全 文 ：第 37 卷 福建热作科技 Vol.37 No.2
第 2 期 Fujian Science & Technology of Tropical Crops 2012
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叉唇虾脊兰 RAPD 反应体系的优化

黄宝华 1，陆銮眉 2
（1．福建省漳州职业技术学院，漳州 363000；2．漳州师范学院，363000）

摘要：以叉唇虾脊兰的幼嫩叶片为试验材料，通过正交试验及单因素逐项优化法对 RAPD 反应体系进行优化。
结果得出较理想的 RAPD-PCR 扩增条件为： 20 μl 体系， DNA1.5 μl（约 30 ng）、Taq 酶 0.30 μl（1.0 U）、
E× Buffer 2 μl、dNTP 0.8 μl（0.20 μmol/L）、引物 1.0 μl（0.25 μmol/L），ddH2O 补至 20μl，退火温度 38 ℃。
从而为进一步研究虾脊兰属植物的遗传多样性奠定了基础。
关键词：叉唇虾脊兰；RAPD；反应体系；优化
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1006—2327—（2012）02—0006—05

叉唇虾脊兰 Calanthe hancockii Rolfe，为兰科虾脊兰属植物，由英国学者 R．A．Rolfe 于 1896 年发
表在 Kew Bull．上，模式标本采自中国，主要分布在广西、云南、四川等[1,2]。陆生兰，常见于山地林
下。属名 Calanthe 意为“美丽的花”，形容该属植物的花极有观赏价值。叉唇虾脊兰在 3 月底至 4 月中
旬为盛花期，开花较多、花朵中等，颜色黄绿至黄褐色，具有香气，是一种很有发展前途的野生花卉，
有待于进一步的开发利用[3,4]。
随机引物扩增多态性 DNA 称为 RAPD(Random amplified polymorphic DNA)，由美国杜邦公司的科
学家 Williams 和加利福尼亚生物研究所 J.Welsh 分别领导的两个小组在 1990 年几乎同时发展起来的一
种新兴分子标记技术[5,6]。RAPD 技术具有操作简单、样品用量少、特异性较强、灵敏度较高和效率较高
等优点，在系统分类学、遗传多样性研究、种质分析鉴定、亲缘关系的演化、分类等方面得到广泛应用。
此外，RAPD 技术在遗传图谱构建、辅助选择育种等方面也有大量研究[7]。RAPD 目前已广泛用于兰科
植物系统分类学、遗传多样性研究、亲缘关系和品种鉴定等方面的应用，从而使兰花的研究与分类鉴定
深入到分子水平[8]。但关于叉唇虾脊兰 RAPD 体系优化的研究尚未见报道，为了更好地利用 RAPD 技术
对叉唇虾脊兰及其他同属植物进行聚类分析，确定品种间亲缘关系，为叉唇虾脊兰的进一步研究提供理
论指导，该试验通过正交试验和单因素逐项优化，探索了叉唇虾脊兰 RAPD 扩增反应条件，最终建立了
一套适合于叉唇虾脊兰最佳的 RAPD 反应体系，以期为进一步研究虾脊兰属植物奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
试验所用植物材料为野生种，于 2006 年从云南引种至福建漳州龙海一苗圃的叉唇虾脊兰
Calanthe hancockii Rolfe，2008 年 7 月开始取样。
试验所用药品如下：Taq 酶（上海申能博彩）、10 X Buffer（上海申能博彩）、RAPD 随机引物
（上海生工）、dNTPs（北京索莱宝）、D2000 DNA Ladder（北京索莱宝）、DNA 琼脂糖（西班牙）、
RNaseA（sigma）。扩增反应在 Biometra 公司生产的 Tgradient PCR 仪上进行。RAPD 引物名称及序
列见表 1。
表 1 供试验用的 RAPD 引物
引物编号 引物序列(5to 3) 引物编号 引物序列(5to 3)
S243 CTATGCCGAC S257 ACCTGGGGAG
S251 AGACCCAGAG
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1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增反应体系的建立
本试验中，PCR 反应体系的建立主要选择正交设计法进行优化。参考谢伟等对 5 种兰花 RAPD 体
系建立的条件[9]，针对模板 DNA（20 ng/μl）、Taq 酶（5 U/μl）、引物（10 μmol/L）与 dNTP（10 mmol/L）
4 种因素，选用正交分析的 L9（34）设计 PCR 反应体系的各因素水平的正交表（表 2）。引物 S251 用
为 PCR 扩增体系筛选引物。通过其扩增结果的条带数、清晰度以及重复性的比较，选取最佳组合。
表 2 虾脊兰 RAPD-PCR 正交试验设计
