全 文 ：中国农学通报 2012,28(16):53-59
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
壳菜果(Mytilaria laosensis Lecomte)，别名米老排、
三角枫、山桐油、米显灵、马蹄荷、朔潘[1]，属金缕梅科
(Hamamelidaceae)壳菜果属(Mytilaria)常绿阔叶树种，
是优良速生用材树种。在水土保持、土壤改良、生物防
火等[2-3]方面作用明显，具有很好的生态价值和经济价
值。壳菜果天然林分布于广东的封开、信阳、阳春，广
西西南部的十万大山、龙川、那坡、德保、靖西和云南南
部，老挝和越南也有分布，垂直分布在广东海拔 250~
1000 m，广西和云南在海拔1100~1800 m之间的山谷、
丘陵的中下部和沟谷两旁[4]，是一种对气候比较反应
敏感的植物。
简单重复序列区间扩增多态性 (inter simple
sequence repeat, ISSR)是在SSR上发展起来的，以PCR
反应为基础的一种新型分子标记技术，具有操作简单、
成本低、快速、灵敏、所需DNA模板少等优点，其产物
的多态性比随机扩增多态DNA(RAPD)丰富，而且比
RAPD技术更为稳定可靠，重复性更好[5]。目前 ISSR
技术在种质资源鉴定、遗传多样性检测、遗传图谱构
建、基因定位等方面得到广泛应用 [6]。目前有关
基金项目：国家林业公益行业科研专项子项目“中国森林对气候变化的影响与林业适应对策研究”(200804001)。
第一作者简介：彭继庆，男，1986年出生，山东菏泽人，在读硕士研究生，研究方向为基因工程。通信地址：410004湖南长沙市天心区韶山南路498号
中南林业科技大学生命科学与技术学院生科楼A座407室，E-mail：pengjiqing17@126.com。
通讯作者：曹福祥，男，1962年出生，湖南新化人，教授，博士生导师，主要从事生物化学与分子生物学研究。通信地址：410004湖南长沙市天心区韶
山南路498号中南林业科技大学生命科学与技术学院生科楼A座407室，Tel：0731-85623835，E-mail：csfucao@163.com。
收稿日期：2011-11-30，修回日期：2012-02-20。
壳菜果 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
彭继庆，曹福祥，许若娴
（中南林业科技大学，长沙 410004）
摘 要：为建立一个稳定、可重复的壳菜果 ISSR-PCR反应体系，以壳菜果的总DNA为试验材料，通过单
因素试验、正交试验和方差分析对模板DNA浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶
浓度5个因素进行研究，确定了壳菜果 ISSR-PCR反应的最优体系为：在20 μL的反应体系中模板DNA
为 30 ng，dNTPs浓度为 0.20 mmol/L，Mg2+浓度为 2.75 mmol/L，引物浓度为 0.6 μmol/L，TaqDNA聚合酶
为2.2 U。方差分析表明：5个因素中只有Mg2+浓度对反应体系影响最大，达到了显著性水平。
关键词：分子生物学；壳菜果；ISSR；单因素设计；正交设计；方差分析
中图分类号：S794.4 文献标志码：A 论文编号：2011-3531
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Mytilaria laosensis
Peng Jiqing, Cao Fuxiang, Xu Ruoxian
(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004)
Abstract: To establish a stable, repeatable ISSR-PCR reaction system of Mytilaria laosensis, those five
factors, the concentration of DNA template, dNTPs, Mg2 + , primers and Taq DNA polymerase, were studied
through the single factor tests, orthogonal tests and variance analysis with the total DNA of Mytilaria laosensis
as experimental material. The optimal system of ISSR-PCR reaction was established as follows: 30 ng template
DNA, 0.20 mmol/L dNTPs, 2.75 mmol/L Mg2 + , 0.6 μmol/L primers, 2.20 U Taq DNA polymerase were
contained in 20 μL reaction system. Variance analysis showed that: only the Mg2+ concentration of five factors
has the greatest impact on the reaction system and reached a significant level.
