全 文 ：第 30卷 第 5期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol.30 No.5
2010年 5月 JournalofCentralSouthUniversityofForestry＆Technology May2010
收稿日期:2010-01-12
基金项目:国家林业公益行业科研专项子项目 “中国森林对气候变化的影响与林业适应对策研究 ”(200804001)
作者简介:魏小玲(1983-),女 , 河北任丘人 ,硕士研究生 ,从事生物化学与分子生物学研究
通讯作者:曹福祥(1962-),男 ,湖南新化人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事生物化学与分子生物学研究;E-mail:csfucao@ 163.com
海南木莲基因组 DNA提取及 ISSR反应体系的优化
魏小玲 , 曹福祥 , 陈 建
(中南林业科技大学 , 湖南 长沙 410004)
摘 要:通过对不同提取方法获得的海南木莲 DNA质量进行分析 , 发现采用预先去杂 CTAB法提取的海南木莲
DNA比其它方法简便 、高效 , DNA杂质少 , 得率高;然后通过单因素实验设计对海南木莲 ISSR—PCR反应体系进行优
化 , 确立了适于海南木莲的 ISSR反应体系 , 即 20μL反应体系中含 40 ng模板 DNA、 0.15 mmol· L-1 dNTPs、
0.40 μmol· L-1引物 、2.5 mmol· L-1 Mg2+和 1.5 UTaqDNA聚合酶;最后用 16个海南木莲样品对优化体系进行检
验 , 结果表明该体系扩增效果稳定 , 特异性高 ,可以用于海南木莲分子生物学的进一步研究。
关键词:分子生物学;海南木莲;预先去杂 CTAB法;单因素实验;ISSR—PCR;反应体系
中图分类号:Q781 文献标志码:A 文章编号:1673— 923X(2010)05— 0091 — 06
ExtractionofgenomicDNAandoptimizationofISSRreaction
systemofManglietiahainanensis
WEIXiao-ling, CAOFu-xiang, CHENJian
(CentralSouthUniversityofForestryandTechnology, Changsha410004, Hunan, China)
Abstract:ThegenomicDNAbeingextractedbypredimpurityCTABmethodishighqualitywithlessimpuritythanother
methods.BythesinglefactordesignofISSR-PCRreactionsystem, asatisfactoryISSRreactionsystemwasestablished.The
concentrationofthereactionsystemwasDNAtemplate40 ng, dNTPs0.15 mmol· L-1 , primer0.40 μmol· L-1 , Mg2+ 2.5
mmol· L-1 , TaqDNApolymerase1.5 U.ThereactionsystemwastestedwiththesamplesofsixteenManglietiahainanensis
material.ThepecialbandsofamplicationofISSR-PCRwerebright, orderlyandaregoodtothefollowingmolecularmarker
analysisandbiologyresearch.
