全 文 ：云南大 学学报 (自然科 学版 ), 20 04 , 26 (6 A ) : 63 一 67
J o u r n日 of Y u n n a n U ul v e sr iyt
C N 53 一 10 4 5 / N 贬粥N 025 8 一 79 71
利用 R A P D 分子标记对苦竹与近缘竹’亲缘关系的研究 `
杨 萍1 , 方
( 1
. 浙江林学院 现代森林培育技术重点实验室 , 浙江
伟 1 · 2 , 林新春 1 , 2
临安 3 1130 0 ; 2 . 浙江林学院 竹类研究所 , 浙江 临安 3 113 00 )
摘要 :采用 R A I , D 分子标记研究了苦竹及近缘竹 ( 17 个竹种 )的亲缘关系 . 筛选出 20 个最佳引物 , 共计扩
增 304 个片段 , 计算遗传相似系数 , 建立 UP G M A 聚类图 , 结果表明 : 大明竹 ( P撅 o b伍 st 璐 脚而~ ( 致洲 n )
N a肠 i) 与小黄苦竹 ( Ol 乞gos 妞入, ` m fuj ￡~ 。 c
.
P
.
w an g et G
.
H
.
eY )的遗传距离 最大为 0 . 6 356 , 衙县苦竹
( P
.
j
~ ~
台 w e n et al )与硬头苦竹 ( P 汉阴 g if , 加口 t su S . Y . hC en )的遗传距离最小为 0 . 24 90 .
关键词 :苦竹与近缘竹 ; R户尸 D ; 亲缘关系
中图分类号 : Q 9 49 . 7 14 . 2 文献标识码 : A 文章编号 : 0 25 8一 7 97 ]_ (2 00 4 ) 6 A一 0 06 3一 0 5
苦竹是一种优良的经济竹种 I[] , 苦竹及近缘
竹在形态上有相似之处 , 也存在着差异 , 其中中国
产的苦竹与 日本产的苦竹在形态上差异较大 2[] .
竹类植物很少开花 , 其营养器官的外部形态特征又
随环境及个体发育的情况等因素的变化而有较大
的差异 , 现行的分类系统都是以花果特性 , 因此给
竹子的系统分类设置了难以逾越的障碍 . R A尸D
( aR
n do n l A m p lif ed olP
” 爪o r p hi 。 D N A , 随机扩增多
态 DN A ) 是 1990 年 代 由 iW l lams l
u
W
e l s h 等
( 1990 )建立起来的一种独特的检测 D N A 多态性
的技术 [’] , 作为一种新型 的遗传标记和重要的育
种工具 , 在竹子 品种鉴定 、 分类 、 分子遗传学基础 、
遗传变异等方面得到 了不同程度的应用 [ 5一 8] . 本
实验选取了 17 个苦竹及近缘竹运用 R A P D 标记 ,
试图在分子水平上探讨苦竹及近缘竹的系统发育
关系 , 为解决它们的分类问题提供了证据 , 对苦竹
种质资源的保护 、 品种鉴定和开发利用起着重大的
意义 .
1 实验材料和方法
1
.
1 实验材料 选取苦竹及近缘竹 (见表 1) . 竹
叶采集时间为 2 003 年 5 月 , 所采集的样品均通过
专家的形态学鉴定 , 采集的竹叶样品装人放有硅胶
的采集袋 , 带回实验室 , 立即放人 一 70 ℃冰箱备用 .
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 D N A来用 C p 已 法提取 取 .0 5 9 左右叶片 ,
放人预冷的灭过菌的研钵中 ,加液氮中迅速研磨成粉
末 ,转人预热的 (忍扭 提取液中 , 加人为风 的琉基乙
醇 ,于 6夕C水浴保温 40 11宙1 . 加人等体积 V (氯仿 ) : V
(异戊醇 ) = 解 : 1 , 在代下离心 10 11五n ( 10 (l刃 r/ T面11 ) . 取
上清液 ,加人等付积的异丙醇 ,轻轻混匀 , 于 一加℃下冰
冻 2 h . 10℃下离心 10 m in ( 10 《11) r/ ~ )
,弃上清液留沉
淀物使其自然风干 ;用珊沁 双蒸水充分溶解 , 离心 2
一 s n l n ,将上清液移人干净的 1 . s n i L 离心管中 . 加
人 3 00 拜L 饱和酚和 300 拜L v (氯仿 ) : v (异戊醇 )
= 2 4 : 1 抽提 , 离心取上清液 ; 在上清液中再加 V
(抓仿 ) : V (异戊醇 ) 二 24 : 1 抽提 2 次 , 离心取上清
液 ;加人 1 / 10 体积的 3 m o l / L N 乙A e 和 2 倍体积的
无水乙醇 , 轻轻混匀 , 于 一 20 ℃ 冰冻 Z ;h 离心 10
而 n ( 10 0 00 r/ m in ) , 弃上清液 , 将沉淀物用乙醇洗
涤后 , 自然晾干 . 加人 10 拌L TE 溶解 , 一 20 ℃保
存 .
