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镉胁迫对拟南芥MMLLHH11基因启动子甲基化的影响



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 298~304298
收稿 2010-12-09  修定 2011-01-16
资助 国家自然科学基金(20977095, 31070448)和中国科学院陆
地生态过程重点实验室开放课题。
* 通讯作者(E-mail: liuwan63@hotmail.com; Tel: 024-
83970367)。
镉胁迫对拟南芥MLH1基因启动子甲基化的影响
单存海1, 钟鸣1, 刘宛2,*, 郭志富1, 牛建双1, 周启星2,3
1沈阳农业大学生物科学技术学院, 沈阳110866; 2中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳110016; 3南开大学环境科学与工程
学院, 天津300071
摘要: 采用重亚硫酸盐测序和结合重亚硫酸盐限制性分析技术研究了镉(Cd)胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因MutL-homo-
logue 1 (MLH1)启动子甲基化的影响, 并结合幼苗的形态和生理指标, 筛选Cd胁迫敏感的生物标记物。结果表明: 不同浓度
(0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1) Cd处理3 d对幼苗叶片数、地上部鲜重、地上部叶绿素含量影响不大, 根长和地上部可
溶性蛋白质含量随Cd浓度的增加较对照显著降低(P<0.05), 幼苗MLH1启动子甲基化水平随Cd浓度的增加较对照明显上
升。以上结果表明, 基因MLH1启动子甲基化的变化可作为检测Cd污染对植物遗传毒性效应潜在的、有用的生物标记物。
关键词: Cd; MLH1; 生物标记物; 启动子; 甲基化
Effects of Cadmium Stress on MLH1 Promoter Methylation in Arabidopsis
thaliana
SHAN Cun-Hai1, ZHONG Ming1, LIU Wan2,*, GUO Zhi-Fu1, NIU Jian-Shuang1, ZHOU Qi-Xing2,3
1College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2Institute of Applied
Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China; 3College of Environmental Science and Engineering, Nankai
University, Tianjin 300071, China
Abstract: Using bisulfi te DNA sequencing and combined bisulfi te restriction analysis technique, effects of cad-
mium (Cd) stress on methylation of MutL-homologue 1 (MLH1) promoter of mismatch repair gene of Arabi-
dopsis thaliana seedlings were studied and linked to morphological and physiological indices, aimed to choose
the biomarkers sensitive to Cd stress. The results indicated that under Cd (0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1)
stress for 3 days, no signifi cant changes were observed in leaf number, fresh mass and chlorophyll content of
aerial parts. Compared with the control, root length and total soluble protein content of aerial parts decreased
signifi cantly with increasing Cd concentration (P<0.05), MLH1 promoter methylation of seedlings was general-
ly increased with increasing Cd concentration. The above results suggested that specifi c methylation of MLH1
promoter could serve as the potential and useful biomarker for the detection of genotoxic effects of Cd pollution
on plants.
Key words: Cd; MLH1; biomaker; promoter; methylation
Cd是土壤中主要的污染物之一, 它能够在植