Keywords:molecularbiology;Manglietiahainanensis;predeimpurityCTABmethod;singlefactordesign;ISSR-PCR;re-
actionsystem
海南木莲 Manglietiahainanensis别名龙楠树 、绿
楠 、绿兰等 ,为木兰科木莲属常绿乔木 ,该植物不但
树形优美﹑花大艳丽 ,而且还具有药用﹑芳香﹑木
材等多种经济效益 ,极具开发利用价值 。海南木莲
在我国主要生长于海南地区 ,现有种群数量少 ,加之
全球气候变化和人为活动等多种原因 ,种子的繁殖
能力较差 ,林下幼苗极其罕见而处于濒危 ,被列为国
家三级保护植物 。
简单序列重复区间扩增多态性(inter-simplese-
quencerepeat, ISSR)标记技术是 1994年由加拿大的
Zietkiewicz等在微卫星分子标记(SSR)基础上创建
的[ 1-2] 。 ISSR技术利用真核生物基因组中 SSR来
设计引物 ,无需预先克隆和测序。 ISSR技术操作简
单 、成本低 、灵敏度高 ,检测基因组的多态性强 、DNA
模板需要量少 ,是兼 RAPD技术与 SSR技术优点于
一身的分子标记技术 。目前 ISSR技术已在生物的
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 第 30卷
种质鉴定 、遗传多样性检测 、基因定位及遗传图谱等
方面得到广泛应用 [ 3] 。高质量的 DNA和最佳的
PCR反应体系是获得可靠分子标记结果的前提 。
虽然 DNA提取方法和 ISSR-PCR的优化体系报道较
多 ,但目前国内外没有关于海南木莲 ISSR研究的相
关报道 [ 4-6] 。本实验以海南木莲为材料进行 DNA
提取和 ISSR反应体系的优化 ,并用 16个海南木莲
材料对优化后的体系进行检验 ,为海南木莲遗传多
样性的分析奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
海南木莲采自海南省乐东县尖峰岭。选取新鲜
叶片 ,用湿纱布擦洗干净 ,放入 4℃保温箱中带回
实验室 ,置于 -70℃冰箱保存备用。
1.2 主要试剂
十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate, SDS)、
十六烷基三甲基溴化胺(cetyltriethylammoniumbro-
mide, CTAB)、Tris碱 、乙二胺四乙酸二钠 (ethylene
diaminetetraaceticacid, EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)、β —巯基乙醇均为分子生物学纯或分析纯 ,
TaqDNA聚合酶 、 EcoRⅠ 、 RNaseA、 GeneRulerTM
100bpplusDNALadder和 1kbDNALadder购自
Fermentas公司 , ISSR随机引物由上海生物工程技术
有限公司合成。
1.3 DNA提取方法
1.3.1 改良 CTAB提取法
参照周延清等[ 7] 、万玉华等 [ 8]和 Saghai-Maroof
等 [ 9]方法并加以改进 。在研磨的过程中添加适量
的 PVP,提取缓冲液为:150mmol·L-1 Tris-HCl(pH
值 8.0), 30mmol· L-1 EDTA, 1.4mol· L-1 NaCl,
3%CTAB,体积分数 2%β—巯基乙醇 , 20 g/LPVP。
1.3.2 预先去杂 CTAB提取法
根据赵昶灵等 [ 10]和丁晓东等 [ 11]的方法进行设
计 。核分离液:50 mmol· L-1 Tris—HCl(pH值 8.0),
25 mmol· L-1 EDTA, 150 g/L蔗糖 , 20 g/LPVP,
体积分数 2% β —巯基乙醇;提取缓冲液同 1.3.1。
1.3.3 改良 SDS提取法
参照陈大明等 [ 12] 、项艳等 [ 13] 和 Delaporta
等[ 14]方法并加以改进 ,改良 SDS提取缓冲液为:100
mmol· L-1 Tris— HCl(pH值 8.0), 20 mmol· L-1
EDTA—Na2 , 500mmol· L-1 NaCl, 15g/LSDS,体积
分数 0.3% β—巯基乙醇 。
1.3.4 改良高盐低 pH法
根据闫桂琴等 [ 15]方法进行设计 ,在研磨时加入适
量的 PVP,高盐低 pH提取缓冲液为:100 mmol· L-1
