的敏感生物标记物[62-63] .
2郾 1郾 4 胁迫蛋白质类摇 一些生物大分子也能对氧化
胁迫产生灵敏反应.如应激蛋白(HSP)也称为热休
克蛋白,能维护体内代谢的平衡,在外源胁迫下也能
够被激活,加速变性蛋白的降解或修复过程,是反映
环境污染程度的生物标志物. 根据其分子量可分为
4 个家族,其中 HSP70 家族序列最保守并且对污染
物的应激反应最为显著[8] .另外,金属硫蛋白(MT)
具有较长的保留时间,其浓度不仅可以表征急性毒
性,还可以反映污染物长期作用的累积情况和动态
过程,具有维持细胞金属含量动态平衡和重金属解
毒作用双重机制,可以对多种重金属污染胁迫作出
诊断[64-66] .
2郾 1郾 5 神经肌肉类摇 胆碱酯酶是关注最多的神经肌
肉型指标,有两类:一类是乙酰胆碱酯酶(AChE),
参与神经末梢抑制乙酰胆碱的活性,阻止神经信号
的传递,因此对维持感受体和神经肌肉系统的正常
功能十分重要;另一类是丁酰胆碱酯酶(BChE),被
称为非专性酯酶或拟胆碱酯酶. 研究发现,AchE 对
有机磷农药和氨基甲酸酯类农药具有较高的专一性
和敏感性,是得到广泛认可和应用的生物标志物.因
此,有学者运用酶工程技术,将 AchE 制成生物传感
器特异性地检测农产品和环境中的有机磷农药[67] .
2郾 1郾 6 内分泌干扰类摇 环境中普遍存在的内分泌干
扰物(如雌激素)常常引起人类和动物的生殖障碍、
出生缺陷、发育异常、代谢紊乱和癌症的发生,因此
其毒理学研究受到广泛的关注. 卵黄原蛋白(VTG)
水平的异常可指示生物体受到的雌激素暴露. 有研
究以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物做了有益的
尝试,结果发现,在一定范围内环境雌激素与 VTG
具有很好的剂量鄄效应关系[68] .此后,有学者又开发
出了许多针对其他物种的卵黄原蛋白的 ELISA 方
法(酶联免疫吸附法) [69-70] .这为进一步探索指示土
壤环境中内分泌干扰物毒性效应的生物标志物提供
了可能.
2郾 1郾 7 溶酶体中性红保持时间 摇 在亚细胞水平上,
溶酶体系统是污染物质的特殊靶标. 中性红染色技
术能够有效评估细胞毒害效应.在某些生理条件下,
中性红染料能渗透进入溶酶体膜,当生物体受到环
境胁迫时,其溶酶体膜受到损伤并失去稳定性,染料
渗透到细胞质中. 因此,溶酶体中性红的保持时间
(NRR)可反映生物对土壤污染毒性响应.该技术被
广泛应用于土壤污染监测[71-73] .
2郾 1郾 8 组学和新生物标志物的高通量筛选摇 有研究
对不同毒性测试终点进行比较,证明了在基因水平
上的毒性响应是最敏感的[74] .这种观点也为遗传工
具(基因组学、蛋白质组学和转录组学等)在毒理学
领域的应用及发展奠定了基础. 组学的发展使得高
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通量筛选生物标志物成为可能. 通过研究暴露在污
染胁迫下生物体的基因组、转录组、蛋白质组产生的
变化,我们可以得到多个响应基因(蛋白质)的变
化.运用生物信息学方法可以更容易地从海量的表
达数据中筛选出对污染物产生特异响应的一组蛋白
质(基因),并达到较高的准确率.
由于全基因组测序费用昂贵,为了较全面地获
得基因对有毒物质的响应信息,人们采用转录组学
方法来获得受试生物在外源胁迫下的表达响应谱.
