全 文 ：第 31卷　第 1期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 31 No. 1
2003年 2月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Feb. 2003
黄花棘豆生物碱对体外大鼠卵黄囊
胎盘结构及功能的影响
吴永魁 ,常国权
(解放军军需大学军事兽医研究所 ,长春 130062)
　　 [摘　要 ]　结合电镜技术 ,应用体外全胚胎培养 ( W EC)方法 ,观察了黄花棘豆生物碱对大鼠卵黄囊 ( YS)胎盘
及胚胎的影响。 结果表明 ,黄花棘豆生物碱质量浓度在 50μg /m L以上时 , YS血管分化程度明显减低 ,对胚胎器官
形态学分化的影响有剂量反应关系 ;质量浓度在 200μg /m L时 , YS直径和畸胎数与对照组有显著差异。 电镜观察
发现 ,剂量在 50μg /mL以上时 , YS上皮细胞微绒毛稀疏变短 ,胞质中贮液泡减少 ,线粒体、内质网等内膜系统发生
多种细胞病理学改变 ,细胞间隙增宽 ,连接复合体破坏。表明 YS血管分化及其超微结构对棘豆生物碱反应敏感 ,其
分化程度与对胚胎发育程度的影响一致 ,可以认为 YS结构与功能受损是黄花棘豆生物碱导致胚胎发育毒性所致。
[关键词 ]　黄花棘豆 ;生物碱 ;卵黄囊胎盘 ;全胚胎培养
[中图分类号 ]　 S865. 1+ 20. 3; S859. 83　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2003) 01-0117-04
　　棘豆属 (Oxy tropis )植物在我国西北牧区草场
广泛分布 ,是危害最严重的毒草 ,其不但能引起多种
家畜中毒死亡 ,而且还能使家畜繁殖性能下降 ,因
此 ,已成为牧区草地畜牧业发展的一大障碍。生物碱
是棘豆的主要有毒成分 [1, 2 ] ,其在抗肿瘤等方面的药
用价值已引起人们的关注 [3 ]。毒理学研究表明 ,生物
碱对体外培养大鼠胚胎有直接发育毒性 [4 ]。 卵黄囊
( Yolk Sac, YS)胎盘是啮齿类动物早期器官形成期
胚胎与母体进行物质交换的主要场所 [5 ] , YS结构与
功能受损 ,必然影响胚胎的生长发育。本试验采用研
究 YS功能的模型之一——体外全胚胎培养 ( Whole
Embryo Culture, WEC)法 ,结合电镜技术 ,探讨了
黄花棘豆 (O .ochrocephala )生物碱对 YS结构及功
能的影响。
1　材料和方法
黄花棘豆生物碱　黄花棘豆于花期至结荚期采
集于甘肃 ,自然阴干后粉碎。生物碱提取采用醇类溶
剂提取法 [6 ] ,经生物碱沉淀反应和薄板层析鉴定 ,至
少有 4种生物碱成分。
动　物　Wistar大鼠 (雄鼠体重> 280 g ,雌鼠
体重> 250 g )由吉林大学实验动物中心提供。 雌雄
按 1∶ 1于 18: 00合笼 ,次日晨阴道涂片 ,发现精子
定为妊娠 0 d。
培养基　采取大鼠血液 ,立即分离血清 ,经 56
℃ , 30 min灭活 , 并加 入 30 mg /L 青霉素 和
50μg /mL链霉素 , - 20℃冰箱保存。
胚胎分离与培养　取妊娠 9. 5 d大鼠处死 ,在
超净工作台上分离胚胎 ,用自制旋转培养装置培养
胚胎 48 h,培养期间分 4次充入含有不同比例 O2 ,
CO2和 N2的混合气体 [4 ]。
试验分组　试验共分 6组。①体外对照组: 9. 5
d大鼠胚胎体外培养 48 h;②溶剂对照组:培养基中
加入体积分数 0. 1%的 DMSO;③黄花棘豆生物碱
1 ～ 4 组: 质 量 浓 度 分 别 为 25, 50, 100 和
200μg /m L,开始培养时直接加入培养基 ,并补足
DMSO与溶剂对照组浓度相同。
观测指标　培养 48 h后 ,在解剖显微镜下用目
镜测微尺测 YS直径。按 Brown形态学记分方法对
YS血管分化程度和胚胎器官形态学发育状况评
分 [7 ]。并将剥下的 YS用体积分数 2. 5%戊二醛固
定 ,经冲洗、再固定、脱水、包埋、制片和染色后 ,透射
电镜下观察其超微结构的变化。
数据处理　应用 SAS统计软件对数据进行 t
检测、i2检验和相关性分析 ,确定差异显著性。
2　结果与分析
2. 1　黄花棘豆生物碱对 YS及胚胎发育的影响
培养 48 h后 ,溶剂对照组与体外对照组胚胎的
各项指标近似 (表 1)。由表 1可见 ,棘豆生物碱在剂
[收稿日期 ]　 2002-01-24
[作者简介 ]　吴永魁 ( 1963- ) ,男 ,河北正定人 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事兽医药理毒理及新药安全性评价研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2003. 01. 026
量 50μg /mL以上时 , YS血管分化程度低于对照组
( P < 0. 01) ,胚胎器官分化总记分也低于对照组 ( P
< 0. 01) ,而 Y S直径在剂量 200μg /mL时才低于对
照组 (P < 0. 01) ,胚胎总记分和畸形率与剂量之间
具有直线相关关系。
表 1　黄花棘豆生物碱对大鼠 YS及胚胎发育的影响
Table 1　 Effects o fOxytropis ochrocephala alkaloid on YS and embryo development
组别
Groups
剂量 /
(μg· mL- 1)
Dose
胚胎数
Emb ryo
numbers
YS直径 /mm
YS diameter
YS血管分化记分
YS blood vess el