Tris—HCl(pH值 8.0), 20 mmol·L-1 EDTA—Na2 , 500
mmol· L-1 NaCl, 15 g/LSDS。
1.4 DNA质量检测
1.4.1 紫外检测
将所得的 DNA提取液稀释适当的倍数 ,用可见
分光光度计测定 260、 280 nm处的吸光度 。根据
A260 /A280(A260为 260nm处的吸光度 , A280为 280nm
处的吸光度)的值判断 DNA的纯度 ,以 A260的值计
算 DNA浓度并计算 DNA得率。每个样品测定 3
次 ,取其平均值 。
CDNA=50×A260 ×n;rDNA=m1 /m0。
式中:CDNA为 DNA浓度(μg· mL-1);A260为 260 nm
处的吸光值;n为稀释倍数;rDNA为 DNA得率
(μg·g-1);m1为 DNA的质量(μg);m0为取材量(g)。
1.4.2 电泳检测
基因组 DNA采用 1 ×TAE电泳缓冲液 , 在
1.0%的琼脂糖(含 EB的终浓度为 0.5 μg·mL-1)
凝胶中电泳 ,条件为 100V、1h。电泳结束 ,在 GIS—
2010凝胶成像系统下观察记录。
1.5 ISSR—PCR反应体系优化
1.5.1 ISSR—PCR单因素实验
以预先去杂 CTAB法提取的海南木莲总 DNA
为模板 ,用引物 UBC841(GA)8YC[ Y=(C, T)]在
PCR仪上进扩增 。扩增程序为:94 ℃预变性 3
min, 94℃变性 30s, 53℃退火 45 s, 72℃延伸 3 s,
36个循环 , 72 ℃延伸 420 s。
PCR扩增体系 (20μL)为:10 ×PCRBufer
2μL, TaqDNA聚合酶 1.5U,最后用 ddH2O将体系
补足为 20μL。以 dNTPs、Mg2+、引物 、Taq酶及模板
DNA浓度 5个因子作为扩增体系的单因素筛选设
计(见表 1)。
1.5.2 扩增结果检测
电泳检测如 1.4.2 , 然后用引物 UBC840
92
第 5期 魏小玲 , 等:海南木莲基因组 DNA提取及 ISSR反应体系的优化
表 1 ISSR—PCR体系单因素筛选设计
Table1 ThesinglefactoroptimaldesignofISSR-PCRreactionsystem
水平 因素模板 DNA(20 μL)/ng dNTPs/(mmol· L-1) 引物 /(μmol· L-1) Mg2+/(mmol· L-1) Taq酶(20μL)/U
1 10 0.10 0.20 1.0 1.00
2 20 0.15 0.30 1.5 1.25
3 40 0.20 0.40 2.0 1.50
4 60 0.25 0.50 2.5 1.75
5 80 0.30 0.60 3.0 2.00
6 100 0.35 0.70 3.5 2.25
(GA)8YT[ Y=(C, T)]在优化的 ISSR— PCR扩增体
系中对 16个海南木莲样品进行优化结果检测。
2 结果与分析
2.1 不同方法提取海南木莲基因组 DNA的纯度
和产量
本实验以海南省尖峰岭的海南木莲幼叶及成熟
叶为材料 ,通过紫外分光光度计检测(见表 2、3)及
电泳检测(见图 1)结果说明:预先去杂 CTAB法提
取的成熟叶和幼叶的 DNA均为透明胶状 , A260 /A280
均为 1.80 ～ 1.90, DNA的纯度很高 ,易溶于 TE缓冲
液;改良 CTAB法提取的成熟叶片 DNA纯度小于
1.8,说明有少量的蛋白质或酚类的污染 , 而应用
CTAB法提取的幼叶 DNA纯度高 ,为胶状;改良 SDS
法和高盐低 pH法提取的成熟叶片 DNA均带有不
表 2 不同提取方法提取的海南木莲成熟叶所得基因组 DNA的质量和得率
Table2 Theresultsofelectropheresisanalysisofmatureleavesbydifferentmethods
提取方法 DNA外观 A260 A280 A260 /A280 DNA得率 /(μg· g-1)
预先去杂 CTAB法 透明胶状 0.065 0.034 1.860 216.667
改良 CTAB法 白色固体 0.072 0.041 1.762 240.000
改良 SDS法 微黄色固体 0.063 0.022 1.553 209.979
高盐低pH法 微褐色固体 0.051 0.035 1.283 169.999
表 3 不同提取方法提取的海南木莲嫩叶所得基因组 DNA的质量和得率
