全 文 ：林业调查规划　2007.Aug.32 (4):27 ～ 31
Fore st　 Inven tory　 and　P lann ing
CN 53 -1172 /S　 ISSN 1671 -3168
茶藨生柱锈菌寄主遗传多样性研究*
李永和 , 陈 敏 , 赵瑞琳
(西南林学院 , 云南　昆明　650224)
摘要:运用随机扩增多态 DNA (RAPD) 标记对分布于我国 4省 6病区 63份茶藨生柱锈菌寄主红松和华山松进
行遗传多样性分析。用 6个随机引物对寄主松针进行 PCR扩增 , 共得到 138个 DNA位点 , 其中多态位点 117
个 , 多态位点比率为 84.78%, RAPD的 Shannon指数遗传多样性为 0. 315 5, RAPD的 Ne i指数基因分化系数为
0. 525 5。不同来源寄主的遗传多态性规律顺序:辽宁清原红松 >云南洱源华山松 >山西沁水华山松 >云南巧家
华山松 >四川广元华山松 >云南东川华山松。从 RAPD聚类分析树状图可以看出 , 先将 63个松针样品分成 2个
不同的 RAPD组群 (红松组群和华山松组群), 然后又将不同地理来源的华山松组群按地理区域分成 5个亚群 ,
同一采集的华山松亚群中又分成感病组和抗病组。 研究表明 , 种间的遗传多样性是由种的遗传属性所决定的 ,
而地理因素只是影响种内遗传多样性的一个因子。
关键词:茶藨生柱锈菌;寄主;红松;华山松;遗传多样性
中图分类号:S718. 46:S763. 1:S763. 2　　文献标识码:A　　文章编号:1671 - 3168 (2007) 04 -0027 - 05
A Study on the Genetic D iversity ofHosts ofCronartium ribico la
LI Yong-he, CHEN M in, ZHAO Ru i- lin
(Southwest Fo restry Co llege, Kunm ing 650224 Yunnan, China )
Abstract:Gene tic d iversity analysis of the 63 host samples o fCronartium ribicola on K orean pines and
P. armandii from six infected a reas of four provinces in China based on RAPD m arking. Six random
prim ers are used in PCR amplifica tion of ho st needles, gene ra ting a tota l of 138 RAPD marke rs, inclu-
d ing 174 po lymo rphic loci, wh ich is 84.78% polymorphic. Shannon index in RAPD is 0.315 5, and dif-
ferentiation coefficien t o fNe i index in RAPD is 0.525 5.Po lymo rphic sequence o f d ifferen t hosts is:Ko-
rea pine in Q ingyuan of L iaoning>P.armandii in E ryuan of Yunnan>P.armand ii in Q inshui of Shanx i
>P .armandii in Q iao jia of Yunnan>P.armandii in Guangyuan o f S ichuan>P.armand ii in Dongchuan
of Yunnan. RAPD clustering analysis dendrogram show s the P.armandii samp le s are d iv ided in to 2 dif-
ferent RAPD g roups (Korean pine group andP .armandii g roup), and then theP .armandii g roup is fur-
ther d iv ided into 5 subg roups by geographic reg ions, theP .armandii subg roups from the same geog raphic
regions are divided in to in fec ted and resistan t g roups.This demonstrates tha t genetic diversity o f d iffe ren t
species is attributab le to the species genetic prope rties, and tha t geograph ica l fac to r is one o f the factors
for intra-species gene ric diversity.
