全 文 ：上海农业学报 4 1 9 9, 1 0 ( 2 ) : 7 1~ 7 4
A ct a A g 八 c u lt u ar e S h a n g h a i
上海矮牵牛 ( eP t u n ia hy b idr a) 病毒病的脱毒技术
周正来
(上海市农业科学院植物保护研究所 , 上海2 0 1 1 0 6 )
衷贤溶 汪树俊
(上海市农业科学院 ,上海 20 1 10 6 )
黄济明
(上海市园林科学研究所 ,上海 2。。。 5 1)
l蒋衷同}
(上海农学院 , 上海2 0 1 1 0 1 )
摘 要 用黄瓜花叶病毒接种矮牵牛 ,取发病植株的叶片 、 花芽和茎尖进行培养 ,用间接
E L sI A 和离体蚕豆叶片进行检测 ,结果表明 : 用叶片、 花芽以及大于。. 3~ 0 . s m m 的茎尖培养 ,不
能获得无毒苗 ,从病株上剥取 。 . 15 ~ 0 . 25m m 的茎尖培养可获得 6 . 6%的无毒苗 ;连续高温处理病
株 d8 结合茎尖 (0 . 3~ 0 . s m m )培养 ,可获 10 %的无毒苗 ;分别变温处理 ( 38 ℃ h8 + 2 ℃ 1 6 h )1 d6 和
3od 结合茎尖 ( 0 . 3~ 0 . sm m )培养 ,均可获得 11 . 1%的无毒苗 。
关工词 矮牵牛 ,黄瓜花叶病毒 ;脱毒
矮牵牛有单 、 重瓣品种之分 , 重瓣品种只有无性繁殖 ,单瓣品种则可进行种子繁殖和无性
萦殖 。但国际上广泛栽培的是矮牵牛的杂交种 ,只有进行无性繁殖才能保持其杂种优势 。而无
性策殖的矮牵牛一旦被病毒侵染 ,病毒就会在植株休 注存活传代 ,使植株受害加重 . 经鉴定 ,矮
牵牛上的主要病毒是黄瓜花叶病毒 . 本文报道脱除衣资牵牛黄瓜花叶病毒的技术 。
L 材 料 与 方 法
1
.
1 材料来派 将矮牵牛的种子播在隔离温室内 , 苗期接种黄瓜花叶病毒 (分离自矮牵
牛 ) ,待矮牵牛表现花叶症状后 ,取不同部位的材料进行组织培养或先将病株进行高温处理再
取材料进行组织培养 。高温处理是将病苗放入 L R H 一 1 5 0一 G 型光照培养箱内 ,每天光照 1h2 , 光
强为 7 0 0 l x 左右 。
L Z 试验方法
L .2 1 组织培养
试验材料用 70 %的酒精浸 30 ~ 60 5 ,再用 3%的次抓酸钙 (有效成分 )消毒叶片 10m in ,消毒
花芽和茎尖各5而 n ,无菌水冲洗 3次 。茎尖和花芽都在双 目解剖镜下剥切 ,并用显微尺量取大
小 。培养条件为 : 温度 2 ~ 25 ℃ ;光强 1 50 lx 左右 , 每天光照 1h2 . 试管苗生根后按常规方法移
栽 。
1
.
2
.
2 检测
1
.
2
.
2
.
1 间接 E IL S A 法 :参照 S m iht D B 和 aD vi s R F 方法 1[] ,所用缓冲液按照张成良方
法「2 〕配制 ,其中包被液为 0 . 05 m ol · L 一 ` p H g . 5碳酸钠缓冲液 ,抗体稀释液中加有 2 %的聚乙烯毗
咯琳酮 (P V P ) ,研磨样本的缓冲液为 0 . 02 m ol · L 一 ’ pH 7 . 2的磷酸生理盐水缓冲液 + 0 . 05 % T ir -
t o n X
一
10 0
。
用包被液将样本稀释 10 倍后包被微孔板 , 又以兔抗黄瓜花叶病毒的 Ig G ( 2拜g /m D包被 ,
收稿日期 1 9 9 3一 0 8一 18初稿 , 1 9 9 3一0 9一2 8修改稿 。
7 2上 海 农 业 学 报 1 0卷
再以 1 / l 0 0稀释度的冷干辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 Ig G (卫生部北京生物制品研究所 )
进行包被 ,最后加邻苯二胺底物 ,室温反应 30m in , 加 H Zso `终止反应 ,在 D G 一 3 0 21 型酶联免疫
检测仪 (华东电子管厂产品 )上测定 49 0n m 处的光密度值 。每块多孔板上设有空白 、 阳 、 阴性对
照 ,各设有两个重复 ,取其平均值 。 以待测样本的光密度值与阴性标本光密度值之 比大于 3作为
判断阳性反应的标准 。
1
.