Table3 Theresultsofelectropheresisanalysisoftenderleavesbydifferentmethods
提取方法 DNA外观 A260 A280 A260 /A280 DNA得率 /(μg· g-1)
预先去杂 CTAB法 透明胶状 0.071 0.039 1.841 236.667
改良 CTAB法 透明胶状 0.058 0.031 1.882 193.333
改良 SDS法 白色固体 0.063 0.034 1.852 210.000
高盐低pH法 微黄色固体 0.047 0.027 1.754 156.667
图 1 不同方法提取的海南木莲成熟叶和幼叶基因组
DNA电泳结果
Fig.1 Electropheresisanalysisofmatureleavesand
tenderleavesextractedbydifferetmethods
同程度的褐色 , DNA粘稠 ,纯度很低 ,可能污染了酚
类物质 、蛋白质或多糖 ,而 SDS法提取的幼叶的效
果较好 ,高盐低 pH法提取的 DNA颜色较深 ,较粘
稠。相比较而言 ,预先去杂 CTAB法提取海南木莲
基因组 DNA效果最佳。
2.2 模板 DNA浓度对 ISSR— PCR反应的影响
结果(如图 2)所示 ,在 20 μL反应体系内加入
10 ～ 100 ng模板 DNA时 ,均能扩增出多态性谱带 。
当模板 DNA为 10 ng时 , 400bp以下的条带扩增不
充分;模板 DNA为 20 ～ 60ng时 , ISSR— PCR扩增带
型较好 , DNA为 40ng时 ,条带更清晰 ,亮度更高;当
模板 DNA为 80 ～ 100 ng时 ,大于 1 200 bp和小于
93
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 第 30卷
400bp的条带扩增较弱。因此 20 μL体系中模板
DNA为 40ng时对 ISSR— PCR扩增较合适 。
图 2 模板浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.2 EffectoftemplateDNAconcentrations
onISSRresults
2.3 dNTPs浓度对 ISSR— PCR反应的影响
结果 (如图 3)所示 :当 dNTPs浓度为 0.1 5
mmol·L-1时 , PCR扩增的条带最为清晰 ,均匀明
亮;dNTPs浓度为 0.25 mmol·L-1时 , 1 900 bp的条
带扩增较弱;dNTPs浓度为 0.10 mmol· L-1时 ,
1 600 bp以上的条带未扩增出;dNTPs浓度为 0.30
mmol·L-1时 ,扩增条带很弱 ,大部分条带都未扩增
图 3 dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.3 EffectofdNTPsconcentrationsonISSR
results
出。综上分析 ,当 dNTPs浓度为 0.15mmol·L-1时
比较适宜 。
2.4 引物浓度对 ISSR—PCR反应的影响
引物是 PCR特异性反应的关键 。结果(如图 4)
所示:当引物浓度为 0.2 ～ 0.3 μmol·L-1时 ,扩增条
带十分微弱;当引物浓度为 0.4 ～ 0.6 μmol·L-1时 ,
扩增的条带清晰明亮 , 特别是当引物为 0.4
μmol·L-1时 ,扩增的条带十分清晰;当引物浓度为
0.7 μmol· L-1时 , 300 ～ 1 200bp的条带扩增模糊 ,
部分主带未扩增出来。因此较为适宜的引物浓度为
0.4 μmol·L-1。
图 4 引物浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.4 EffectofprimerconcentrationsonISSRresults
2.5 Mg2+浓度对 ISSR—PCR反应的影响
结果如图 5所示:当 Mg2+浓度为 1.0mmol·L-1
时 , 扩增条带微弱 , 仅有几条主带能清晰辨认 ;
当 Mg2+浓度为 1.5 ～ 3.0 mmol·L-1时 ,扩增条带
明亮清晰 ,但 Mg2+浓度为 1.5 ～ 2.0 mmol·L-1时 ,
200 bp以下的条带未扩增出来;当 Mg2 +浓度为 3.5
mmol· L-1时 ,扩增的条带有明显的拖带现象 。因
此 Mg2+浓度为 3.0 mmol·L-1时 ,扩增效果好 。