dif f erentiat ion
score
畸胎数
Malformed
em bryo
numbers
畸胎率 /%
Malformed
emb ryo
ratio
Brow n总记分
Brown total
score
体外对照 In vi tro con t rol 19 4. 35± 0. 27 3. 00± 0. 00 0 0 48. 89± 1. 91
溶剂对照 Solvent cont rol 1. 00 18 4. 39± 0. 44 3. 00± 0. 00 3 16. 7 48. 67± 2. 28
黄花棘豆生物碱 Oxytrop is
ochrocepha la alkaloid 25 11 4. 27± 0. 21 3. 00± 0. 00 2 18. 2 47. 27± 1. 74
50 16 4. 40± 0. 76 2. 44± 0. 51* * 4 25. 0 43. 94± 3. 15* *
100 16 4. 13± 0. 26 2. 56± 0. 63* * 7 43. 8 38. 75± 6. 17* *
200 15 3. 95± 0. 43* * 1. 87± 0. 74* * 11 73. 3* * 33. 47± 6. 76* *
　　注: * * 示与溶剂对照组比较 , P < 0. 01。
Note: * * Comparis on w i th solv en t cont rol group, P < 0. 01.
2. 2　黄花棘豆生物碱对 YS超微结构的影响
透射电镜观察表明 ,正常体外培养 11. 5 d,胚胎
YS内胚层上皮细胞顶部有大量微绒毛 ,胞质顶部
有饮泡和大量贮液泡 ,各种细胞器正常 ,基底部膜正
常 ,细胞间连接紧密 (图版 A,图版 B)。 棘豆生物碱
在 50μg /mL以上时 ,可使培养胚胎 YS内胚层上皮
细胞表面微绒毛稀疏、变短、脱落 ,有的发生肿胀 (图
版 C) ;胞质顶部饮泡和贮液泡减少 ,并出现电子密
度较低的更大的液泡 ,其中分布有次级溶酶体和过
氧化酶体 (图版 D);胞质内尤其基底部有大量空泡 ,
有的空泡内有均质性物质 ,有的有髓样结构 (图版
E) ;局部胞质溶解 ,细胞器坏死、消失 ,出现溶解斑 ;
线粒体肿胀 ,嵴排列紊乱 ,减少或消失成空泡 ;粗面
内质网数量减少 ;高尔基器减少 ,细胞核形态不规
则 ,有的出现电子密度高的圆形类包涵物 (图版 F) ;
上皮细胞间隙增大 ,连接复合体破坏 ;基底膜断裂 ,
局部变厚 (图版 D,图版 E) ;间质层毛细血管数量减
少。并且随剂量增加 ,细胞病理学损害加重。
3　讨　论
啮齿类动物胚胎在绒毛膜尿囊胎盘循环建立之
前 ,即在早期器官形成期 ,主要依赖 YS胎盘与母体
进行物质交换 , YS是胚胎发育的第一个功能胎盘。
YS由上皮细胞、间质层和间皮层构成。柱状上皮细
胞顶端微绒毛有很高内吞活性 ,具有对小分子的转
运和对来自母体大分子的内吞作用 ,以及随后在溶
酶体内的消化与代谢 ,使其具有组织营养功能。另
外 , YS还对维生素 B12、钙、其他离子、糖和氨基酸的
转运系统有旺盛的合成作用 ,并分泌大量蛋白质。
YS中的血岛是胚胎最早的造血器官 ,也是哺乳动
物免疫系统的发生器官。 任何对 YS结构和功能的
损害均可影响胚胎的生长发育 ,并导致胚胎发育毒
性 [5 ]。黄花棘豆生物碱在 50μg /mL以上时 ,对 YS
血管分化有明显抑制作用 ,进而影响了 YS血液循
环 ,并在该剂量条件下导致胚胎器官形态学分化程
度减低 ,二者有明显相关性。而 YS直径在剂量增加
到 200μg /mL时才小于对照组。因此 , YS血管分化
程度较 YS直径更能反映棘豆生物碱对胚胎形态学
分化的影响。随剂量增加 ,在对胚胎形态学分化影响
加重的同时 ,胚胎畸形也随之增加 ,但在 200μg /mL
时才显现统计学意义 ,这与影响 Y S直径的剂量是
一致的。因此 ,产生胚胎致畸效应所需剂量比影响
YS和胚胎发育所需剂量要大。这一方面说明 YS血
管分化对有害物质反应敏感 ,并与影响胚胎发育程
度一致 ,另一方面说明 YS或胚胎本身对致畸可能
有一定保护作用。
形态学改变是功能改变的重要特征之一 [7 ] ,黄
花棘豆生物碱对 YS形态学的影响 ,如血管分化程
度减低、超微结构的改变等 ,均可影响其功能。 YS
上皮细胞微绒毛以及胞内饮泡和贮液泡的减少 ,说
明其内吞功能减弱 ,摄取营养物质减少 ;内质网数量
减少使蛋白质合成和转运能力以及脂类、糖类代谢
能力降低 ;线粒体损害使细胞内氧化磷酸化作用减
弱 ,产生 AT P减少 ;高尔基器减少可影响糖蛋白的
118 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 31卷
图版　黄花棘豆生物碱对 YS超微结构的影响
A.正常培养 11. 5 d的胚胎 YS内胚层上皮细胞　× 5 000; B.正常培养 11. 5 d胚胎 YS内胚层上皮细胞　× 16 000;
C. 200μg /mL处理　× 8 000; D. 50μg /mL处理　× 6 000; E. 50μg /m L处理　× 5 000; F. 200μg /m L处理　× 8 000
Pla te　 Effec ts o f Oxy tropis ochrocephala a lkaloid on YS supermicro str uctur e
A. 11. 5 Day YS endodermal epithelium cell of no rmal culture embryo× 5 000; B. 11. 5 Day YS endoderm al epi th elium cell