物体内累积, 并通过食物链危及人类健康。由于
它具有较强的生态学毒理效应, 所以, 对Cd污染土
壤的早期诊断和防治已经引起国内外的广泛重视
(张巧丽等2008)。
基因的修复途径对抑制机体突变的发生和积
聚具有重要作用。多蛋白参与的错配修复(multi-
protein mismatch repair, MMR)系统是机体进行
DNA修复的一种关键机制(Mohamed 2006)。真核
生物MMR系统主要为MutS、MutL (MLH1、
MLH3)两种同系物。MLH1是参与DNA损伤修复
和重组机制的重要组分(Yu等1999; Jonsson等1998;
Yamamoto等2005)。Kane等(1997)研究发现, MMR
系统中hMLH1基因启动子区CpG岛(CpG islands)
高甲基化(hypermethylation)可抑制hMLH1基因的
功能, 而且hMLH1基因表达缺失或降低与hMLH1
启动子区高甲基化密切相关。Herman等(1998)研
究证明, 人类hMLH1启动子区高甲基化是指示散
发性结直肠癌形成的表观遗传生物标记物(epige-
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2011.03.016
单存海等: 镉胁迫对拟南芥MLH1基因启动子甲基化的影响 299
netic biomarker)。Yu等(2004)证实了hMLH1 CpG
岛甲基化的改变可以诱发人体星形细胞瘤的发
生。有关植物基因组胞嘧啶(cytosine)甲基化的研
究亦有报道, 多与基因水平的功能调节或逆境胁
迫下的变化差异有关, 例如拟南芥基因组DNA甲
基化的模式研究和功能分析(Zilberman等2007;
Cokus等2008; Henderson等2010); 铬胁迫诱导白菜
幼苗细胞内DNA甲基化水平明显上升(Labra等
2004)。而从MMR系统入手, 研究植物幼苗MLH1启
动子区甲基化变化情况, 看其在Cd胁迫下是否对污
染土壤具有早期预警作用, 目前国内外尚未见报道。
本试验采用重亚硫酸盐测序(bisulfite DNA
sequencing, BS)、结合重亚硫酸盐限制性分析
(combined bisulfi te restriction analysis, COBRA)技
术, 研究了Cd污染胁迫下拟南芥MLH1基因启动子
甲基化的变化情况, 并与其他形态和生理指标进
行比较, 筛选对Cd敏感的生物标记物, 旨在对土壤
中Cd污染程度进行早期预警和诊断, 为污染土壤
修复效果的质量评价提供科学依据。
材料与方法
1 供试材料
供试拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为哥伦比
亚生态型(Columbia ecotype)。幼苗的培养参照张
巧丽等(2008)文中的方法, 采用MS液体培养基培
养 , 培养7 d后 , 加入Cd母液 , 使Cd浓度为0、
0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1, 每组重复5次。整个
过程在摇床内进行, 温度24 ℃, 光暗周期15 h/9 h,
光强60 µmol·m-2·s-1。Cd胁迫培养3 d后, 取出幼苗
置于干净培养皿内, 用双蒸水清洗数次, 并用滤纸
片轻轻吸去植物表面残余水分, 然后从每组样品
中随机抽取相同数量的新鲜幼苗, 用于形态和生
理指标的测定, 余下部分用手术刀片切除根部, 保
留茎和叶部分, 液氮冷冻后置于−80 ℃冰箱保存。
试验所用Cd由CdCl2·2.5H2O分析纯试剂(纯
度>99.9%)配制, 配成1 g·L-1母液。
2 试验方法
取不同浓度Cd处理3 d后的幼苗各20株, 分别
测量其叶片数、地上部鲜重和根长。根长抑制率
按下式计算: 抑制率(%)=(1−x/y)×100。式中, x为
各组幼苗初生根平均根长, y为对照组幼苗初生根
平均根长。幼苗地上部可溶性蛋白质含量测定参
照Bradford (1976)的方法。叶绿素含量测定采用
丙酮乙醇浸提法(张宪政1989)。
以CTAB法提取拟南芥幼苗基因组DNA (钟鸣
和马慧2008)。基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰参
考Frommer等(1992)经典修饰方法。根据拟南芥信
息资源库(The Arabidopsis Information Resource,
TAIR)中MLH1基因(GenBank登录号: AT4G09140)
转录起始点上游序列, 使用Methyl Primer Express
v1.0软件设计甲基化特异性引物, MAPF: 5 ATTG-
TGAATGAAAAGTTGATTTTTAAT 3; MAPR: 5
ACCCAATTAAATTCTAAAAACCC 3。以修饰后
的基因组DNA为模板, 以MAPF、MAPR为上下游
引物进行PCR扩增。反应程序为: 94 ℃预变性3
min; 94 ℃ 30 s, 47 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 循环32次;
72 ℃终延伸10 min。
将上述PCR产物经Anygen DNA凝胶回收试
剂盒回收, 与pGM-T载体(Tian Gen公司)连接、转
化, 阳性克隆送北京天跟生化科技有限公司进行
测序。利用DNAMAN软件对测序结果进行多序
列比对分析。
COBRA法所需限制性核酸内切酶的种类及
能够被用来分析的CpG位点, 通过MethMarker软件