Key words:Cronartium ribicola;Host;P inus koraiensis;P .armand ii;G ene tic dive rsity
　　茶藨生柱锈菌 (Cronartium ribicola J.C. Fisch-
er)是世界林木三大病害之一的五针松疱锈病的病
原 , 过去的研究[ 1] [ [ 2] [ 3] [ 4]表明 , 其为一种长循环
转主寄生锈菌 , 0、 Ⅰ阶段寄生于华山松 (P inus
armandii Franch)、 红松 (P. kora iensis S ieb. e t
Zucc.)枝干上 , Ⅱ 、 Ⅲ阶段寄生于转主寄主茶
* 基金项目:云南省自然科学基金项目 (2002C 0015Q )、 国家自然科学基金项目 (30260089) 资助
收稿日期:2007 - 06 - 18
作者简介:李永和 (1969 -　), 男 , 贵州兴仁人 , 副研究员 , 主要从事森林病虫害综合管理教学和研究工作。
E -m ai l: jw clyh@ 126. com
林 业 调 查 规 划
藨子属植物 (R ibes spp.)、 马先蒿属植物 (Ped ic-
ularis spp.)叶片上 。我国的五针松疱锈病主要分
布于黑龙江 、 吉林 、 辽宁 、 四川 、 甘肃 、 云南等
省 , 以东北林区的红松疱锈病和云南 、 四川 、 陕
西 、 山西等省的华山松疱锈病危害最为严重 , 已
成为影响我国红松人工纯林和华山松人工纯林可
持续发展的重大病害之一 。国内对五针松疱锈病
病原 、 综合治理研究较多 , 但对病原的寄主遗传
多样性研究较少 。本文通过对茶藨生柱锈菌寄主
遗传多样性的研究 , 旨为红松 、 华山松的抗疱锈
病育种提供理论依据 。
1　研究材料与方法
1.1　寄主来源
采自辽宁清原的红松样品 10个 , 采自山西沁
水 、 四川广元 、 云南巧家 、 云南洱源 、 云南东川
5个病区地点的华山松样品 53个 , 见表 1。
表 1　不同来源的红松 、 华山松样品数
采样地点 寄 主 编号 样品数
辽宁清原 红松 LQ 7
LQd 3
山西沁水 华山松 SQ 7
SQd 3
四川广元 华山松 SG 7
SG d 3
云南巧家 华山松 YQ 8
YQd 4
云南东川 华山松 YD 7
YDd 3
云南洱源 华山松 YE 8
YEd 3
注:对照样是采自西南林学院校园的五针白皮松 (P in us sguam ata
X.W .Li), 编号 DZY;编号末位字母为 d的是从未感病的植株上
所采松针 , 其余样品为感病植株上所采松针。
1.2　松针 DNA的提取
1.2.1　提取液的配制
提取液配方如下:质量浓度为 2%CTAB (Ce ty l-
triammonium brom ide), 1.4 mol N aC l, 20mmo l ED-
TA , 质量浓度为 1%PEG 8 000 (Polyethlene g ly-
co l), 100mmo l Tris - HC l (pH9.5)。混合后放
120℃高压灭菌锅中灭菌 1h。
1.2.2　松针 DNA的提取
用蒸馏水冲洗样品 , 室内室温下晾干 , 将松针
针叶剪成 1mm的小段 , 取 0.5g, 置研钵中加液氮
研磨成粉末并快速转移到 1.5m l Eppendo rf管中 。
加入提取液 750m l, 混匀后 , 65℃水浴 30m in (每
8 ～ 10m in轻微震荡 1次 , 使组织 DNA充分溶解于
提取液中 )。在离心机上 12 000 rpm离心 10m in, 取
其上清液 , 转移到另一 1.5m l离心管中;加入等体
积的氯仿 -异戊醇 (24:1), 混匀后 12 000 rmp离
心 10m in;取其上清液 , 加入等体积的预冷的异丙
醇 , 混匀后于 -20℃冰箱静置 30m in;于 12 000rmp
离心 10m in, 弃上清液 , 下部沉淀物用 75%的乙醇
洗涤 2次 , 之后用 100%的乙醇洗涤 1次 (洗涤时
轻转离心管数次后 , 缓慢倒掉乙醇);在室温下隔
夜干燥或将烘箱调至 50℃, 30m in烘干 , 所得白色
固体状物即为松针 DNA提取物 。在其中加入 80 ～
100u l超纯水 (为确保其纯度 , 用 1.5m l离心管分
装出来使用 , 且超纯水试剂瓶最好用塑料薄膜封
好)或 TE (10mmo l Tris -HC l pH 8.0, 0.1mmo l
EDTA), 使之溶解 , 得到松针 DNA的粗提液。
1.3　PCR扩增
(1) PCR扩增反应液的配制
PCR扩增反应液的配制见表 2。
