全 文 ：西北林学院学报 2006, 21( 6): 90～ 93
Journal of No r thw est Fo r estry Univ e rsity
栾树离体幼胚成苗技术研究
⒇
李桂荣 ,　赵润洲 ,　余义和 ,　王新娟 ,　周　明
(河南科技学院园林学院 , 河南新乡 453003)
摘　要: 通过栾树离体幼胚可以产生愈伤组织和再生植株。外植体消毒时 ,最适宜的方法是先去种
皮再消毒 ,消毒时间酒精处理 30 s,升汞处理 9 min;用 1 mg· L- 1的 GA3对外植体进行预处理 ,可以
促进幼胚的无菌萌发 ; 6-BA有利于幼胚的快速成苗 ,最佳激素浓度为 2 mg· L- 1 , 2, 4-D有利于产
生愈伤组织 ,最佳激素浓度为 2 mg· L- 1 , 5 mg· L- 1的 6-BA与 2, 4-D易导致外植体褐化、坏死 ;在
使用 AC时 ,要考虑到 AC的无选择吸附性 ,应加大使用附加物的浓度或降低 AC的使用量。
关键词: 栾树 ;幼胚 ;离体培养 ;外植体 ;愈伤组织
中图分类号: S792. 04　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-7461( 2006) 06-0090-04
A Technological Study o n Culture in Vi tro of Immature
Embryo o f Koelreuteria paniculata
LI Gui-rong,　 ZHAO Run-zhou,　 YU Yi-he,　WANGXin-juan,　 ZHOU Ming
(College of Landscape , He’ nan Insti tute of Science and Technology , X inx iang , He’ nan 453003,Ch ina )
Abstract: Ca llus and plant lets could be regenera ted by cul ture in vi tro of immature embryo o f Koelreuteria
paniullata . The best method for explant disinfection w as to get rid of the seed coa t first , and the
disinfectant time w ould be 30 s w ith 75% alcohol, then 9 s w ith HgCl2. A pretreatment to the prerequisite
w ith 1 mg· L- 1 GA3 could accelera te the aseptic g ermina tion of the embryo, and the optimal concentration
o f the ho rmone w as 2 mg· L- 1 ; 2, 4-D was fav o rable to the genera tion o f callus, and the optimal
concentra tion of the ho rmone w as 2 mg· L- 1 . Excessiv ely high concentra tions of 6-BA and 2, 4-D would
lead to the russet and death o f the prerequisi te. When AC was applied, the nonselectiv e abso rption must
be considered, ei ther increase the concentration of appendix substances o r decrease the dosage o f AC.
Key words: Koelreuteria paniculata; immature embryo; culture in vi tro; explant; ca llus
　　栾树 ( Koelreuteria paniculata )为无患子科栾
树属乔木。栾树顶生大型圆锥花序 ,膨大蒴果 ,伞形