2
.
2
.
2 生物检测法 : 按常规摩擦接种方法 , 用离体蚕豆叶片进行检测 . 检测时期分别是
愈伤组织期 、 移苗期和开花期 。
2
. 结 果
2
.
1 叶片和花芽的脱毒培养 培养叶片和花芽的培养基是 : M S + N A A o . Zm g / L + B A
2
.
om g L/
。 切取 0 . 5~ 1 . oc m 的叶片培养 ,获得了28 块愈伤组织 , 在愈伤组织期间 ,经生物检测 ,
结果均带有病毒 ;用 0 . 2~ 0 . 4m m 的花芽进行组织培养 , 获得了 3 块愈伤组织 ,在愈伤组织期
和试管苗移栽期分别进行生物检测和 E IL S A 检测 ,所有的愈伤组织都带有病毒 。
2
.
2 茎尖脱毒培养
2
.
2
.
1 适合茎尖培养基和生根培养基的选择
2
.
2
.
1
.
1 茎尖培养基的选择 : 用 8种不同组分的培养基进行试验 ,结果表明 : 以 1 2/ M S 培
养基作为基础培养基为佳 , 激素比例以 B A / N A A 二 1 0 / 1最佳 。 因此 , 选择 1 / ZM S + N A A
0
.
l m g / L + B A 1
.
om g / L (液体培养基 )作为茎尖培养基 (表 1 ) 。
农 1 不同种类培并荟对鉴尖成活率的形晌
1加目七 1 E f f吮肠 Or d f . r e . t 目恤白 or . 目 I. . .o t加 su r d侧目 , 吐. Or 拼加园 .1 . “ 仙 t . . 一目脚
培养羞种类
K i dn
o f r o e d iu m
茎尖大小
M e血 t e m一 t i P
5 1跳 (口刃。 )
茎 尖 数
M e ir s t e价 t i P
n u功 be r
茎尖成活率 (% )
S u vr iva l ar t e o f
me ir
s t e-m t一钾 (% )
.勺nù丹J口哎月了,O d1`口心`,ó n汽dM S + N A A o
.
Zm g / L + B A Zm g / L
(固体 ) ( oS lid )
M S + N A A + B A l m g / L
id )
0
.
2~ 0
.
2 5
0
.
2~ 0
.
2 5
M S + N A八必行gm / L 十 B A l gm / L
(固体 ) (勘 l id ) 0
.
2~ 0
.
2 5
1 / ZM S + N A A O
.
l m g / L + B A l m g / L
(固体 ) ( oS l id ) 0
。
2~ 0
.
2 5
l / ZM S + N A A O
.
Zm g / L + B A Zm g / L
(周休 ) ( S 〕 lid ) 0 。 2~ 0 . 2 5
l / ZM S+ N A A o
.
zm g / L+ B A l m g / L
(液体 ) ( L iq u id ) 0 . 2~ 0 . 2 5
OR
二 一UO`
1 / ZM S + N A A O
.
(液体 )
B A 4 m g / L
1 / ZM S + N A A o
.
0 1m g / L+ B A l m g / L
(液体 ) ( L iq u id )
0
.
2~ 0
.
2 5
0
.
2~ 0
.
2 5
2
.
2
.
1
.
