全 文 ：食用菌学报２０１５．２２（４）：３７～３９
收稿日期：２０１５－０８－２０原稿；２０１５－０９－０１修改稿
基金项目：山东省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队（ＳＤＡＩＴ－１１－０１１－１１）项目资助
作者简介：陈蒙蒙（１９８９－），女，在读硕士，主要研究方向为菌物资源与利用。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｘｉａｎｈａｏ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．１６４８８／ｊ．ｃｎｋｉ．１００５－９８７３．２０１５．０４．００７
茶藨子叶状层菌固体培养特性
陈蒙蒙，程显好＊，孙　磊，刘　宇，李维焕
（鲁东大学农学院，山东烟台２６４０２５）
摘　要：研究了６种不同培养基对茶藨子叶状层菌（Ｐｈｙｌｏｐｏｒｉａ　ｒｉｂｉｓ）菌丝形态、生长速度、生物量及三萜含量
的影响。结果表明：茶藨子叶状层菌菌丝体在麦芽汁、胡萝卜和ＰＤＡ固体培养基中生长速度较快，在麦麸与
ＰＤＡ固体培养基中生物量较高，而在生长速度最慢的ＧＰＹ固体培养基中，三萜含量最高。
关键词：茶藨子叶状层菌；固体培养；培养特性；三萜
　　茶藨子叶状层菌（Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａ　ｒｉｂｉｓ）为锈革
孔 菌 科 （Ｈｙｍｅｎｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）叶 状 层 菌 属
（Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａ）真菌，发现于山东省平邑县，寄生
在当地金银花树活体根茎韧皮部，当地人称之为
“银花蛾子”。茶藨子叶状层菌子实体的功效与
金银花有相似之处，可用于消炎、解毒、止痛，当
地居民用其治疗咽炎、喉炎、肝炎及癌症，有良好
的临床治疗效果，具有很大的药用开发价值［１］。
由于受寄主和产地的限制，野生茶藨子叶状层菌
采集量很低，限制了对其进一步的开发与利用，
目前对它的研究主要集中在采集的野生子实体
活性成分分析，而对于其人工培养方面的研究较
少，因此，探讨其固体培养特性可为其下一步大
规模人工培养奠定基础。
１　材料与方法
１．１标本与菌种
　　野生茶藨子叶状层菌（Ｐ．ｒｉｂｉｓ）采集于山东
省平邑县郑城镇西山的金银花树上（封三图１），
子实体形状不规则，呈扁平状半圆形，菌盖表面
粗糙，硬而韧，木质化，瓦状叠生排列，深棕色至
浅栗色，有同心环状棱纹似年轮及细微绒毛，菌
盖长为３～６ｃｍ，宽为１．５～３．５ｃｍ，无菌柄，子实
体背面暗褐色，肉眼可见细小的管口，管口浅褐
色至暗褐色，断面可见菌肉呈木质化的纤维质，
棕黄色，菌管长１～２ｍｍ。经吉林农业大学菌物
研究所图力古尔教授鉴定，该标本为茶藨子叶状
层
菌。采用组织分离法分离菌种，将新鲜子实体标本
用大量无菌水冲洗至表面无泥沙杂物，再用７５％
的酒精擦拭表面，将菌盖纵剖为二，用尖头镊子从
剖面上取５ｍｍ×５ｍｍ的菌肉组织，置于ＰＤＡ平
板，２５℃下暗培养，选取生长良好的菌丝，转接到
ＰＤＡ平板，反复纯化，选取生长健壮的菌丝转接至
试管斜面ＰＤＡ培养基，４℃冰箱保存。
１．２培养基
　　麦芽汁固体培养基（ｇ／Ｌ）：５０麦芽汁，１５
琼脂。
胡萝卜固体培养基（ｇ／Ｌ）：２００胡萝卜（煮
汁），２０葡萄糖，１５琼脂。
麦麸固体培养基（ｇ／Ｌ）：３０麦麸（煮汁），２０
葡萄糖，３ＫＨ２ＰＯ４，１．５ＭｇＳＯ４，１５琼脂。
ＧＰＣ固体培养基（ｇ／Ｌ）：２０葡萄糖，６蛋白
胨，１０玉米浆，１５琼脂。
ＰＤＡ固体培养基（ｇ／Ｌ）：２００马铃薯（煮汁），
２０葡萄糖，１５琼脂。
ＧＰＹ固体培养基（ｇ／Ｌ）：２０葡萄糖，６蛋白
胨，１０酵母膏，１５琼脂。
１．３菌种鉴定
　　参照 ＭＡＫＩＭＵＲＡ等［２］的方法分别提取茶
藨子叶状层菌子实体样品（削去子实体表层，取
内部组织）ＤＮＡ 和菌丝体 ＤＮＡ。按照刘贵巧
等［３］的方法扩增ＩＴＳ序列，采用真菌ＩＴＳ通用引
物 ＩＴＳ１：５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣ－３
′，ＩＴＳ４：５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′，
食　用　菌　学　报 第２２卷
扩增ＩＴＳ全长序列，每个样品５个重复，３次测
序，得到的扩增产物送往华大基因股份有限公司
测序。