或球形树冠 ,秋季果实呈黄红色 ,且具紫色膜质果
翅 ,具有较高的观赏价值。 此外 ,栾树具有较高的药
用价值 ,富含黄酮类化合物、木脂素类、有机酸类、缁
醇类以及香豆素类化合物等 ,具有多种药理活
性 [1, 2 ]。近年来 ,随着对栾树化学成分和药理机能以
及园林绿化的深入研究 ,栾树越来越受到人们的重
视。但由于栾树种皮透水、透气性差以及其他生理原
因 ,导致栾树种子发芽率很低 ,仅为 10% [3 ] ,严重阻
碍了对栾树资源的开发和利用。 对栾树的胚进行离
体快速成苗技术研究 ,可为栾树的快速成苗及其资
源的开发利用奠定理论基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
试验在河南科技学院园艺植物组织培养研究室
进行。试验材料为栾树的种胚。于 9月份采集栾树种
子 ,此时种子未成熟 ,种皮由绿变黄 ,种胚绿色、较幼
嫩。
1. 2　方法
外植体处理分为 2种 ,处理 1为先去种皮再消
毒 ,消毒采用 70%的酒精和 0. 1%的升汞。酒精消毒
30 s,然后用无菌水冲洗 2～ 3次 ,再用升汞消毒 8～
⒇ 收稿日期: 2006-03-22　修回日期: 2006-05-08
作者简介:李桂荣 ( 1974-) ,女 ,河南淮阳人 ,硕士研究生 ,讲师 ,主要从事园艺植物育种与生物技术的教学与科研工作。
10 min,最后用无菌水冲洗 4～ 5次。处理 2为先消毒
后去种皮 ,消毒方法同上。 接种时 ,取栾树种子的幼
胚 ,将幼胚的两侧及两端除去 ,切成长约 4 mm、宽约
3 mm的小方块 ,并在幼胚两面各划两刀 ,形态学上
端朝下平放在培养基上。外植体接种前设置预处理 ,
即在无菌条件下进行 GA3浸种 ( 0～ 10 mg· L- 1 , 24
h)。 培养基以 B5为基本培养基 ,添加不同浓度的 6-
BA( 1～ 5 mg· L- 1 )、 2, 4-D ( 0. 5～ 5 mg· L- 1 )、活
性炭 (以下简称 AC) ( 1g· L- 1 ) ,蔗糖 20 g ,琼脂 6 g ,
pH 5. 8左右。每一处理 20瓶 ,重复 3次。暗培养的
温度为 ( 24± 1)℃ , 3 d后改为光培养 ,白天培养温
度为 ( 26± 1)℃ ,夜晚培养温度为 ( 23± 1)℃ ,每天光
照 14 h( 6: 00～ 20: 00)。
2　结果与分析
2. 1　离体幼胚无菌培养体系的建立
　　由表 1可以看出 ,不同的消毒时间和消毒方法对
外植体的消毒效果影响不同。 当消毒时间为 8 min
时 ,处理 1和处理 2污染率分别为 75. 6%和 51. 1% ;随
消毒时间的延长 ,污染率明显下降。当消毒时间为 10
min时 ,污染率分别下降到 15. 6%和 8. 9% 。但随着消
毒时间的延长 ,受伤率也随之上升 ,处理 1和处理 2消
毒时间从 8 min延长到 10 min时 ,受伤率分别从 4.
4%和 0增加到 24. 4%和 6. 7%。
表 1　升汞不同消毒时间的效果
Table 1　 Ef fect of HgCl2 dif ferent of di sin fectant t ime
处理 接种材料数
/个
消毒时间
/min
污染数
/个
受伤数
/个
污染率
/%
受伤率
/%
总污染数
/个
总污染率
/%
处理 1
45 8 34 2 75. 6 4. 4
45 9 19 3 42. 2 6. 6
45 10 7 11 15. 6 24. 4
60 44. 4
处理 2
45 8 23 0 51. 1 0
45 9 12 1 26. 6 2. 2
45 10 4 3 8. 9 6. 7
39 28. 9
　　消毒方法对污染率和受伤率有明显的影响。处
理 2的消毒效果 (包括污染率和受伤率 )明显优于处
理 1,其主要原因是由于种皮的保护作用 ,一方面能
够保护种胚免受外界环境的污染 ,同时还可以保护
种胚不受伤害。对于未成熟的种子可以采用处理 2
的方法进行外植体消毒 ,但对于成熟种子则不能 ,因
为成熟种子的外种皮坚硬 ,在无菌条件下不易剥种
皮。综合以上各因素 ,在对栾树未成熟胚进行离体培
养时 ,最佳外植体的消毒方法是先去种皮再消毒 ,消