2.6 TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR—PCR反应的影响
结果如图 6所示:当 20 μL中 TaqDNA聚合酶
为 1.0 ～ 1.25 U时 ,扩增条带微弱 , 650bp的条带没
有扩增出来 ;当 TaqDNA聚合酶为 1.5 ～ 2.2 5U
时 ,扩增条带清晰 , 特异性条带多 。综合考虑 , 当
TaqDNA聚合酶为 1.5U时不但节约成本 ,而且扩
94
第 5期 魏小玲 , 等:海南木莲基因组 DNA提取及 ISSR反应体系的优化
图 5 Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.5 EffectofMg2+concentrationsonISSRresults
增效果也适宜。
2.7 ISSR反应体系的应用
采用引物 UBC840对海南木莲 16个样品进行
ISSR扩增 , 结果如图 7所示 。实验优化后的 ISSR—
图 6 TaqDNA聚合酶对 ISSR扩增的影响
Fig.6 TheinfluenceofTaqDNApolymerase
concentrationonISSRresults
PCR反应体系稳定性强 ,扩增的特异性产物丰富 ,
可以用于海南木莲遗传多样性的后续实验分析。
图 7 UBC840对海南木莲样品的 ISSR扩增电泳结果
Fig.7 AmplifiedresultsofprimerUBC840
3 讨 论
与常规 DNA提取方法相比 ,预先去杂 CTAB法
采用先破碎细胞 ,去除大量存在于细胞质中影响
DNA提取质量的酚类 、糖类及色素等次生代谢物
质 ,然后再用 CTAB裂解液裂解细胞核 ,在 65℃下
破核释放 DNA,经分离纯化后得到总 DNA,从而避
免了酚类物质的褐化。应用 4种方法对海南木莲叶
片 DNA进行提取 ,从 DNA的外观 、纯度 、得率等多
种因素说明 ,预先去杂 CTAB法无论是提取成熟叶
片还是幼叶 DNA的效果都是最佳的 ,其次是改良
CTAB法 、改良 SDS法 ,而高盐低 pH法效果不佳 。
幼叶提取效果要好于成熟叶片 ,因为就叶片发育而
95
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 第 30卷
言 ,成熟叶中细胞壁木质化严重 ,多酚 、色素和多糖
等次生代谢物质积累更多 ,给 DNA的提取带来困
难 [ 16] 。所以提取海南木莲 DNA应优先考虑以幼叶
为材料 ,为减轻多酚类等杂质污染 ,在提取液中可加
入 10 ～ 30 g/L酚结合剂可溶性 PVP,及 2%～ 6%的
β —巯基乙醇。
根据实验结果 ,引物和 Mg2+浓度对反应的影响
较大 ,这与梁文汇等 [ 17]在正交实验设计优化大叶栎
ISSR体系时得到的 TaqDNA聚合酶是主要影响因
素的结论不同 ,可能与所选的实验材料不同有关 。
引物是 PCR特异性反应的关键 ,当引物浓度过低时
不能扩增 ,浓度过大会引起模板与引物的错配 ,使
PCR反应的特异性降低 ,形成引物二聚体的几率增
大 ,导致条带不清晰或产生新的特异性位点 [ 18] 。
Mg2 +浓度是 ISSR—PCR反应的一个重要影响因素 ,
它是 Taq聚合酶的激活剂 ,不仅影响 Taq酶活性 ,还
能与体系中的 dNTPs、模板 DNA及引物相结合 ,影
响引物与模板的结合率 、模板与 PCR产物的解链温
度 ,同时也影响了产物的特异性和引物二聚体的形
成 [ 19] 。dNTPs、Mg2 +以及 TaqDNA聚合酶之间是紧
密相关的。 dNTPs浓度过低将影响扩增效率 ,浓度
过高将与 TaqDNA聚合酶竞争 Mg2 +,影响游离的
Mg2 +浓度 ,降低酶的活性。相对而言 ,模板 DNA的
用量对 ISSR反应影响不大 ,通常在 20μL的 ISSR—
PCR反应体系中 , 5 ～ 200ng范围的 DNA量都能提
供好的扩增结果 ,但在 DNA纯度不高的情况下 ,应
该使用有效范围内的最低浓度 ,使 DNA内的杂质对
TaqDNA聚合酶的抑制力降到最低。
参考文献:
[ 1] McgregorCE, LambertCA, GreylingMM, etal.Acompara-
tiveassessmentofDNAfingerprintingtechniquesintetraploidpo-
tatogermplasm[ J] .Euphytica, 2000, 113:135-144.