Key words: molecular biology; Mytilaria laosensis; ISSR; single factor design; orthogonal design; variance
analysis
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
ISSR-PCR反应体系的研究已有很多，但不同植物的反
应体系不仅受到植物材料的影响，还受到 dNTPs浓
度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度等因素
影响[7]，尽管各个因素对反应体系的影响程度不一，但
为了得到稳定可靠、重复性好的DNA图谱，对壳菜果
反应体系进行研究是非常必要的。另外，气候变暖是
人们讨论越来越多的话题，壳菜果为热带、南亚热带树
种，近些年来在湖南等地广泛引种，已经取得了成功，
从分子水平上研究原产地与栽培地壳菜果基因组之间
的差异，为植物在环境响应方面寻找证据。因此笔者
以壳菜果为材料，对影响 ISSR-PCR反应体系的各个
因素进行优化，为进一步研究壳菜果种群的遗传多样
性及壳菜果对环境变化的响应等提供基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
壳菜果样品采自广西省凭祥市凭祥镇竹山村，选
取比较完整的、没有感染病虫害的新鲜叶片，用湿纱布
擦洗干净，放入自封袋中，加入适量硅胶，冰盒保存带
回实验室，-70℃保存。
1.2 基因组DNA的提取与检测
壳菜果基因组总DNA的提取采用天根生化科技
（北京）有限公司提供的植物基因组提取试剂盒进行，
操作过程按说明书进行，只是把裂解时间由10 min延
长为 20 min；离心时间由 30 s延长至 1 min，其余保持
不变。
将提取的壳菜果总基因组DNA用1.0%琼脂糖凝
胶凝胶电泳进行检测，在1%的琼脂糖凝胶中加入EB，
终浓度为 0.5 μg/mL；将提取的壳菜果总基因组DNA
用TE缓冲液稀释 10倍后，用核酸蛋白测定仪检测样
品DNA的纯度和浓度。把提取的壳菜果总基因组
DNA稀释适当倍数后，保存于-20℃冰箱中备用。
1.3 引物退火温度研究
以壳菜果基因组DNA为模板，对引物UBC835
进行退火温度研究，经查资料比较后，ISSR-PCR扩增
反应体系确定为(20 μL)：10×PCR Buffer 2.0 μL，Taq
DNA聚合酶 1.5 μL，dNTPs 2.2 μL，DNA 0.6 μL，Mg2 +
1.6 μL，ISSR引物0.6 μL，最后用ddH2O将体系补足到
20 μL。扩增反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性
30 s，在设定的退火温度下退火45 s，72℃延伸90 s，共
36个循环，72℃总延伸 420 s，PCR扩增产物在 4℃保
存。根据引物UBC835的Tm值，将其退火温度设定为
50、51、52、53、54℃等 5个温度梯度，以确定引物
UBC835的最优退火温度。
1.4 ISSR-PCR反应体系优化
1.4.1 ISSR-PCR体系单因素筛选设计 在 20 μL PCR
扩增体系中，采用梯度试验的方法分别对体系中的
TaqDNA聚合酶、dNTPs浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓
度、引物浓度 5个因素进行优化（如表 1），将优化的结
果用于正交试验设计。扩增程序中退火温度采用引物
UBC835的最佳退火温度，其余不变。
1.4.2 ISSR-PCR正交试验设计 根据单因素实验的结
果，对影响 ISSR-PCR反应的 5个因素，即 dNTPs、
Mg2+、ISSR引物、Taq DNA聚合酶及模板DNA浓度，
采用L16(45)的正交设计表（见表2），在4个水平上进行
正交试验优化，每个处理做3个重复，统计电泳图中扩
增出的条带的数目，采用极差、方差（SPSS软件）和多
重比较方法分析[8]各个因素的正交试验结果，得到合
适壳菜果 ISSR-PCR反应的最佳体系。
1.5 优化反应体系的验证
以新宁的 12份壳菜果总基因组DNA为模板，以
UBC835为引物，利用以优化好的 ISSR-PCR反应体
系，在最优的退火温度条件下，进行 ISSR-PCR扩增，
以检验壳菜果 ISSR-PCR反应体系的稳定性。
2 结果与分析
2.1 壳菜果基因组的纯度和浓度
用天根公司提供的植物基因组提取试剂盒法提取
的壳菜果总基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测发
现（如图1）：壳菜果总基因组DNA的电泳条带清晰明
亮，无拖带现象，点样孔内比较干净，没有蛋白质污染，
前端也没有RNA条带，表明该方法去除RNA比较彻
因素
模板DNA/(ng/20 μL)
dNTPs/(mmol/L)
引物/(μmol/L)
Mg2+/(mmol/L)
TaqDNA聚合酶/(U/20 μL)
水平
1
10
0.10
0.30
1.25
1.30
2
20
0.15
0.40
1.75
1.60
3
30
0.20
0.50
2.25
1.90
4
40
0.25
0.60
2.75
2.20
5
50
0.30
0.70
3.25
2.50
表1 ISSR-PCR体系单因素筛选设计
·· 54
彭继庆等：壳菜果 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
底；通过核酸蛋白测定仪检测显示壳菜果总基因组
DNA的OD260/OD280值在 1.7~1.9之间，总DNA浓度在
30~60 ng/μL之间，也表明该方法提取的DNA纯度比
较高，条带的完整性较好，DNA浓度比较高，可用于进
行下一步的试验。
2.2 引物UBC835退火温度的确定