毒时间酒精处理 30 s,升汞处理 9 min。
2. 2　外植体的无菌萌发
幼胚有 2种生长方式 ,即产生愈伤组织和直接
成苗。接种 20 d后 ,部分幼胚切口边缘产生少量愈
伤组织 ,呈团状 ,生长致密 ,浅绿色 ,但其后未见有植
株发生 ;大部分子叶是直接产生幼苗 (图 1) ,幼苗单
生 ,同时产生主根 ,须根少或无。
接种 24 d的幼胚　　　　　转接后形成的幼苗　　　　　接种 40 d后形成的幼苗
图 1　栾树离体幼胚的植株再生
Fig. 1　 Plant let regen eration of K . paniul lata in vi t ro immatu re emb ryo
2. 3　预处理对离体胚成苗和愈伤组织形成的影响
研究表明 (表 2) ,接种后 20 d后 ,在没有添加
GA3的培养基 (空白对照 )上 ,幼胚萌发率较低 ,愈
伤组织的诱导率较高 ;添加 1 mg· LGA3的培养基
91第 6期 李桂荣等　栾树离体幼胚成苗技术研究
上 ,幼胚萌发率明显优于对照 ,但愈伤组织的诱导率
较对照有所降低 ;随着 GA3的浓度的增加 ,幼胚萌
发率逐渐减低 ,表现出抑制作用 ,对愈伤组织的诱导
表现出完全的抑制。适宜的 GA3浓度 ( 1 mg· L- 1 )
能够促进幼胚的萌发 ,其主要原因是 GA3具有打破
休眠的作用。因此 , 1 mg /L的 GA3对离体胚进行预
处理有利于幼胚的快速萌发和直接成苗。
2. 4　 6-BA、 2, 4-D对离体胚成苗和产生愈伤组织
的影响
　　体细胞转化为胚性细胞是进行离体培养和基因
差别表达的结果。但基因的差别表达需要一定的内
外条件的诱导 ,也就是说细胞分化必须具有相应的
诱导因子。影响细胞分化的因素很多 ,其中最重要的
是激素的调节作用。
表 2　不同预处理对离体胚成苗的影响
Table 2　 Ef fect of dif f erent p ret reatmen t on bud grow th of immatu re em bryo
GA3浓度
/mg· L- 1 接种数 幼胚萌发数
幼胚萌发率
/%
诱导愈伤组织数 愈伤组织诱导率
/%
0 50 2 4. 0 6 12. 0
1 53 17 32. 1 3 5. 7
5 49 11 22. 4 0 0. 0
10 50 12 24. 0 0 0. 0
　　表 3表明 , 6-BA、 2, 4-D对离体胚的直接成苗和
愈伤组织的产生不是必须的 ,在没有任何激素的情
况下 ,有少数的幼胚可以萌发 ,且有少量的愈伤组织
产生。 适量的 6-BA、 2, 4-D能够促进幼胚的萌发和
愈伤组织的产生 ,单独加入 2 mg· L- 1的 6-BA能够
增加幼胚萌发率 ,但 6-BA的浓度并不是越高越好 ,
高浓度的 6-BA( 5 mg· L- 1 )反而对幼胚的萌发产生
抑制作用 ,且易导致外植体的褐化、坏死 ;只加入 2
mg· L- 1的 2, 4-D时 ,使愈伤组织诱导率从 5. 7%增
加到 34. 1% ,同样高浓度的 2, 4-D( 5 mg· L- 1 )也对
愈伤组织的诱导产生抑制作用。同时 ,加入 6-BA和
2, 4-D,会使二者有利的促进作用相对地减弱 ,即 6-
BA的添加会使 2, 4-D对愈伤组织诱导的促进作用
受到抑制 ,加入 2, 4-D也会削弱 6-BA提高幼胚萌发
率的作用。适宜诱导愈伤组织的激素为 2 mg· L- 1
的 2, 4-D,有利于增加幼胚萌发数量的激素为 2 mg
· L- 1的 6-BA。
表 3　不同种类、浓度的激素对离体胚直接成苗和产生愈伤组织的影响
Tab le 3　 Ef fect of dif f erent kinds and concent rations of h ormone on cul ture in vi t ro
in immature embryo ger minating di rect ly and callus production
培养基号 6-BA
/mg· L- 1
2, 4-D
/mg· L- 1 接种数 幼胚萌发数
幼胚萌发率
/%
诱导愈伤组织数 愈伤组织诱导率
/%
1 0 0 35 8 22. 9 2 5. 7
2 0 0. 5 40 5 12. 5 7 17. 5