2 生根培养基的选择 :参考黄济明 ( 1 97 9) 31[ 的方法 ,将 2~ c3 m 的枝芽接种到不同
的培养基上 ,生根培养 1 d5 左右 (生根率为 70 % ~ 95 % ) , 移栽到基质 ( 1 / 3细土 + 1 3/ 草木灰+
1 3/ 蛙石 )上 , 炼苗两周 , 统计试管苗的成活率 ,结果表明 : 以 M S + N A A 0 . 01 m g / L 为最佳 (表
2 )
。
2期 周正来等 :上海矮牵牛 (尸 te “ 耐 a hy 加 ida )病毒病的脱毒技术
农 2 不同生根培并荟对移裁试 , 苗成活率的形晌
T的 l e 2 E f f eC t ot d l f re er . t r O t .姆 画目口. 皿 t u加~ t r a .因 p l如 t s u vr lv目 , 抚
培养基的种类
K in d o f 们。 e d i u m
接 枝 数
S h o
t n u m b e r
试管苗成活率 (% )
T u be
一 t r a n s p la n t s u州 v al r a t e (% )
0甘二ó勺n六`JO曰已d月口匕4l / Z M S
1 / Z M S+ N A A o
.
o l m g / L
M S+ N A A 0
.
o l m g / L
2
.
2
.
2 茎尖脱毒培养
2
.
2
.
2
.
1 茎尖脱毒培养 : 从病株上剥取 0 . 15~ 0 . 2 5m m 、 0 . 3~ 0 . sm m 和 1 . o m m 的茎尖
进行组织培养 ,结果表明 : 只有 0 . 巧 ~ 0 . 25 in m 的茎尖培养 ,方能获得无毒苗 (表 3 ) 。
农 3 不同处理的鑫尖培并脱除 CM v 效果比较
介b le 3 C o口钾山 l皿 ot _ CM V才 n 沈 吐 n d e . e y 山 f r e比 n t In t lP e u l t u er
热处理类型 植株存活率 茎尖 ( IT )P 愈伤组织期脱毒率 移苗期脱毒率 开花期脱毒率
(% )一 ( % ) ( % ) (% )T y p吧 of h e a t P lan t 大 小 成活率 ( 纬 ) V iur s 一 f r e e V i r u s 一 f r e e V i r u s一 f ert r e a t刃。 e n t s u vr iv a l ( m r n ) uS vr i v a l ar et a t r a t e a t ar t e a t f lo -r a t e iS ez ar t e e a ll u s s t a g e s e d lin g s t a g e w e r in g s t a g e无热处理N O h e a t tr e . t功曰吐无热处理N o h ea t t民汤 lt . em无热处理
N o h e a t t r e . t扣n e n t
连续 38 ℃商沮处理8天
C o nB ec u it ve
h e a t t民汤 t刃。 e n t
a t 3 8℃ f“ 8 d a外
变沮处理 16 天 .
Va
r y i gn b .e t ter
a t
me ut
f or 1 6 d a ys
1 0 0 1
.
0
1 0 0 0
.
3~ 0
.
5
1 0 0 0
.
1 5~ 0
.
2 5
3 6
。
6 0
.
3~ 0
.
5 3 3
8 0 0
.
3~ 0
。
5 9 0
变温处理30 天 .
V a仔ign h ea t t r e a t眼 n t 6 6 . 4 0 . 3~ 0 . 5 3 2 . 7 1 1 . 1 1 1 . 1 1 1 . 1
fo
r 30 d a y s
变温处理 3 8℃ 8小时+ 2 2℃ 1 6小时
N o t e
:
V a r y . gn h ea t tr
e a t
men
t m e a n s 3 8℃ s h + 2 2℃ 16 h
2
二
2
.
2
.
2 连续高温处理结合茎尖培养 :将病株先在 40 ℃连续处理 8d ,然后再剥取 0 . 3~
0
.
s m m 的茎尖进行组织培养 , 结果可获得无毒苗 (表 3 ) 。
2
.
2
.
2
.