１．４菌丝体培养
　　将１．２中的６种固体培养基分别倒入平板，
凝固后铺上已灭菌的单层玻璃纸（上海金穗生物
科技有限公司产品，用时将０．５ｍ×０．５ｍ的玻
璃纸剪成平板内径大小的圆形），将菌种转接到
ＰＤＡ平板上活化，采用直径为６ｍｍ的打孔器在
生长良好的菌落边缘处取菌块，分别接种于不同
培养基内，２６℃、避光培养，观察菌落生长情况及
菌落特征，从第２０天开始每隔１０ｄ记录菌落直
径，到６０ｄ时结束，每种处理３个重复。
１．５菌丝体生物量和三萜含量测定
　　将每个阶段（２０、３０、４０、５０和６０ｄ）的茶藨子
叶状层菌菌丝体从培养基表面的玻璃纸上刮下，
每种培养基３个重复，称量湿重，然后置于６０℃
烘箱中烘干至恒重，测其干重即为生物量。
按照参考文献［４］的方法制作标准曲线，三
萜标准品为齐墩果酸（≥９８％，上海源叶生物科
技有限公司）。
样品溶液制备：将烘干至恒重的茶藨子叶
状层菌菌丝体研磨，精确称取０．５ｇ粉末，用
９５％的 乙 醇 溶 液 定 容 至 ５０ ｍＬ，用 超 声 波
（４２ｋＨｚ左右）室温提取２ｈ，４８００　ｇ离心１０ｍｉｎ，
取上清液。
样品溶液测定：各取３份０．３ｍＬ样品溶液
至试管中，按标准曲线制作方法在波长５５０ｎｍ
处测定吸光度（Ａ）值，根据标准曲线计算菌丝中
三萜含量。
１．６统计学处理
　　采用ＳＰＳＳ１７．０进行单因素方差分析。
２　结果与分析
２．１菌种鉴定
　　经过测序，茶藨子叶状层菌子实体样品ＩＴＳ
序列与分离纯化后的菌种ＩＴＳ序列完全一致，确
定该菌种为茶藨子叶状层菌。
２．２菌丝体形态和生长特性
　　此菌在６种培养基上菌丝生长均较缓慢，培
养６０ｄ时菌丝未能覆盖满平板，在麦芽汁、ＰＤＡ、
ＧＰＣ和胡萝卜培养基上菌丝生长比较旺盛；在麦
麸培养基上３０ｄ变色，最快，而在麦芽汁、ＰＤＡ、
ＧＰＣ和胡萝卜固体培养基上变色较慢；６种固体
培养基上的生长速度排序为麦芽汁、胡萝卜、
ＰＤＡ、ＧＰＣ、麦麸和ＧＰＹ（表１）。
表１　茶藨子叶状层菌在不同培养基上的生长特性
Ｔａｂｌｅ　１　Ｇｒｏｗｔｈ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐ．ｒｉｂｉｓ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｄｉａ
培养基
Ｍｅｄｉｕｍ
菌丝生长势
Ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｖｉｇｏｒ
变褐色／木质化时间
Ｔｉｍｅ　ｂｅｆｏｒｅ　ｃｈａｎｇｉｎｇ　ｂｒｏｗｎ
／Ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｄ）
菌丝生长速度
Ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ
（ｍｍ／ｄ）
１ ＋＋ ５０　 １．４±０．１
２ ＋＋ ５０　 １．３±０．０
３ ＋ ３０　 ０．８±０．１
４ ＋＋ ５０　 １．０±０．１
５ ＋＋ ５０　 １．３±０．０
６ ＋ ４０　 ０．４±０．５
１：麦芽汁固体培养基；２：胡萝卜固体培养基；３：麦麸固体培养基；４：ＧＰＣ固体培养基；５：ＰＤＡ固体培养基；６：ＧＰＹ固体培养基；＋：微
弱；＋＋：强壮
Ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ　ａｆｔｅｒ　６０ｄｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．１：Ｍａｌｔ　ｌｉｑｕｏｒ　ａｇａｒ　ｍｅｄｉｕｍ（ｍａｌｔ　ｌｉｑｕｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５．０％ｓｏｌｉｄｓ）；２：Ｃａｒｒｏｔ　ｍｅｄｉｕｍ （ｌｉｑｕｏｒ
ｆｒｏｍ　ｂｏｉｌｉｎｇ　２００ｇ／Ｌ　ｃａｒｒｏｔｓ＋２０ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ）；３：Ｗｈｅａｔ　ｂｒａｎ　ｍｅｄｉｕｍ （ｌｉｑｕｏｒ　ｆｒｏｍ　ｂｏｉｌｉｎｇ　３０ｇ／Ｌ　ｗｈｅａｔ　ｂｒａｎ＋２０ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ＋
３ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４＋１．５ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４）；４：ＧＰＣ（ｇ／Ｌ）（２０ｇｌｕｃｏｓｅ＋６ｐｅｐｔｏｎｅ＋１０ｃｏｒｎ　ｓｔａｒｃｈ）；５：Ｐｏｔａｔｏ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ　ａｇａｒ（ｇ／Ｌ）（ｌｉｑｕｏｒ
ｆｒｏｍ　ｂｏｉｌｉｎｇ　２００ｇ／Ｌ　ｐｏｔａｔｏ＋２０ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ）；６：ＧＰＹ　ｍｅｄｉｕｍ（ｇ／Ｌ，２０ｇｌｕｃｏｓｅ＋６ｐｅｐｔｏｎｅ＋１０ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）．Ａｌ　ｍｅｄｉｕｍ
ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　１５ｇ／Ｌ　ａｇａｒ．＋：ｗｅａｋ；＋＋：ｓｔｒｏｎｇ
２．３菌丝体生物量和三萜含量
　　接种后的２０～３０ｄ，菌丝体生长较缓慢，为
延滞期，３０～５０ｄ，生长较快，为对数生长期，５０ｄ
之后，生物量开始降低，为衰亡期，培养到第５０
天时，麦麸固体培养基的菌丝体生物量最大，平
均干重为８４．２ｍｇ，同期，菌丝体生物量从大到小
的固体培养基依次为ＰＤＡ、ＧＰＣ、胡萝卜、麦芽汁
和ＧＰＹ（图２）。
８３
第４期 陈蒙蒙，等：茶藨子叶状层菌固体培养特性
图２　茶藨子叶状层菌菌丝体在不同
培养基上的生物量
Ｆｉｇ．２　Ｐ．ｒｉｂｉｓ　ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｄｉａ
　　根据齐墩果酸的质量和测得的Ａ 值，得回归
方程：Ｙ＝１４．６９　Ｘ＋０．０４１。
培养６０ｄ以内的菌丝体，从图３的趋势线可
以看出，茶藨子叶状层菌中三萜含量有两种趋
势：一种为随时间延长，三萜含量越来越高，主要
有麦芽汁、麦麸、ＧＰＣ和胡萝卜固体培养基；另一
图３　茶藨子叶状层菌菌丝体中三萜含量的变化
Ｆｉｇ．３　Ｔｒｉｐｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｐ．ｒｉｂｉｓ　ｍｙｃｅｌｉａ
ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｄｉａ
种是随时间延长，三萜含量先升高后降低，主要
是ＧＰＹ固体培养基。第４０天时，ＧＰＹ固体培
养基培养的菌丝体中三萜含量为０．３９％，已经比
第６０天的其他培养基都高，具有较明显的优势；
然后依次为第６０天的胡萝卜、麦麸和 ＧＰＣ固体
培养基。
３　小结
　　固体培养条件下，茶藨子叶状层菌在ＰＤＡ、
麦芽汁和胡萝卜固体培养基上生长更快，但麦麸
固体培养基菌丝体生物量最高，其次依次是
ＰＤＡ、ＧＰＣ、胡萝卜、麦芽汁和ＧＰＹ固体培养基。
茶藨子叶状层菌４０ｄ的ＧＰＹ固体培养基三萜含
量比６０ｄ的胡萝卜固体培养基中高，然后依次为
６０ｄ的胡萝卜、麦麸和ＧＰＣ固体培养基。
参考文献
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ｆｕｎｇａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）［Ｊ］．Ｊ
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Ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａ　ｒｉｂｉｓ　Ｇｒｏｗｎ
ｏｎ　Ｓｉｘ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｓｏｌｉｄ　Ｍｅｄｉａ
ＣＨＥＮ　Ｍｅｎｇｍｅｎｇ，ＣＨＥＮＧ　Ｘｉａｎｈａｏ＊，ＳＵＮ　Ｌｅｉ，ＬＩＵ　Ｙｕ，ＬＩ　Ｗｅｉｈｕａｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｌｕｄｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　２６４０２５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ，ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ
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［本文编辑］　马丹丹
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