of normal cu lture embryo× 16 000; C. Dispos e 200μg /m L× 8 000; D. Dispos e 50μg /mL× 6 000; E. Dispose 50μg /m L× 5 000;
F. Dispos e 200μg /mL× 8 000
119第 1期 吴永魁等: 黄花棘豆生物碱对体外大鼠卵黄囊胎盘结构及功能的影响
合成、加工、分泌及膜的转变 ;细胞间隙增大使细胞
之间联系出现障碍 ,细胞间通讯及相互作用失调 ;基
膜受损也使细胞内环境改变。 由结构损害所致 YS
功能出现障碍 ,特别是内吞作用减弱 ,使处于易感期
快速增殖和分化的胚胎细胞营养紊乱 ,功能失调 ,最
终导致胚胎发育异常。 而棘豆生物碱引起 YS血管
分化程度减低、 YS超微结构改变及胚胎发育障碍
的剂量均为 50μg /mL。因此 , YS胎盘结构与功能
受损是黄花棘豆生物碱导致胚胎发育毒性的重要机
制。 胎儿生长和发育的不同阶段 , YS有不同功能 ,
而且 YS上皮不同区域的超微结构几乎没有差
异 [5 ]。将 YS作为一个重要的靶组织 ,从研究其结构
和功能入手 ,应用研究 Y S功能的不同技术方法 ,将
进一步阐明有害物质对 YS胎盘及胚胎发育的影
响。
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Effects of Oxytropis ochrocephala alkaloid on structure and
function of rat yo lk sac placenta in vitro
WU Yong-kui, CHANG Guo-quan
(Mil itary Veterinary Institute, Quartermaster University of PLA ,Changchun 130062,China )
Abstract: The effects o f Oxytropis ochrocephala alkaloid on rat yo lk sac ( YS) placenta and embryo
development in v itro were investig ated by using the w hole embryo cul ture ( WEC) method and elect ron
microscopy. The resul ts show ed tha t the alkaloid caused remarkable retardation o f YS blood vessel
di fferentia tion and embryo development at dose o f ov er 50 μg /m L. Dose-dependent rela tionship w as
no ticed. At concentra tion o f 200 μg /mL, YS diameter w as low er than tha t of cont rol g roup, and
malfo rmation embryo numbers w ere la rger than that of cont rol g roup. Many pathological changes of the YS
ult ramicrost ructure w ere observ ed a t do se o f over 50μg /m L. The major changes include spa rse and sho rt
and loose microvil li o f endodermal epi thelium cells, a reduction in apical microvesicles and subapical sto rag e
vacuoles, swilling o f the mitochondria and a reduction o r disappear in i t s cristea, a decrease in rough
endoplasmic reticulum , abno rmation in pa t tern and st ructure o f nucleus, an increased vacuo lation in cells,
an ex tend in the interv al o f adjacent cells. The results indicated tha t blood vessel dif ferentiation and
ult ramicrost ruct re of YS w ere sensitiv e to the alkaloid. Damage of YS had a high bea ring on reta rdation of
embryo development. The injuries o f st ructure and barrier to function of YS placenta was an impo rtant
mechanism of the alkaloid that caused embryo developmental toxici ty.
Key words: Oxytropis ochrocephala; alka loid; y olk sac placenta; whole embryo culture
120 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 31卷