1
.
2
.
2 反应体 系的确定 20 沙 的反应体系 ( 10
X PCR B ift
e r 2
.
0 拌L , 2 5
orn
l / L M gC 1
2 3
.
0 拌L , 4
~
d / L dN TP
:乙 0 拌L , 0 . 2 拌伽1/ L P ir m e r Z 拌L ,
ddZH O 8
.
8 拜L , :50 gn 模板 D N A Z 拜L , 1 个单位
( )U aT q D N A I ,o1 丫比 oL r a s e o
.
2汕 ) , 试剂均购自上
海生工生物工程有限公司 .
· 收稿日期 : 2X() 4 一 0 6一 2 3
甚金项目: 浙江省科委资助项目 (苦竹等多用途经济竹类深度开发研究 ) .
作者简介 :杨 萍 ( 1% 9 一 ) , 女 , 工程师 , 硕士 , 主要从事林木生物技术方面的研究 .
云南大学学报 ( 自然科学版 )第 2 6卷
T ab
.
1
序号
表 l材料来源
T h r e s o u c ef on r at r eil a
s
称 采集地
大明竹P 如曲2仍 t us gr a, ￡~ ( 玫
a l l l
) N
a
ak i
川竹 P . 五 m m乞艺 ( C ar r . ) N a k a i
宜兴苦竹 P .拟￡” g 斑垅、 S . Y . hC en
硬头苦竹 P汉份己g斌八, 乙彻 t猫 s . Y . hC en
大黄苦竹 0 1之g 乃 at c入笋` m s u ha t~ C
.
P
.
w an g et G
.
H
.
eY
肿节竹 C白饭 ,扣 d “ m 仪以侧和加 ut m ( Z . P . w 击堪 e t G . H . eY )
烂头苦竹
高舌苦竹 P . al ilt ￡g u la t猫 S . L . hC en et G . Y . S h e n g
衙县苦竹 P . j~ ~
:
w en et al
垂枝苦竹 Va v . 如以“ lifo “ us S . Y . Che n
长叶苦竹 R疏叻阮 st 玛 、￡~ “ ( ( )叮
.
) Na ka i
小黄苦竹 O1 2go s at c产聊必1刀 fuj ￡~ 钻 c
.
P
.
w an g et G
.
H
.
eY
螺节竹 P le 伪 b如 tus g ar ha ~ f
.
m o it印 i alr is
短穆竹 & 阴认。耐￡、 而 d en s诬刀。 ar ( R e n id e) W en
黄条金刚竹 leP 沥饭s扭、 ko n go s o l砚群“ ￡5 f . a u。 一 、 t由 tus M orU iet yu k . T an a k a
斑苦竹 P . 、 cu 勿 t us (M e duer ) C . D . 口川 et C . S . C卜a o
秋竹 尸俪《仍ha 姗 。坛” us W e n
杭州植物园
安吉竹种园
杭州植物园
安吉竹种园
安吉竹种园
安吉竹种园
安吉竹种园
安吉竹种园
杭州植物园
安吉竹种园
杭州植物园
安吉竹种园
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杭州植物园
安吉竹种园
910234巧67
竹种学名依据参考文献【9] . 黄条金刚竹 、 螺节竹学名依据文献 , 烂头苦竹是俗名 .
1
.
2
.
3 扩增条件的确定 94 ℃预变性 Z m in , 94 ℃
变性 30 5 , 40℃退火 30 5 , 70℃ 延伸 90 5 , 38 个循
环 , 7 2℃延伸 7 而 n , 4℃结束扩增 , 在 P E 9 700 扩增
仪中进行扩增 .
1
.
2
.
4 R八尸D 实验数据统计方法 R八卫D 扩增带
的有无分别用 “ 1 ” 和 “ 0” 表示 , 建立数据文件 . 利用
加拿大 川 b e rt a 大学开发的 P O归GE N3 2 进行统计
分析 . 其中遗传距离 ( g e n e nt i c id st an ce , GD )采用
N ie
’
(S 197 8) 方案进行计算 . 计算公式为 :
dG
, = }dG乙} = X l l 一 2为 / Z X ] .
其中 : 凡 为个体 艺和 j 共有的谱带数 ; X 为多态性
谱带数 .
根据遗传距离采用类平均聚类法 ( U P GW A )
进行聚类分析 , 建立相应树状图 .
表 2 不同引物 P CR 扩增产物的多态性
T ab
.