分析获得(Boyko和Kovalchuk 2010)。本试验选用
的限制性核酸内切酶SalI、TaqI、EcoRV购自Ta-
KaRa公司, Hpy99I购自NEB公司。消化后的样品
用3%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
3 数据分析
采用SPSS18和Excel 2003对数据进行处理, 数
据表示为平均值±标准差。
实验结果
1 Cd胁迫对拟南芥幼苗叶片数、地上部鲜重和根
系生长的影响
从表1可见, 0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1
Cd胁迫处理3 d后, 拟南芥幼苗叶片数未发生变化,
均长出6片叶子。Cd胁迫使幼苗地上部鲜重较对
照微弱增加 , 但各处理与对照相比差异不显著
(P>0.05)。幼苗的根长随着Cd浓度的提高, 生长受
到了明显的抑制(P<0.05), 当Cd为3.0 mg·L-1时, 幼
苗的平均根长为2.4 cm, 约为对照的1/3。
植物生理学报300
2 Cd胁迫对拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质和叶
绿素含量的影响
不同浓度Cd胁迫3 d后, 拟南芥幼苗地上部可
溶性蛋白质含量及其变化趋势见表2。和对照相
比, 幼苗的可溶性蛋白质含量随着Cd浓度的升高
呈现出显著降低的变化规律(P<0.05)。当Cd浓度
增加到3.0 mg·L-1时, 其含量约为对照的40%。随着
Cd浓度的增加, 地上部叶绿素a+b的含量也出现了
微弱的下降, 但各处理与对照相比差异并不显著
(P>0.05)。
3 Cd胁迫对拟南芥MLH1基因启动子甲基化水平
的影响
以甲基化特异性引物MAPF和MAPR为上下
游引物, 以修饰后的幼苗基因组DNA为模板进行
PCR反应, 所得的405 bp扩增片段经克隆测序得知,
其含有11个可发生甲基化的CpG位点(图1、图
2-A)。从图2-A和2-C可见, 小剂量的金属Cd能够
使拟南芥错配修复基因MLH1启动子甲基化水平
发生变化, 且两者呈现出一定的正相关剂量-效应
关系, 浓度为0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1 Cd处理
3 d所对应的甲基化率分别为9.1%、18.2%、
27.3%、45.5%。图2-B为各处理经修饰后的特异
性扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
将上述PCR反应获得的甲基化特异性扩增产
物经纯化回收后, 分别取等量作为底物, 用选定的
4种对甲基化的CpG位点敏感的限制性核酸内切酶
对5组样品进行消化, 通过分析酶解情况来检测特
定位点是否发生甲基化。从图3中可以看出, 不同
浓度Cd胁迫处理下, 除了EcoRV对应的CpG位点均
未发生甲基化(图3-B)外, 其他3种限制性核酸内切
酶SalI、TaqI、Hpy99I所对应的CpG位点均发生部
分甲基化(图3-A、C、D), 其中SalI、TaqI识别的
表1 不同浓度Cd胁迫3 d对拟南芥幼苗叶片数、地上部鲜重和根长的影响
Table 1 Effects of different concentrations of Cd on leaf numbers, fresh weight of aerial parts and root length of
A. thaliana seedlings for 3 days
Cd浓度/mg·L-1 叶片数/片 幼苗地上部鲜重/mg
幼苗根系
根长/cm 抑制率/%
0 6 33.52±0.04a 7.35±0.18a 0
0.125 6 34.99±0.09a 6.05±0.18b 17.69
0.25 6 36.47±0.04a 5.01±0.11c 31.84
1.0 6 36.97±0.06a 4.03±0.15d 45.17
3.0 6 36.99±0.08a 2.35±0.31e 68.03
  同列数字不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
表2 不同浓度Cd胁迫3 d对拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白
质和叶绿素含量的影响
Table 2 Effects of different concentrations of Cd on total
soluble protein and chlorophyll contents of aerial parts of
A. thaliana seedlings for 3 days
Cd浓度/mg·L-1 可溶性蛋白质含量/mg·g-1 叶绿素a+b含量/mg·g-1
0 8.87±0.03a 0.78±0.02a
0.125 7.99±0.02b 0.76±0.05a
0.25 7.23±0.04c 0.73±0.03a
1.0 5.35±0.09d 0.72±0.08a
3.0 3.83±0.14e 0.66±0.03a
  同列数字不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
图1 拟南芥MLH1启动子CpG位点分布和COBRA法可选择
的限制性核酸内切酶种类
Fig.1 The CpG sites distribution of MLH1 promoter of A.