如有许多学者应用蚯蚓、线虫和跳虫开展了大量转
录组研究工作,构建了大量不同生长状态、不同污染
物暴露下的 cDNA 文库,测序并得到了大量表达序
列标签(EST)的序列,并对其进行基因功能的注
释[75-78] .此外,污染产生的胁迫通常直接作用于蛋
白质,且功能性蛋白质是产生响应的真正执行者,因
此监测响应蛋白质的水平能准确直接地反映生物体
所受的胁迫.除了序列外,蛋白质的三维结构也对其
生物功能起决定性作用. 很多研究开展了蛋白质组
学方法筛选生物标志物的工作[79] . 除了基因组学、
蛋白质组学和转录组学外,代谢组学是一个很有前
途的毒理诊断工具,通过对外源胁迫下生物体内小
分子代谢物(糖、氨基酸等)的变化的定量测量,有
效地评估生物有效性和污染物毒性效应. 在以前的
研究中,多用受试动物半数死亡的毒物浓度(LC50)
来表征胁迫阈值[80],然而关于不会产生致死效应的
低浓度污染物的毒性研究较少. 代谢组学可以用于
检测浓度低于 LC50数值的污染物的毒性效应,为进
一步研究生物体代谢水平上的毒性响应和污染物暴
露之间的相互关系奠定了基础[81-83] .
然而,基因表达(转录组学)和基因功能(蛋白
质组学)之间的联系往往是很复杂的,毒物诱导的
基因表达变化的内在机制仍不清楚,目前,仅有关于
少数物种(如线虫、跳虫和赤子爱胜蚓 Eisenia foeti鄄
da)的基因表达分析的研究,基因表达背景信息的
缺乏,限制了基因表达分析这一遗传诊断工具更广
泛的应用.
2郾 2摇 土壤污染分子毒性诊断方法
在环境检测中应用生物标记需要对生物反应机
制有很好的理解,同时必须要注意在没有经过反复
试验的基础上,不能快速无选择地使用生物标记法.
且很多污染物并无特异性的生物标志物,而筛选新
的生物标志物需要耗费大量工作. 很多研究者另辟
蹊径,用生物监测和分子诊断的方法进行研究和实
践探索.
2郾 2郾 1 Ames 试验摇 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella ty鄄
phimurium)是组氨酸营养缺陷型(his鄄)菌株,在含微
量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细
胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到
的微菌落.受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突
变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落. 常规
的 Ames 试验选用 4 个测试菌株 ( TA97、 TA98、
TA100、TA102),目前出现的新生菌株具有更高的特
异性,如引入乙酞转移酶基因的 YG1024、YG1029
菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高
100 倍以上.该法比较快速、简便、敏感、经济,且适
用于测试混合物毒性,反映多种污染物的综合效
应[84] .随着计算机模拟技术的发展,有学者已经建
立了一种新的公共 Ames 突变性物质数据集,其中
囊括了 6500 种常见的污染物,提高了 Ames 试验数
据预测致突变物质的效率[85] .
2郾 2郾 2 单细胞凝胶电泳(SCGE) 摇 单细胞凝胶电泳
又称彗星试验技术(comet assay),其原理是:受损伤
而断裂的核 DNA 在琼脂糖电泳时有较快的迁移率,
将细胞进行裂解后进行电泳,通过染色和显微拍照
能够看到损伤引起的 DNA 片段在细胞核后方形成
一个类似彗尾的形状,细胞核则像彗星的彗核.通过
对 DNA 损伤引起的彗星尾矩和尾长作为指标可以
较好地表达遗传毒性物质基因损伤的剂量鄄效应关
系.该试验技术可以在基因发生修复之前,快速地检
验 DNA损伤程度,而不需要等到有丝分裂才开始进
行,对遗传物质损伤的检测更为灵敏,因此得到越来
越广泛的应用[86-88] .
2郾 2郾 3 DNA指纹技术摇 RAPD(random amplified poy鄄
morphic DNA)是目前关注较多的一种 DNA 指纹技
术.该技术随着聚合酶链式反应(PCR)技术的飞速
发展而得到了广泛的应用,通常以 10 碱基的寡核苷
酸序列为引物,对基因组 DNA随机扩增来鉴别遗传
物质多态性[89-90] . 如 Theodorakis 等[90]研究了核素
污染对蚊鱼(Mosquitofish)的 DNA 损伤效应,发现
暴露组的某些 RAPD 谱带出现频率很高. 这些谱带
被称为污染指示带(CIBs). 且 southem 杂交分析结
果发现,污染胁迫下不同物种(鱼、鸥、人)的 CIBs
是一致的,表明 RAPD 谱带变化在污染土壤的生态
毒理诊断和评价中具有重要的预警作用.