序号 DNA（μl） dNTPs（μl） Taq 酶（μl） 引物（μl） ExBuffer（μl） H2O(μl)
1 1.5 0.4 0.15 1.0 2 14.95
2 1.5 0.4 0.20 1.5 2 14.40
3 1.5 0.4 0.25 2.0 2 13.85
4 2.0 0.7 0.20 2.0 2 13.10
5 2.0 0.7 0.25 1.0 2 14.05
6 2.0 0.7 0.15 1.5 2 13.65
7 2.5 1.0 0.25 1.5 2 12.75
8 2.5 1.0 0.15 2.0 2 12.35
9 2.5 1.0 0.20 1.0 2 13.30
通过直观分析法[9]对正交结果进行分析，我们发现，试验方案 4 和 5 效果较好，再经过重复的
试验，发现方案 4 和 5 的重复性也较好，但观察到的条带清晰度和数量还未达到最好的效果。因此
我们选用方案 4 和 5 再对之进行单因素条件的优化。
1.2.2 单因素逐项优化
在以上正交试验的基础上，对影响 RAPD 的各因素分别进行优化。一般来说影响条带的因素中
包括 PCR 缓冲液、模板 DNA 浓度、dNTPs 浓度、Mg2+浓度、循环参数（退火温度、变性时间和
PCR 仪的规格型号等）、TaqDNA 聚合酶浓度、引物浓度等等。
因本试验过程中 Mg2+已经预先按照一定的浓度混合在 ExBuffer 中，因此以下主要对模板 DNA
浓度（表 3）、dNTPs 浓度（表 4）、TaqDNA 聚合酶浓度（表 5）、引物浓度（表 6）、退火温度（表
7）进行优化。
除了模板 DNA 浓度的优化选用引物 S243 和 S257 两条同时进行外，其他各项优化均选用引物
S257。
表 3 模板 DNA 浓度
序号 DNA（μl） dNTPs（μl） Taq 酶（μl） 引物（μl） ExBuffer（μl） H2O(μl)
1 0.5 0.6 0.3 1.0 2 15.6
2 1.0 0.6 0.3 1.0 2 15.1
3 1.5 0.6 0.3 1.0 2 14.6
4 2.0 0.6 0.3 1.0 2 14.1
5 2.5 0.6 0.3 1.0 2 13.6
6 3.0 0.6 0.3 1.0 2 13.1
7 3.5 0.6 0.3 1.0 2 12.6
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表 4 dNTPs 浓度
序号 DNA（μl） dNTPs（μl） Taq 酶（μl） 引物（μl） ExBuffer（μl） H2O(μl)
1 1.5 0.2 0.3 1.0 2 15.0
2 1.5 0.4 0.3 1.0 2 14.8
3 1.5 0.6 0.3 1.0 2 14.6
4 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
5 1.5 1.0 0.3 1.0 2 14.2
表 5 TaqDNA 聚合酶浓度
序号 DNA（μl） dNTPs（μl） Taq 酶（μl） 引物（μl） ExBuffer（μl） H2O(μl)
1 1.5 0.8 0.15 1.0 2 14.55
2 1.5 0.8 0.20 1.0 2 14.50
3 1.5 0.8 0.25 1.0 2 14.45
4 1.5 0.8 0.30 1.0 2 14.40
5 1.5 0.8 0.35 1.0 2 14.35
表 6 引物浓度
序号 No. DNA（μl） dNTPs（μl） Taq 酶（μl） 引物（μl）primer ExBuffer（μl） H2O(μl)
1 1.5 0.8 0.3 0.4 2 15.0
2 1.5 0.8 0.3 0.6 2 14.8
3 1.5 0.8 0.3 0.8 2 14.6
4 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
5 1.5 0.8 0.3 1.2 2 14.2
表 7 退火温度
序号 退火温度（℃） DNA（μl） dNTPs（μl） Taq 酶（μl） 引物（μl） ExBuffer（μl） H2O (μl)
1 36 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
2 37 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
3 38 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
4 39 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
5 40 1.5 0.8 0.3 1.0 2 14.4
2 结果与分析
2. 1 模板 DNA 浓度
S243 S257