3 变温处理结合茎尖培养 : 参照 w a l k e y D G A 和 F r e e m a n G H ( 1 9 7 7 )的方法 [` l ,
将病株以变温条件 (3 8℃ h8 + 2 ℃ 1 6h) 分别处理 1 d6 和 30 d , 再剥切 0 . 3 ~ 0 . s m m的茎尖进行组
织培养 ,均可获得 1 1 . 1%的无毒苗 (表 3 ) 。
3
. 讨 论
有关脱除矮牵牛病毒的研究 , 国内外报道很少 。 日本的森宽一 ( 1 96 4) 图用 0 . 1~ 0 . 3m m 的
茎尖进行培养 ,脱除了矮牵牛上的烟草花叶病毒 ( T M V ) , M or ik ( 1 97 0) 6j[ 用茎尖培养脱除了矮
牵牛的烟草花叶病毒和烟草坏死病毒 ( T N V ) 。 本试验表明 ,可用茎尖培养脱除矮牵牛的黄瓜
花叶病毒 ,但不能用叶片和花芽培养获得无毒苗 。 M盯 ak ihs i 和 C盯 lso (n 1 97 6) 川曾利用烟草花
叶病毒在烟草中分布不均匀的特性 ,通过叶片外植体培养 , 获得了 50 %的无毒苗 。 这可能是
上 海 农 业 学 报 1蜷
C MV在矮牵牛叶片组织中的浓度和分布情况与 T MV不一样 。此外 ,从脱毒率看 ,热处理有助
于脱除病毒 ,这与有些文献的报道相一致 8[, 幻 ,变温处理比连续高温处理对植株的损伤小 . 从应
用的角度来看 , 以变温处理 1 6d 后再剥取 。. 3 ~ 。 . s m m 的茎尖培养或直接剥取 。 . 15 ~ 0 . 2 5m m
的茎尖培养为佳 ,前者有较高的脱毒率和剥取茎尖较为方便的优点 ,后者虽要求较高的剥茎尖
技术 ,但省去了热处理的不便 。因此 ,作者建议在条件许可的情况下 ,可采用变温处理结合茎尖
培养技术 ,当然也可以直接剥取 0 . 15 ~ 。 . 25 m m 茎尖进行培养 。 由于矮牵牛较易繁殖 ,所以只
要将少量无毒苗保存在隔离温室内作为原种 ,快速萦殖后即可用于生产 。
参 考 文 献
1 5而 th D B , aD v i s R F . dI e n t iif e a t io n o f e u e u m be r 刃。 o s a ie 衬ur s for m V i瓜 a
~
in N e w Je r s e y
.
P I
. 压 5 . , 19 8 6 , 7 0
( 11 )
:
1 0 5 6~ 10 5 9
.
2 张成良 ,张作芳 . 醉联免疫吸附技术一 1 . 醉联免疫吸附法 (EL 】S A )实脸技术 . 植物检疫参考资料 , 1 9 82 , 1 : 16 ~ 2 .8
3 黄济明 . 重瓣矮牵牛叶片组织培养 . 上海园林科技汇编 , 19 79 , 1“ .
4 W a l k e y D G A
,
F er ma
n G H
. 】n a e t iva t io n o f e u cu m be r 刃n o . a ie vi ur . i n cu It u r ed t i s s u e s o f N ico t ia n a r “ 以ica b y d i u r -
na l 公t e r n a t i吧琳 r iod s o f hi gh a n d lo w et m p e ar t u er . A n . A pp l . 丘。 1. , 19 7 7 , 8 7 : 3 7 5~ 3 8 2 ·
5 裘文达编 . 园艺植物组织培养 . 上海 :上海科学技术出版社 , 19 86 , 1 0.0
6 Q u a k F
.
M e r i s t e m e u lt u r e a dn ~
s一台 e e pl anst ln P la nt eC ll
,
iT
s s u e j n d or g
a n C u lt u er ( de
.
R e ine
r t J
,
aB j
a j
Y P S ) S p ir gn
e
ver lr
a y :
eB
r l in
,
1 9 7 7
,
59 8 ~ 6 1 5
.
7 hB
o jaw in S
,
R a dz e n M K
.