2郾 2郾 4 基因芯片技术摇 基因芯片可以减少毒性试验
对受试生物的依赖,使用更接近于人类暴露的毒物
剂量进行试验,能更客观、真实地检测污染物对人体
基因表达产生的效应. 该技术已在毒理诊断领域得
73729 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘摇 凤等: 土壤污染的生态毒理诊断研究进展摇 摇 摇 摇 摇
到广泛应用,研究多集中于受试生物对污染物的毒
性响应,对于评价污染土壤的生物毒性具有重要的
应用价值[91-95] .通过暴露时间与基因表达谱图相关
性的研究,基因芯片可用于研究急性与慢性毒性之
间的相关性和确定毒物的其他作用. 一些研究者将
基因芯片技术应用于毒性机制和毒性预测研究[96] .
2郾 2郾 5 报告生物体(bio鄄reporter) 摇 一些有毒污染物
能引起特定基因的激活响应,将该响应基因的调控
区 DNA 与报告基因的编码区 DNA人工重组成为一
个新的基因.通过基因工程改造,含有人工基因的细
菌或细胞就是报告生物体. 一旦报告生物体受到污
染物胁迫,激活了报告基因的启动子,就能够启动报
告基因的表达,使报告生物体发出荧光信号.荧光信
号可以用流式细胞仪或者荧光显微镜来检测. 报告
生物体比表面积大,能够自我繁殖,价格低廉,适合
用于环境监测.基于报告基因 lux和 gfp的光学微生
物传感器已被广泛应用于监测土壤污染[97-98] .
2郾 2郾 6 ELISA方法摇 ELISA 法的测试原理是抗体与
酶复合物的特异性结合,然后通过显色来检测信号.
有研究者开发出一些大分子蛋白 ( cyt P450、MT、
VTG等)的响应蛋白相应的 ELISA 方法. 针对没有
特异性响应蛋白的污染物,可通过化学的方法合成
半抗原,用 ELISA 对污染物本身进行测定. 因为其
特异性和灵敏性,近年来 ELISA 法已经被应用于环
境污染检测[99-100] . 但目前为止对污染物产生特异
性响应的蛋白质还不多,抗体和半抗原的制备也较
为繁琐,因此 ELISA法的应用收到了一定的限制.
3摇 土壤生物的解毒机制
土壤污染物对生物有毒害作用,但是生物对污
染物又有一定的抗性和解毒作用. 两者间相互作用
的研究将会为环境污染评价及生物净化提供理论依
据,这些信息可用于污染物生物有效性评价[101] .当
前,研究人员对生物与重金属作用的机理已有较为
广泛的研究,但对于土壤生物对有机物的解毒机制
研究较少.
3郾 1摇 重金属类毒物
土壤生物具有一系列潜在忍耐和解除重金属毒
性的细胞机制和分子机制. 这些机制包括解毒机制
及后来对重金属胁迫的耐性. 其途径主要有:1)生
物排泄、吸附以及细胞外的沉淀和结晶作用[102-103],
比如植物通过菌根化、细胞壁吸收及根系分泌物的
螯合作用减少根系吸收重金属进入细胞质,动物能
通过消化系统和排泄系统将重金属排出体外,而微
生物通过静电吸附和表面各种官能团的络合作用对
重金属进行富集,也可以通过染色体或质粒编码主
动运输方式,将重金属从胞浆中排出[104-105];2)对过
量重金属的储存,比如许多真核微生物细胞能把重
金属离子累积于细胞内的某些特殊细胞器中[106];
3)细胞内的隔离作用和解毒作用.比如植物和动物
摄入过量重金属离子可诱导 MT、HSPs 和一些金属
结合蛋白的大量表达,MT 能够结合体内过量的必
需金属和有毒重金属,限制中毒作用[107];4)金属的
转化.通过氧化、还原、甲基化和去甲基化作用对重
金属进行转化,将重金属转化为无毒或低毒状
态[108-109] .