图 1 DNA 浓度对 RAPD 扩增的影响
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 M 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
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RAPD 试验中，模板 DNA 的量要求不是很严格，一般 10～100ng 均能得到扩增，但各类群的
效果及最优浓度范围各不相同。本试验中采用引物 S243 和 S257 同时进行凝胶电泳检测，DNA 模
板用量设定 7 个梯度：0.5 ul、1.0 ul、1.5 ul、2.0 ul、2.5 ul、3.0 ul 和 3.5 ul。从图 1 可以看出，用引
物 S243 进行凝胶电泳检测时，当 DNA 量在 1.0～3.0 ul 时都能看见扩增条带，但在 1.0 ul 和 1.5 ul
时比较清晰；用引物 S257 进行凝胶电泳检测时，当 DNA
量在 0.5～3.5 ul 时都能看见扩增条带，但在 1.5 ul 和 2.0 ul
时比较清晰。综合两条引物结果，本试验中模板最佳浓度
为 20 ng/ul×1.5 ul=30 ng。
2. 2 dNTPs 浓度
PCR 反应体系中底物 dNTP 的浓度直接影响产物的产
量、特异性及合成的忠实性[6，10]。dNTPs 浓度过高造成 Taq
酶错误的掺入，同时还与反应混合物中的 Taq 酶竞争 Mg2+，
抑制聚合酶的活性；然而，dNTPs 浓度偏低，对合成效率造
成影响，使 dNTP 过早消耗完，而使产物单链化，影响 PCR
扩增效果。在不同的植物种类上，dNTPs 浓度对 PCR 扩增
结果影响是不一样的，本试验用选出的模板 DNA 浓度及表
4 的模式优化 dNTPs 浓度，结果表明在虾脊兰 RAPD-PCR
反应体系中，dNTPs 浓度对其影响较大。结合图 2 及后面的
试验情况，本试验选定 0.8 μl，为 0.20 μmol/L。
2. 3 Taq 酶浓度
图 3 显示，Taq 酶浓度明显影响 RAPD-PCR 反应效果。
本试验用选出的模板 DNA 浓度和 dNTPs 浓度及表 5 的模式
优化 TaqDNA 聚合酶浓度，结果表明，Taq 酶为 0.30 μl
或 0.35 μl 效果都好，条带亮度均较好，但考虑成本因素，
定 0.30 μl 效果较好，为 1.5 U。
2. 4 随机引物浓度优化
随机引物对 RAPD-PCR 反应的特异性和扩增产物的量都有影响。如果引物浓度过低，会出现扩
增几率下降的情况，如果引物浓度过高，则会出现非特异性扩增[11]。用选出的模板 DNA 浓度、dNTPs
浓度和 TaqDNA 聚合酶浓度及表 6 的模式继续优化引物浓度，结果（图 4）表明，引物量为 1.0 μl
图 2 dNTP 浓度对 RAPD 扩增的影响
M 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
图 3 Taq 酶浓度对 RAPD 扩增的影响
M 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
图 4 引物浓度对 RAPD 扩增的影响
0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 M
图 5 退火温度对 RAPD 扩增的影响
M 39 40 36 37 38
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时效果较好，得终浓度为 0.5 µmol/L。
2. 5 退火温度
不同的引物合适的退火温度不尽相同，在扩增反应过程中，设计如表 7 的模式对退火温度进行
优化，结果（图 5）发现，退火温度为 38℃时，具有较好的扩增效果。
3 讨论
3.1 RAPD 稳定性
RAPD 具有快速、简便、灵敏度较高、成本较低等优点，但是在试验中，PCR 反应体系中任何细
微条件的变化都可能引起扩增结果的改变。因此，在对反应参数和程序进行优化外，试验中还注意以下
问题：首先，最好选用同一家公司生产的同一批次的试验试剂与耗材，以便最大范围减少误差；其次，
各种试剂分装成小包装放入-20℃储备，避免因反复冻融而引起生物大分子被破坏；第三，为了更好地
保证试验的准确性和可重复性，应尽可能地保持实验条件的恒定，还要做必要的重复试验。
3.2 随机引物的选择
叉唇虾脊兰进行 RAPD 分析时，使用某些随机引物可能扩增不出条带，因此在试验开始时应先对
随机引物进行筛选，筛选出 RAPD 引物后再进行体系优化，这样可以节省大量时间。
3.3 Mg2+浓度的确定
本试验所用 Mg2+的浓度是根据试验室多年的试验积累并参考了谢伟等（2005）对 5 种兰花 RAPD
体系建立的条件[10]直接配制而成，没有进行单因素优化，虽然扩增结果比较理想，但得出的 Mg2+浓度
未必是最适叉唇虾脊兰的浓度。这是本试验的不足之处，希望在以后的试验中加以改进。
4 结论
本试验通过对叉唇虾脊兰 RAPD-PCR 反应的模板 DNA 浓度、dNTPs 浓度、Taq 酶浓度、引物浓度、
退火温度等各因素的优化。结果表明较理想的 RAPD-PCR 扩增条件为： 20 μl 体系， DNA1.5 μl（约
30 ng）、Taq 酶 0.30 μl(1.5 U)、E× Buffer 2 μl、dNTP 0.8 μl(0.20 μmol/L)、引物 1.0 μl(0.5 μmol/L)，ddH2O
补至 20 μl，退火温度 38℃。

参考文献
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