thaliana and the type of restriction endonuclease
selected for COBRA
CG: 可用来分析的CpG位点; CG: 目前尚无核酸酶能够识别
的CpG位点。
单存海等: 镉胁迫对拟南芥MLH1基因启动子甲基化的影响 301
位点和Hpy99I能够识别的首个位点在序列中的位
置相同。图3-D中, 对照样的酶切结果中含有353
bp大小的切割片段, 不含226 bp大小的切割片段,
而胁迫样均含有这两个片段, 参照图4-C Hpy99I对
图2 重亚硫酸氢盐测序结果分析
Fig.2 The analysis of bisulfite sequencing
A: 甲基化的CpG位点在整个启动子区域的分布情况。其中, Contrast为参照, Map0、Map1、Map2、Map3、Map4分别代表Cd浓度为
0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1胁迫样品, 未发生甲基化的CpG用“○’”表示, 反之用“●”。B: 各个样品修饰后的特异性扩增结果。1~5号泳
道分别为0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1胁迫样品, M为D2000。C: 5组样品启动子甲基化随Cd浓度变化的比率。
图3 拟南芥MLH1基因启动子甲基化特异性扩增产物限制性酶解检测
Fig.3 Determination of COBRA for the methyl-specific amplified products of MLH1 promoter of A. thaliana
A: 甲基化特异性扩增产物被SalI酶解消化; B: 甲基化特异性扩增产物被EcoRV酶解消化; C: 甲基化特异性扩增产物被TaqI酶解消化;
D: 甲基化特异性扩增产物被Hpy99I酶解消化。其中标有浓度的泳道为0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1 Cd胁迫下的底物对照, 标有酶的
泳道即为不同底物下该酶的酶解情况。电泳使用3%琼脂糖凝胶, M为50 bp DNA Ladder marker。
植物生理学报302
MLH1启动子的理论酶解分析可以看出, Cd诱导了
拟南芥MLH1启动子区域II box内CpG位点甲基化
的发生 , 初步说明了小剂量的Cd能够使拟南芥
MLH1启动子甲基化水平上调, 这和图2-A、C显示
的结果一致。图3-A、C、D中, 由于SalI、TaqI、
Hpy99I三种限制性核酸内切酶在0.125、0.25、
图4 拟南芥MLH1启动子被限制性核酸内切酶酶解模式图
Fig.4 The sequence model map of MLH1 promoter of A. thaliana digested by restriction endonuclease
A: 被SalI消化, 结果可能包含以下几种情况: (1) Box内的CpG位点发生甲基化, 酶解产物为a, b; (2) box内的CpG位点未发生甲基化, 酶
解产物为a+b。B: 被TaqI消化, 结果可能包含以下几种情况: (1)两个box内的CpG位点均发生甲基化, 酶解产物为a, b, c; (2) I box内的CpG
位点发生甲基化, 而II box内的CpG位点未发生甲基化, 酶解产物为a, b+c; (3) II box内的CpG位点发生甲基化, 另一个没有甲基化, 酶解产
物为a+b, c; (4)所有CpG位点均未发生甲基化, 酶解产物为a+b+c。C: 被Hpy99I消化, 结果可能包含以下几种情况: (1)三个box内的CpG位点
均发生甲基化, 酶解产物为a, b, c, d; (2) I box内的CpG位点发生甲基化, 而另两个box内的CpG位点未发生甲基化, 酶解产物为a, b+c+d; (3)
II box内的CpG位点发生甲基化, 而另两个box内的CpG位点未发生甲基化, 酶解产物为a+b, c+d; (4) III box内的CpG位点发生甲基化, 而另
两个box内的CpG位点未发生甲基化, 酶解产物为a+b+c, d; (5) I、II box内的CpG位点发生甲基化, 而另一个未发生甲基化, 酶解产物为a, b,