2 DN A 州 y n ol , ih~ 翻 p liif司 b y id f e r e n t irP me sr
引物 引物序列 扩增片段 供试材料的 种间数段数 基本片段 特异片
2 结果与分析
2
.
1 R A I刃分析结果 采用大量引物 (约 60 条 )
进行初筛和复筛 , 最后选择扩增结果较好且具有多
态性的 20 个引物对所有样品进行扩增 , 共计扩增
3以 个片段 , 扩增条带最多的引物是 豁 31 (见图 1) ,
最少的是 引物 5 71 , 20 个引物平均每个引物产生
巧 . 2 个 R A I勺 片段 , 片段长度多数集中 30 一 2 50
饰 之间 ,各引物的碱基序列和扩增结果如表 2 .
5 4 GG A 们毛口垢T 17 2 15
5 5 飞,GC 〔汇℃ C F IC 16 2 14
里6 GG T 以二C l , G AC 巧 0 15
发8 G T G ACG T AGG 15 0 巧
别5 T G A G CG ACA A 13 0 13
义46 ACC I飞, 1, 以石G 15 2 13
反48 G GC GA A GG了1, 13 2 11
反72 夕代裕 GC A G jA垢 13 1 12
义93 G(〕G l℃T COG’ 1、 14 1 13
别25 AC r G AA CC CC 18 2 16
以31 1 ,议妥CCG CA AA 20 4 16
54 35 CAG CG A (井GT 17 0 17
弘39 〔;T C CGI 、 A C TG 19 0 19
弘45 CCC AGT 口f r 18 0 18
斜46 X( : A CGG G AAG 16 5 11
5 03 ACA C (A乡A以;G 12 2 10
黔 16 门℃ T GC G( 芜汀 16 0 16
5 17 C C ( ; T AC Gl
,
AG 6 1 5
5 26 CG( 二11 ℃们丁G 18 4 14
5 53 CG A (达T G们℃ 13 1 12
合计 30 4 29 275
表 3 中的扩增片段是指引物对供试材料扩增出的谱带数 , 基
本片段是指供试材料都能扩增出的带谱总数 , 特异片段是指所有
供试材料所扩增出的带数 .
第 A 6期 杨 萍 , 等 :利用 R A P D 分子标记对苦竹与近缘竹亲缘关系的研究 65
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5 00 bP
6 00b P
700 bP
8 00 bP
9 00 bP
103 1b P
12D0b P
150 0b P
2 00 0b P
3 00 0b P
图 1 翻3 1 对各个样品 RA P D 扩增
iF g
.
I R川d or 川 y am p liif已 D N A p找刁u e st by ht e p h mer 54 3 1
2
.
2 苦竹及近缘种聚类分析 对苦竹及近缘种的
扩增产物进行统计 , 并将结果输人计算机采用类平
均法 RA尸D分析软件进行聚类分析 , 得到所示的
遗传距离 (见表 3) , 各个竹种之间的遗传距离值在
0
.
2 4 9 0一 0 . 6 35 6 , 其中大明竹 (苦竹属 )与小黄苦
竹 (少穗竹属 )的遗传距离最大为 0 . 635 6 , 衡县苦
竹 (苦竹属 )与硬头苦竹 (苦竹属 )的遗传距离最小
为 0 . 2 4 9 0 , 遗传距离越大 , 表明亲缘关系越远 , 遗
传距离越小 , 表明亲缘关系越近 . 结果可以看出 , 各
个样品之间的遗传距离都大于 0 值 , 又能够聚类在
一起 , 表明苦竹及近缘种之间有相同的遗传背景 ,
但相互间又存在一定的差异 .
表 3 17 个材料间的相似系数
T a b
.