P la n t T i s s u e uC lt
u r e一 th e o叮 a nd p r ac t ie e . lE s e vi e r 反 ie nc e P u b li s hi 叱 oC m琳叮 I nc ·
5 2
,
N e w Y o r k
,
1 9 8 3
,
3 0 7
.
8 H o l l in g s M
. 压 s e a s e e o n t or l thr o u g h v i r u s ~ 1r e s tco k . A n n u al R e vie w o f bP yt o p a t h o lO . y , 1特 5 , 3 * 3 6 7 ~ 3 9 6·
9 K a s s a in s B
·
H e a t
一 t h e r a p y o f v i r u s 一 in feC t ed p l
a
nst
.
An
.
A p p l
. 压0 1. , 1 9 54 , 4一( 3 ) : 4 70阳 4 1 `
S T U D I E S O N T H E T E C H N IQ U E O F P R O O U O洲G
V I R U S
一
F R E E P E T U N I A
Z h o u Zh e n g l a i Y u a n X i a n r o n g W
a n g S h u ju n
( p al n t p ort
e c t l’o n R e s ae cr h nI st i t u t e , S h a n沙 a i A ca d翻叮 of
A g ir c u l t u ar l S c i e n c e s
,
S h a n沙 a i 2 0 1 1 0 6 , hC i n a . )
H u a n g J im i n g
( S h a n g h a i H o r t ic u l t u ar l nI
s t i t u t e , S h a n沙 a i 2 0 0 0 5 1 , hC i n a . )
(庆户a 叮me n t of P la n t P ort e e t ion , S h a n g h a i A g 八 c u lt u ar l
Cb l le ge
,
S h a n g h a i 2 0 1 1 0 1
,
hC i
n a
.
)
A加 t ar c t T h e l e a v e s , f l o w e r b u d s a n d m e r is t e m 一 t ip s f r o m t h e i n f e e t e d p e t u n i a p l a n t s
i n o e u l a t e d w it h CM V w e r e e u l t u r e d a n d t h e v ir u s i n e a l l i a n d p l a n t l e t s w a s e h e e k e d b y i n d i
-
r e e t E L I S A a n d b y i n o e u l a t i o n o n d e t a e h e d b r o a d
一
b e a n l e a v e s
.
T h e r e s u l t s s h o we d
a s fo l
-
l o w s : ( 1 ) v i r u s
一
f r e e p l a n t l e t s w e r e n o t o b t a i n e d a s t h e l e a v e s
,
f l o w e r
一
b u d s a n d m e r i s t e m
一 t ip s
(mo
r e t h a n 0
.
3m m ) w e r e e u l t u r e d ; ( 2 ) 6
.
6% p l
a n t l e t s w e r e a p p a r e n t l y f r e e f r o m C M V
a s
0
.
1 5~ 0
.
2 5m m m e r i s t e m
一 t ip s w e r e e u l t u r e d ; ( 3 ) 1 0% v i r u s
一
f r e e p l a n t le t s w e r e p r o d u e e d
f r o m t h
e e u l t u r e s o f m e r i s t e m
一 t ip s ( 0
.
3~ 0
.
s m m ) f r o m t h e i n f e e t e d p l a n t s t h a t h a d b e e n e o n
-
t i n u o u s l y t r e a t e d a t 4 0 ,C f o r 8 d a y s ; ( 4 ) t h e s a m e P e r e e n t ( 1 1
.
1% ) o f v i r u s
一
f r e e p l a n t l e t s
w e r e o b t a i n e d a s t h e m e r i s t e m
一 t i p s ( 0
.
3~ 0
.
s m m ) w e r e e u l t u r e d f r o m t h e i n f e e t e d p l a n t s
t h a t h a d b e e n t r e a t e d w i t h a l t e r n a t i n g t e m p
e r a t u r e i n d i u r n a l e i r e l e s 3 8℃ s h+ 2 2℃ 1 6 h f o r
1 6 o r 3 0 d a y s
, r e s p e e t i v e ly
.
K ey wo
r d s P e t u n i a ; CM V ; V i r u s
一
f r e e