[ 2] 黎 裕 ,贾继增 ,王天宇.分子标记的种类及其发展 [ J].生物
技术通报, 1999, 15(4):19-22.
[ 3] 曾艳玲 ,谢 鹏 ,谢耀坚 ,等.桉树 ISSR-PCR反应体系的建立
与优化 [ J] .中南林业科技大学学报 , 2008, 28(1):44-49.
[ 4] 周光益 ,曾庆波 ,林明献 ,等.海南木莲人工林生物量及养分分
配 [ J] .林业科学研究 , 1997, 10(5):453-457.
[ 5] 毕和平 ,韩长日 ,严凤华 ,等.海南木莲生药的 TLC鉴定 [ J] .海
南师范学院学报 , 2004, 17(3):262-264.
[ 6] 毕和平 ,韩长日 ,梁振益 ,等.海南木莲叶挥发油化学成分研究
[ J] .中国野生植物资源 , 2006, 25(6):58-60.
[ 7] 周延清.DNA分子标记技术在植物中的应用 [ M] .北京:化学
工业出版社 , 2005:3-14.
[ 8] 万玉华 ,余璐璐 ,李晓玲 ,等.巴东木莲 DNA的提取及 SRAP-
PCR反应体系的正交优化 [ J].湖北农业科学 , 2008, 47(9):
981-982.
[ 9] SaghaiMA, AlardRW, ZhangQ.Geneticdiversityandecogeo-
graphicaldiferentiationamongribosomalDNAalelesinwildand
cultivatedbarely[ J] .Proc.Natl.Acad.Sci., 1990, 81:8014-
8018.
[ 10] 赵昶灵 ,郭维明 ,陈俊愉.梅花基因组 DNA提取的方法学研
究 [ J] .北京林业大学学报 , 2004, 26(增刊):32-33.
[ 11] 丁晓东 ,吕柳新.从顽拗植物荔枝中提取基因组 DNA技术的
研究 [ J].应用与环境生物学报 , 2000, 6(2):142-145.
[ 12] 陈大明 ,张上隆 ,金勇丰.一种木本果树基因组 DNA提取方
法研究 [ J].浙江农业大学学报 , 1997, 23(6):621-624.
[ 13] 项 艳 ,朱苏文 ,程备久.板栗基因组 DNA几种提取方法比
较研究 [ J].安徽农业大学学报 , 2001, 28(1):36-39.
[ 14] DelaportaSL, WoodJ, HicksJB.AplantDNAminiprepara-
tion:versionⅡ [J] .PlantMol.Biol.Rep., 1983, 1:19-21.
[ 15] 闫桂琴 ,任 鹰 ,张变红 ,等.三种木本植物基因组 DNA的提
取及纯度检测 [ J].山西师范大学学报 , 2004, 18(1):72-77.
[ 16] FangG, HammarS, GrumetR.Aquickandinexpensivemethod
forremovingpolysaccharidesfromplantgenomicDNA[ J] .Bio-
feedback, 1992, 13(1):52-54.
[ 17] 梁文汇 ,谭健晖 , 黄寿先 ,等.大叶栎 ISSR扩增体系的优化
[ J] .安徽农业科学 , 2009, 37(22):10424-10425.
[ 18] 张维铭.现代分子生物学实验手册 [ M] .北京:科学出版社 ,
2004:251-252.
[ 19] 金 琳 ,葛 刚 ,陈少风 ,等.五节芒 ISSR—PCR反应体系的
优化 [ J].安徽农业科学 , 2009, 37(29):14041-14043.
[本文编校:谢荣秀 ]
96