3郾 2摇 外源有机物
近年来,关于生物对有机物解毒机理研究主要
包括两方面:1)通过分子生物学手段对微生物解毒
基因的研究,例如通过对微生物石油烃降解质粒的
序列分析,发现了辛烷质粒 ( OCT 质粒)、萘质粒
(NAH质粒)等一些特异性的质粒,由此证明低温微
生物降解石油烃的功能基因主要存在于线粒体或质
粒上[110];2)针对不同结构的有机物污染,研究其解
毒途径及降解产物. 外源化学物最终的毒性与 I、II
阶段酶的诱导以及生物活化和解毒反应之间的平衡
有关.大多数的有机化合物进入机体后,都要经过 I
相反应和 装相反应. I 相反应是使进入机体的非极
性化合物产生带氧的极性基团,从而使其水溶性增
加以便于排泄,同时也改变了原有的功能基团或增
加了新的功能基团(如鄄OH、鄄SH 和鄄NH 等),使毒物
解毒或灭活. 装 相反应是指内源性分子如糖、氨基
酸等与外源化合物经过 I相反应后产生或暴露出来
的极性基团或外源化合物本身就具有的极性基团结
合,形成低毒而易排出体外的产物,这是代谢有机物
的一般形式[4] .
土壤生物的污染物耐性一直是土壤污染,尤其
是重金属污染研究中的重要课题.然而,不同生物避
免污染物积累的机理不同.对于一种污染物质,可能
有多于一个解毒或耐受的途径. 没有一个统一机理
可以解释各种各样的污染物的耐性. 今后对其耐性
机理的深入研究可以从横向和纵向两个层面同时进
行.横向系统的研究应全面考虑污染物在细胞内的
活动(如利用放射性同位素标记加强生物体内各种
生理生化代谢途径对污染胁迫下的适应性反应的研
究),探明污染物的耐性机制,从而获得较高的耐性
和富集水平的生物;纵向研究方面,运用分子生物学
和分子遗传学的技术手段,加强对不同生物体污染
8372 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
耐性型和敏感型突变体筛选,以及与耐性相关新基
因分离、克隆和功能鉴定的研究.而只有彻底了解生
物耐性机理,才能为研究生物的耐性关键因子提供
理论指导.
4摇 土壤污染生态毒理学发展展望
4郾 1摇 低剂量长期监测
在过去研究中,土壤复合污染的毒性效应以及
土壤毒物与其他胁迫因子(如温度和水分等)相互
作用引起了高度重视[11,111] . 此外,对于新兴及新合
成的化学物的毒理学测试方法(例如以蚯蚓、弹尾
类、等足类动物作为模式生物检测纳米材料的毒性
效应),也成为人们关注的焦点[111-115] .
目前土壤毒物大都呈现低剂量长期暴露的特
点.越来越多的证据表明,即使低水平的污染也会对
生态系统健康产生潜在的影响,对土壤生物产生毒
性效应.因此对土壤体系中少量或微量的污染物进
行长期监测和风险评价,正成为土壤毒性诊断研究
的重点[116-117] .毒理学试验中最困难的是预测浓度
低、维持时间长的非致死的、中间差异的污染毒害效
应.目前的研究趋势是采用生命周期最易受感染的
阶段(如萌芽、胚胎与幼虫)进行试验,提高测试灵
敏度,缩短周期.
4郾 2摇 生态毒理基因组学(Ecotoxicogenomics)
生态毒理基因组学是探索化学物质毒性效应的
分子机制的有效工具,为生物体对污染物的耐受性
研究提供了崭新的视角[118-120] . 在生态毒理基因组
学研究领域中,群落和种群基因组学可以为不同的
地域物种的组成以及与环境污染潜在的关系研究提
供新的思路.基因组扫描可以提供暴露于污染土壤
中的特定物种多代基因变化的信息.因此,有些学者
预言生态毒理组学可以架起基因和种群相互联系和
作用的桥梁[119-120] .
从长远来看,组学的研究,尤其是与毒代动力学
和毒效学数据相结合进行分析,会为跨物种外推以
及毒性诊断新模型的构建奠定基础. 组学工具为解
开化学物质长期毒性影响的原因提供了可能,例如,
多代毒性效应可能是早期损伤世代积累的结果. 但
探索和发现与背景条件、外源和内源毒性暴露、生态
毒性测试终点相关的大量的基因表达图谱信息是组
学得以发展的前提[78] .