表 2　松针 PCR扩增反应液组成
反应成分 现有浓度 终浓度 反应体积 /u l
10x reaction buffer - - -- -- -- 2
DNTP 10mM 100uM 0. 2
M g2+ 25mM 1.5mM 1. 2
Prim er 50pM 5pM 2
Taq 5u /ui 1u 0. 2
ddH
2
0 - - -- -- -- 12. 4
Temp late - - -- -- -- 2
Total 20
注:DNA模板稀释 10倍; dNTP (Prom ega);Taq酶 (上海生物公
司);bu ffer (上海生物公司);M g2+ (上海生物公司)。
(2)引物筛选
随机选取 OPA 1 - 20、 OPB1 - 20、 OPC1 - 20、
OPD1 - 20 (北京赛百盛基因技术有限公司 )共 80
个随机扩增引物进行筛选试验 , 根据扩增条带的数
量 、 特异性和可重复性对引物进行筛选 , 选出具稳
定多态性引物进行样品的 RAPD分析 。筛选出 6个
用于寄主遗传多样性检测的随机引物及序列见
表 3。
(3) RAPD反应程序
PCR扩增仪为梯度 PCR仪 (Biome tra)。按照
扩增反应液组成配制反应混合物 , PCR反应体积
为 20u l。先在 94℃预变性 5m in, 然后进入下列温
度循环:94℃变性 40S;36℃复性 1m in , 72℃延伸
28 第 32卷
李永和等:茶藨生柱锈菌寄主遗传多样性研究
2m in, 共进行 45个循环 , 最后一个循环在 72℃保
持 7m in使 DNA片段得到完全延伸 。扩增反应后产
物置 4℃保存以备电泳 。以 0.5 ×TBE (Tris Bori-
cacid, EDTA)为电泳缓冲液 , 将扩增产物在含有
溴化乙锭 (1ug mL -1)的 1.5%琼脂糖凝胶上 ,
胶上同时点上 make r于 4v cm - 1电场强度下电泳
3h。将电泳检测结果在透过式紫外灯下观察并用
快速成像系统 ( foto /Spectrum tm)拍照 。
表 3　寄主遗传多样性检测的随机引物及序列
引物编号 碱基序列 5—` 3`
OPD - 06 ACCTGAACGG
OPD - 09 CTCTGGAGAC
OPD - 11 AGCGCCATTG
OPD - 12 CACCGTATCC
OPD - 14 CTTCCCCAAG
OPD - 16 AGGGCGTAAG
1.4　数据统计分析
在 RAPD分析中 , 以整个基因组作为遗传单位
以电泳条带的存在与否来定义座位 , 电泳图谱中清
晰的条带 (包括弱带 )记作 “ 1”, 否则记作
“ 0”[ 6] , 建立 0 /1数据矩阵。
0 /1数据矩阵通过 POPGENE Version 1.31软件
进行统计分析 。计算了多态位点百分率 (PPL),
Shannon多样性指数 (I), N ei基因多样性指数
(H), 有效等位基因数 (Ne)。从而分析样品的遗
传多样性 、 遗传分化和遗传一致度。
0 /1数据矩阵用 PHYLIP 3.6的 NE IGHBOR程
序修正并进行非加权算术平均聚类分析法 (NJ
法 ), 最后得出树状聚类图 。
2　结果与分析
本试验对采自 6个病区的 63个松针样品的基
因组 DNA进行了 RAPD分析。寄主部分 RAPD电
泳结果见图 1。
2.1　寄主的多态性
用 6个引物在 64个样品 (含 1个外群样品 )
中共扩增出 138条 DNA位点 , 扩增片段长度主要
在 250 ～ 1 350bp。在这 138条 DNA位点中 , 多态
性位点有 117条 , 总样品的多态位点百分率 PPL =
84.78%;N ei′s基因多样性指数 H =0.196 6;
Shannon信息指数 I=0.315 5;有效等位基因数 N e
=1.304 9。根据地理区域把总样品划分成 6个遗
传组 , 其中辽宁清原的红松样品遗传多样性最高 ,
PPL =47.83%, H =0.163 4, I =0.246 5, Ne =
1.273 2;云南洱源的华山松样品多态位点百分率
最低 , PPL =21.74%;云南东川的华山松样品
Ne i′s基因多样性指数 、 Shannon信息指数 、 有效等
位基因数最低 , H =0.062 8, I =0.098 1, Ne =
1.102 2 (表 4)。
表 4　寄主的多态性
采样地点 P% I H Ne
LQ (辽宁清原) 47. 83 0. 246 5 0. 163 4 1. 273 2
SG (四川广元) 46. 38 0. 208 6 0. 134 4 1. 219 5