c+d; (6) I、III box内的CpG位点发生甲基化, 而另一个未发生甲基化, 酶解产物为a, b+c, d; (7) II、III box内的CpG位点发生甲基化, 而另一
个未发生甲基化, 酶解产物为a+b, c, d; (8)三个CpG位点均未发生甲基化, 酶解产物为a+b+c+d。
讨  论
BS和COBRA技术可以分别从整体和特定识
别位点两方面入手直接对基因组或目的区段甲基
化水平进行检测, 由于BS可以精确到单个碱基, 而
COBRA又可以满足一定的定量要求, 因此, 它们联
合起来可以检测对照和处理组的微小差异(Srirak-
sa等2010)。然而不同生物标记物只是反映了污染
物在不同阶段、不同层次上的毒性效应, 只有将
分子水平的研究和植物的形态、生理等指标相结
合才能对污染物的毒性效应做出客观、全面地评
价(韩艳萍等2009)。本试验从拟南芥的形态、生
理和分子指标3个层次研究了Cd的生态毒理效应,
筛选出了指示Cd污染的潜在生物标记物。
本试验对幼苗形态和生理指标的研究结果表
明, 0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1 Cd胁迫处理3 d
后, 幼苗叶片数、地上部鲜重、地上部叶绿素含
量与对照相比均没有发生显著变化(P>0.05) (表
1、2), 因此它们不能用来作为指示土壤Cd污染的
有效生物标记物。而幼苗的根长则随着Cd浓度的
提高明显减小(P<0.05) (表1), 类似的结果也存在于
Herbette等(2006)、张军和束文圣(2006)的研究
中。同时, 地上部可溶性蛋白质含量与Cd浓度之
间存在显著的负相关剂量-效应关系, 这与Koval-
1.0、3.0 mg·L-1 Cd胁迫样品中均产生了相同大小
的切割片段, 每一种酶在各个识别位点的切割程
度从图中看不出明显的规律变化, 因此, 还有待于
通过Southern印迹杂交来做更为精确的定量分
析。图4-A、B为拟南芥MLH1启动子被SalI和TaqI
两种限制性核酸内切酶的理论酶解情况。
单存海等: 镉胁迫对拟南芥MLH1基因启动子甲基化的影响 303
chuk等(2005)、刘宛等(2006)研究结果相一致, 可
能是因为Cd胁迫使可溶性蛋白质的合成受阻或分
解加速(夏奎等2008; 吴双桃和朱慧2010), 而植物
体内某些蛋白质含量及活性的降低也是生物体产
生中毒反应的前兆(齐雪梅等2006)。本研究中, 不
同浓度Cd处理下, 地上部可溶性蛋白质含量显著
降低(P<0.05), 且均低于对照水平。张巧丽等
(2008)研究表明其变化趋势为先上升后下降, 最终
低于对照水平; 而韩艳萍等(2009)研究结果则显示
地上部可溶性蛋白质含量先上升后下降, 最终高
于对照水平。这说明不同的幼苗培养条件和胁迫
时间使植物体内可溶性蛋白质含量变化产生了一
定的差异。
分子指标方面, 0、0.125、0.25、1.0、3.0
mg·L-1 Cd胁迫处理3 d后, 拟南芥幼苗错配修复基
因MLH1启动子甲基化水平随Cd浓度的增加也显
示出了明显的剂量-效应特征(图2、3)。王子成和
马洪霞(2009)也证实了不同程度的Cd会促使拟南
芥基因组甲基化水平上调; 类似的结果也存在于
水稻和小麦的研究中(葛才林等2002)。目前, 有学
者认为, Cd之所以引起植物DNA甲基化水平的提
高, 可能由于其引起了植物体内过氧化胁迫, 而导
致大量甲基自由基的产生, 甲基自由基直接攻击
DNA中的胞嘧啶造成了5-甲基胞嘧啶水平的提
高。
同时使用多种类型的生物标记物有助于提高
毒性效应的检测效率(刘宛等2006)。Nia等(2001)
以抽烟诱发人体细胞的遗传毒性试验表明, 某些
生物标记物之间具有较好的相关性。植物体内可
溶性蛋白质含量是机体代谢过程的重要指标, 根
长则显示了植物的生态状态, 而甲基化的变化研
究也为基因表达层面, 即蛋白质水平的变化差异
提供了更加微观的解释。因此, 利用BS和COBRA
分析获得的MLH1启动子甲基化变化, 结合幼苗根
长、地上部可溶性蛋白质含量变化指标, 可作为
检测Cd污染对植物遗传毒性效应的生物标记物。
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