3 T he 咸而 lar 叹 f f id en st be h 阴既盯 17 r n a te拍 115
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 0
.似刃
2 .0 4595 .0 侧】】)
3 .0娥巧 .0 4去粥 .0 (洲刃
4 .0 叨38 .0 4 137 0 .引创 .D仪切
5 .0 4创 8 .0 4义 3 .0 旦刀5 .0 4595 .0 仪X幻
6 .0 3争刃 .0 4753 .0 4(] 38 .0 4么粥 .0 4城刃 .0 (减义X)
7 .0 屯玛7 .0 4753 .0 4今《】.0 4及刃 .0 3臾妇 .0 3 25 .0 叮刃
8 .0 4a万 0 . 4157 0 .加肠 0 . 3洲 7 .0 475 3 .0 月4刃 0 . 又刀5 0 .侧X刃
9 .0 3325 .0 438 9 .0 32抖 .0 加如 .0 4义 3 .0 41 37 .0 3371 .0 28 7 .0 (以幻
10 .0 3臾刃 0 .里祀9 .0 4及刃 .0 3公刃 .0 4主如 .0 4137 0 . 女抖3 .0 4( 脚 .0 23 64 .0 叮X)
n .0 337 1 .0 48 59 .0 423 7 .0 了心5 .0 4595 .0 :4犯9 .0 4〔咫 .0 如 34 .0 引期 .0 别飞珍 .0 (众刃
12 .0 63肠 .0 52巧 .0 48 59 .0 又犯1 .0 , 犯1 .0 男 31 .0 5又刃 .0 48 59 .0 5之拓 .0绷刃 0 . 5352 .0 叮刀
13 .0 423 7 .0 肠 37 .0 引 (刃 .0 4595 .0 3犯1 .0 4翻万 .0 47X() .0 5之拓 .0 454 3 .0里抖 3 0 .夕 95 0 .又犯 1 .0 (以瓦】
14 .0 4137 .0 夕7J 5 .0 4338 0 . 4187 .0 4段巧 .0 4595 .0 4 兑 .0 4 137 0 .义瓦为 0 . 3空幻 .0 3货妇 0 .夕拓5 0 .反吃1 0 .侧夏幻
15 .0 4187 0
.
4叉刃 0 . 5352 0 .了闷 7 0 .只刀5 .0 4女打 0 . 4338 0 .礴谈刃 0 .哭兑 0 .洲月 0 . 3747 0 . 5185 0 . 35夕 0 . 4753 .0 (X 幻
16 0
.朝蛇 0 .印 21 0 . 51刃 0 .月创名 .0 4137 0 . 39沁 .0洲如 0 . 49 13 .0 月(能 0 .了为5 0 .及抖 3 .0 47 53 0 .了阿7 0 . 3557 0 .哭哭 .0侧】X)
17 0
.
49 13 0
.
3之抖 0 .加义 0 .肠 52 .0粼洲 8 .0刃 38 .0 4主如 0 . 2巧5 .0 :州又 .0 3兜 9 .0 如 38 .0引的 0 .铭 59 0 .礴753 .0 4595 0 .叫蛇 .0 叮刃
云南大学学报 (自然科学版 、 第 26卷
3 讨 论
3
.
1 从系统亲缘关系树状图来看 (见图 ) 2, 大黄苦
竹 、小黄苦竹 (少秘竹属 )与其它 15 个样品分为 2
大类 , 苦竹属的 n 个竹种 (大明竹 、 川 竹、 宜兴苦
竹 、 硬头苦竹 、 高舌苦竹 、衡县苦竹、 垂枝苦竹 、 长叶
苦竹 、 斑苦竹 、 秋竹 、 螺节竹 )聚在一起 , 说明它们有
相同遗传背景 ;它们相互之间遗传距离不同 , 说明
它们有一定的差异 , R八尸D 能完全区分各个竹种 ,
尽管分类结果与经典的分类结果有一定的差异 , 但
证明 R A P D分子标记可以对竹类植物种下等级进
行分类 [ 10 ·川 .
3
.
2 从 日本引进的黄条金刚竹在形态上与苦竹属
相差很大 , 但从系统亲缘关系树状图来看 日本引进
的大明竹和黄条金刚竹与苦竹属聚类在一起 , 说明
中 、 日产的苦竹没有分成 2 类 , 这与杨光耀〔`2 ]的结
果相同 , 同时也说明了在分子水平黄条金刚竹的分
类地位归属于苦竹属 .
3
.
3 肿节竹 (肿节竹属 ) 、 短穗竹 (业平竹属 )没有
完全与苦竹属分开 , 这有等待进一步研究 ;新的竹
种一烂头苦竹与斑苦竹的遗传距离为 0 . 374 7 , 均
被聚在苦竹属 , 说明烂头苦竹在分子水平分类地位
归属于苦竹属 , 也有可能它并不是一个新的竹种 ,
只是形态上受环境影响发生变化 .
大明竹 l
硬头苦竹4
衡县苦竹 9
垂枝苦竹 10
长叶苦竹 1
短称竹 4
肿节竹6
烂头苦竹7
斑苦竹 16
螺节竹 13
黄条金刚竹巧
川竹2
宜兴苦竹 3
秋竹 7
大黄苦竹5
小黄苦竹 12
0 2 4
图 2
6 8 10 12 14 16 18
根据相似系数 应用 U甲G M叭构建的树状图
2 0 2 2 24 2 6 28
F ig
.
2 D即面软am g e n er a t己 us吨 1护G AM al 即 ir thm a e cor id gn ot is而 l面 yt e o r e fl iic en t
第 6 A期 杨 萍 , 等 :利用 R AI 勺分子标记对苦竹与近缘竹亲缘关系的研究
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.
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