4郾 3摇 多指标评价体系
采用单一受试生物或单一生物指标不能对土壤
毒性进行全面评价,因此可以开展应用多种生物测
试和微宇宙试验(又称模拟生态系统试验,micro鄄
cosm),微宇宙具备生态系统结构和功能,研究化学
毒物的迁移、转化、归宿的机理以及化学毒物对生态
系统的结构、功能的影响,以此评价污染物在生态系
统水平上的整体生态效应[121-122] .
由于不同的生物指标对同一种土壤毒物的敏感
性不同,且同一种生物对不同的污染物也会产生不
同的毒性响应,采用同一营养级的多指标生物测试
(multispecies bioassay)以及不同营养级的成组生物
测试(battery bioassay)检测土壤毒性,成为目前土壤
生态毒理诊断的发展趋势[122] .
4郾 4摇 生物有效毒性
在环境污染物毒性评价中,污染物对生物体产
生的毒害作用取决于化合物的生物有效性而非污染
物总量[123],化学物的自由溶解态浓度能够比总浓
度更为准确地评价污染物的生物有效性[124] .但是,
基于形态可给性基础之上的自由溶解态方法还需要
通过生物方法来进行验证和校正.
为了更好地实现实验室测试外推到野外和不同
类型土壤的毒性诊断,了解生物体内的化学物质的
吸收途径至关重要. 这也是今后的工作重点. 此外,
由于污染物进入生物体内后,只有到达靶作用位点
的那部分才被认为是毒理学有效的, 因此生物有效
性还取决于毒代动力学过程,如靶位点和非靶位点
间的分配、特定组织内的代谢、排泄等特性[125] .
4郾 5摇 建立毒性预测模型
目前,已经有多种模型可以应用于预测生物效
应和毒性终点. 定量结构与活性相关(QSAR)通过
数学模型建立污染物的毒性和理化参数的相关性,
通过测量或计算污染物的特征参数估算污染物对生
物毒性.运用 QSAR 模型已成功地对许多化合物的
生物活性、毒性等参数进行预测、评价和筛选[126] .
此外,基于物种敏感性分布法(SSD)量化污染物的
生态风险进而推导出浓度阈值,目前制定基于风险
的环境质量基准已成为国际趋势[127-128] . 该方法不
仅体现了物种敏感性差异,还可建立特定场地(site鄄
specific)的标准限量值[129],对于高度异质性的土壤
尤为重要.但是在基于 SSD 法建立土壤环境质量基
准过程中,需要利用毒性预测模型对来自不同土壤
性质的毒理学数据进行归一化,以消除土壤性质差
异的影响,提高物种敏感性分布及环境质量基准值
的准确性[128] .
4郾 6摇 联合分析技术
化学鄄生物或物理鄄生物联合分析成为土壤整体
93729 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘摇 凤等: 土壤污染的生态毒理诊断研究进展摇 摇 摇 摇 摇
质量评价及土壤生态毒理诊断的发展趋势. 如电子
顺磁共振(EPR)鄄自旋捕集技术克服了生物体内自
由基半衰期短的限制,能够对重金属胁迫下植物细
胞内的 O2
-·自由基进行定性和定量分析,已广泛应
用于植物体内氧自由基的直接检测[8] . 此外,有研
究表明,核磁共振谱(NMR)能够有效探索新生物标
志物,生物核磁共振谱能够对多种复杂的生物相
(如生物活组织、体液和组织浸出物等)中所发生的
生物化学过程进行检测,因而受到了更多的关注.一
些开创性土壤毒理学研究使用 1H核磁共振(NMR)
代谢组学技术来评估蚯蚓对污染物(如多环芳烃、
多氯联苯、重金属、农药等)的毒性响应[14-16,81] .
总之,土壤污染生态毒理诊断集合了土壤污染
的全部信息,提供了土壤中污染物对不同生物的整
体毒性效应,为污染土壤诊断提供方法论.建立和完
善国际及国家毒理学诊断标准以便按照统一的标准
判定和比较诊断结果,成为土壤污染生态毒理研究
的必然趋势.
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作者简介摇 刘摇 凤,女,1987 年生,硕士.主要从事环境毒理
学研究. E鄄mail: liufengkelvina@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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