3 0 1 43 4 9. 3 8 18. 6
4 0 2 41 2 4. 9 14 34. 1
5 0 5 42 3 7. 1 9 21. 4
6 1 0 40 11 27. 5 5 12. 5
7 2 0 40 17 42. 5 0 0
8 5 0 42 9 21. 4 0 0
9 2 2 41 8 19. 5 6 14. 6
2. 5　 AC在离体胚培养中的应用
AC可以吸附培养基中的有害物质 ,包括琼脂
中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物
质 ,以及蔗糖在高压灭菌时产生的 5-羟甲基糠醛等 ,
从而有利于培养物的生长 [4 ]。在 1～ 9号培养基中加
入 1 mg· L- 1的 AC,结果表明 ,在添加有 2 mg·
L
- 1 , 4-D和 2 mg· L- 1 6-BA的培养基中 ,其生长并
不是最好 ,不过在这两种培养基上表现出褐化、坏死
现象有所缓解 ;生长最好的培养基是添加有高质量
浓度的 2, 4-D和 6-BA的培养基 ,而且较原先表现出
92 西北林学院学报 21卷　
的褐化、坏死现象有较大的减轻。产生此种现象的原
因是 AC的吸附作用不具有选择性 ,其在吸附有害
物质的同时 ,也将激素等有益附加物吸收了。因此在
使用 AC时 ,要考虑到 AC的无选择吸附性 ,应加大
使用附加物的浓度。
3　结论与讨论
研究结果表明 ,在外植体进行消毒时 ,最佳的处
理方式是先去种皮再消毒 ,消毒时间酒精处理 30 s,
升汞处理 9 min;用 1 mg· L- 1的 GA3对外植体进行
预处理 ,可以促进幼胚的无菌萌发 ;在培养过程中 ,
6-BA、 2, 4-D对离体胚的直接成苗和愈伤组织的产
生不是必需的 ,但培养基中单独添加 2, 4-D有利于
愈伤组织诱导 ,其中以 2 mg· L- 1的 2, 4-D最好 ,单
独添加 6-BA有利于增加幼胚萌发数 ,以 2 mg· L- 1
的 6-BA表现最佳 ;过高浓度的 6-BA、 2, 4-D易导致
外植体的褐化、坏死 ;在使用 AC时 ,要考虑到 AC的
无选择吸附性 ,加大使用附加物的浓度或降低 AC
的使用量。
无患子科进行离体培养研究较多是荔枝属和龙
眼属 ,而栾树属在国内尚未见报道。黄祖珍等最早报
道了荔枝成熟胚培养获得小苗的研究 [5 ];傅莲芳、周
丽侬等从荔枝的花药、幼胚中诱导出了愈伤组织 ,并
分化出胚状体和再生植株 [6, 7 ];邝哲师等也从荔枝幼
胚的愈伤组织中成功地分化出体胚 ,并转化成完整
的再生植株 ,从而为名优品种的推广种植提供了基
础 [8 ] ;赖钟雄等研究了龙眼胚性细胞的建立与保持 ,
指出龙眼幼胚培养诱导愈伤组织 ,生长调节剂不是
必须的 ,但要获得松散的愈伤组织类型 ,必需附加一
定质量浓度的 2, 4-D,且以单独使用为佳 ;并且在
0. 1～ 2 mg· L- 1的范围内 ,诱导率随质量浓度的增
加而升高 ,并在 2 mg· L- 1时达到 73. 33%。此外 ,过
高浓度的 2, 4-D不利于愈伤组织的诱导 [9 ] ,这与本
研究结果相似。据报道 [ 10] , 2, 4-D的存在对荔枝胚
性愈伤组织的诱导有重要影响 ,当蔗糖浓度为 30 g
· L- 1或 50 g· L- 1时 , 2, 4-D为 2～ 4 mg· L- 1时均
有最好的结果 ;而 2, 4-D为 1 mg· L- 1时 ,诱导率大
大降低 。赖钟雄认为培养基附加 AC(质量浓度为 5
mg· L- 1 ) ,不仅愈伤组织诱导率降低 ,而且得到的
愈伤组织只是白色紧实类型 ,并认为 AC在龙眼松
散型胚性愈伤组织的诱导中是有害的 ,应避免添
加 [9 ]。研究表明 [11 ] ,每毫克活性炭大约能吸附 100
mg左右的生长调节物质 ,尤其是当较高浓度的活
性炭与常量的生长物质同时使用时 ,活性炭常常抵
消生长调节物质的作用。 作者认为 ,在使用 AC时 ,
要考虑到 AC的无选择吸附性 ,应加大使用附加物
的浓度或降低 AC的使用量 ,从而发挥 AC的作用。
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93第 6期 李桂荣等　栾树离体幼胚成苗技术研究