SQ (山西沁水) 37. 68 0. 180 0 0. 117 6 1. 194 3
YQ (云南巧家) 33. 33 0. 153 7 0. 099 7 1. 162 1
YE (云南洱源) 21. 74 0. 098 5 0. 063 4 1. 102 7
YD (云南东川) 22. 46 0. 098 1 0. 062 8 1. 102 2
Total (总样品) 84. 78 0. 315 5 0. 196 6 1. 304 9
多态位点百分率 PPL、 Shannon信息指数 I、
Ne i′s基因多样性指数 H、有效等位基因数 Ne的顺
序为辽宁清原红松 >四川广元华山松 >山西沁水华
山松 >云南巧家华山松 >云南洱源华山松 >云南东
川华山松 , 随以上地理走向 , 各项指数越来越低 ,
多态性逐渐降低。
2.2　用 RAPD的 Ne i指数估算基因多样性
寄主 (红松 、 华山松 )总群体的基因多样性
H t =0.225 3, 群体间基因多样性 DST =0.118 4,
群体内基因多样性 Hs =0.106 9, 基因分化系数 Gst
=0.525 5。
2.3　RAPD的遗传相似性和遗传距离
寄主的地理区域性的遗传相似性见表 5, 从表
5可见 , 山西沁水华山松样品与四川广元华山松样
品之间的遗传相似性最高 0.895 2, 遗传距离最小
0.110 7;辽宁清原红松与云南东川华山松样品之
间的遗 传相似 性最低 0.799 1, 遗 传距 离最
大0.224 3。
表 5　寄主的 RAPD遗传相似性 (上三角值)
和遗传距离 (下三角值)
样品 LQ SQ SG YQ YD YE
LQ **** 0. 839 1 0.804 5 0. 810 7 0. 799 1 0. 873 3
SQ 0. 175 5 **** 0.895 2 0. 872 4 0. 864 5 0. 867 9
SG 0. 217 6 0. 110 7 **** 0. 840 0 0. 827 1 0. 830 6
YQ 0. 209 9 0. 136 5 0.174 4 **** 0. 869 6 0. 867 1
YD 0. 224 3 0. 145 6 0.189 9 0. 139 7 **** 0. 833 9
YE 0. 135 5 0. 141 7 0.185 6 0. 142 6 0. 181 6 ****
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林 业 调 查 规 划
图 1　辽宁清原县红松松针 RAPD电泳图谱 , 引物 OPD - 14
2.4　RAPD的聚类分析结果
从 RAPD聚类分析树状图 (图 2)可以看出 ,
在相似性系数为 0.38时 , 将 63个松针样品聚成 6
个不同的 RAPD组群。各组群将同一地理来源的华
山松聚类于同一类群中 , 说明地理区域成为影响寄
主遗传多样性的一个因子。同一组群中又分成感病
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李永和等:茶藨生柱锈菌寄主遗传多样性研究
组和抗病组 2个亚组 。
图 2　茶藨生柱锈菌寄主 (红松 、 华山松) 系统聚类树状图
3　结论
(1)运用随机扩增多态 DNA (RAPD)标记对
我国 4省 6地的茶藨生柱锈菌寄主进行遗传多样性
分析 。用 6地随机引物对寄主红松 、华山松松针进
行 PCR扩增 , 共得到 138个 DNA位点 , 其中多态
位点 117个 , 多态位点比率为 84.78%, RAPD的
Shannon指数遗传多样性为 0.315 5, RAPD的 Ne i
指数遗传分化为0.525 5。
(2)寄主遗传相似性排序为:辽宁清原红松
样品 >云南洱源华山松样品 >山西沁水华山松样品
>云南巧家华山松样品 >四川广元华山松样品 >云
南东川华山松样品 。
(3)从 RAPD聚类分析树状图可以看出 , 先
将 63个松针样品分成 2个不同的 RAPD组群 (红
松组群和华山松组群 ), 然后又将不同地理来源的
华山松组群按地理区域分成 5个亚群 , 同一地理区
域的红松 、华山松亚组群中又分成感病组和未感病
组。群体间基因多样性 0.118 4高于群体内基因多
样性 0.106 9。这一研究表明 , 种间的遗传多样性
是由种的遗传属性所决定的 , 而地理因素是影响种
内遗传多样性的一个因子。感病组和未感病组的聚
类结果为今后开展红松和华山松的抗疱锈病育种提
供了依据 。
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31 第 4期