退火温度对条带扩增的多少起重要的作用，退火
温度过高，引物与模板DNA之间配对比较困难，扩增
条带就会减少或者是扩增不出条带；退火温度过低，会
增加引物与模板DNA之间的错配率，扩增条带就会增
加。由电泳图可以看出：引物UBC835在所设定的 5
个温度范围内均可以扩增出清晰的条带，但在退火温
度为50℃时，扩增的条带最多，条带也比较清晰明亮，
在退火温度大于50℃时，扩增的条带反而减少，因此可
以确定引物 UBC835 的最佳退火温度为 50℃
（见图2）。
2.3 ISSR反应体系的优化
2.3.1 模板DNA浓度对 ISSR-PCR反应的影响 模板
DNA的浓度对 PCR结果有很大影响。结果所示，在
20 μL反应体系内加入 20~50 ng模板DNA时，均能扩
增出多态性条带。当模板DNA小于 30 ng时，扩增条
带较模糊，扩增出的多态性条带较少，可能是由于模板
DNA浓度比较低，引物与之结合的机会就比较少，因
此扩增的条带就会减少；模板DNA为 30~40 ng时，扩
增条带清晰，扩增带型基本一致；当模板为50 ng时，扩
表2 ISSR-PCR正交试验设计L16(45)
水平
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
因素
模板DNA/(20 μL/ng)
1(20)
1(20)
1(20)
1(20)
2(30)
2(30)
2(30)
2(30)
3(40)
3(40)
3(40)
3(40)
4(50)
4(50)
4(50)
4(50)
dNTPs/(mmol/L)
1(0.16)
2(0.20)
3(0.24)
4(0.28)
1(0.16)
2(0.20)
3(0.24)
4(0.28)
1(0.16)
2(0.20)
3(0.24)
4(0.28)
1(0.16)
2(0.20)
3(0.24)
4(0.28)
Mg2+/(mmol/L)
1(1.75)
2(2.25)
3(2.75)
4(3.25)
2(2.25)
1(1.75)
4(3.25)
3(2.75)
3(2.75)
4(3.25)
1(1.75)
2(2.25)
4(3.25)
3(2.75)
2(2.25)
1(1.75)
引物/(μmol/L)
1(0.4)
2(0.5)
3(0.6)
4(0.7)
3(0.6)
4(0.7)
1(0.4)
2(0.5)
4(0.7)
3(0.6)
2(0.5)
1(0.4)
2(0.5)
1(0.4)
4(0.7)
3(0.6)
Taq酶/(U/20 μL)
1(1.30)
2(1.60)
3(1.90)
4(2.20)
4(2.20)
3(1.90)
2(1.60)
1(1.30)
2(1.60)
1(1.30)
4(2.20)
3(1.90)
3(2.20)
4(2.20)
1(1.30)
2(1.90)
1 2 3 4 5
图1 5个样品的基因组电泳图
1 2 3 4 5 M bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
M: 200 bp DNA Ladder；1~5退火温度分别为50、51、52、53、54℃
图2 引物835的退火温度对 ISSR扩增的影响
·· 55
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
增条带减弱并有拖带现象。因此 20 μL体系中模板
DNA 为 30~40 ng 对 ISSR-PCR 扩增是较合适的
（见图3）。
2.3.2 Mg2 +浓度对 ISSR-PCR反应的影响 Mg2 +是 Taq
DNA聚合酶活性所必需的，对PCR扩增的效率、特异
性、退火温度都有影响 [9]。而且Mg2 +可以和 dNTP、
DNA和引物形成复合物，从而降低Mg2+的有效浓度，
影响 PCR扩增的结果。结果所示，当Mg2 +浓度为
1.25 mmol/L时，仅扩增出了 2条比较清晰的条带，扩
增效率非常低，随着Mg2+浓度的增加，扩增出条带数
增多，当Mg2+浓度在1.75~2.75 mmol/L时，扩增条带最
多，条带也最清晰；当Mg2+浓度大于 2.75 mmol/L时，
扩增的条带减少且扩增条带比较模糊，有些特异性条
带扩增不出。因此Mg2+浓度为1.75~2.75 mmol/L时扩
增效果好（图4）。
2.3.3 dNTPs浓度对 ISSR-PCR反应的影响 dNTPs是
TaqDNA聚合酶的底物，它的浓度也会直接影响到
PCR反应的结果，如果dNTPs浓度过低会降低PCR产
物的产量，过高会造成浪费，且会降低Mg2+的有效浓
度[8-9]。结果如所示：当dNTPs浓度为小于0.15 mmol/L
时，dNTPs浓度比较低，扩增的条带比较少，只扩增出
了部分条带且条带比较暗；当 dNTPs浓度为 0.20~
0.30 mmol/L时，扩增效果比较好，均能扩增出稳定明
亮的条带，因此，在 20 μL体系中，dNTPs浓度为 0.20~
0.30 mmol/L时比较适宜（图5）。
2.3.4 ISSR引物浓度对 ISSR-PCR反应的影响 引物是
PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于模
板DNA与引物的互补程度。但引物与模板DNA的结
合又受到其他因素的影响，如Mg2+浓度。结果所示，
当引物浓度为 0.3 mol/L时，扩增条带较少，只扩增出
部分条带；当引物浓度增加时，扩增条带增多，当引物
浓度为 0.6~0.7 μmol/L时，扩增的条带最多并且清晰
明亮。因此较为适宜的引物浓度为 0.6~0.7 μmol/L
（如图6）。
2.3.5 Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR反应的影响
在酶促反应中，酶量的多少起了非常重要的作用，太少
会影响底物的结合，减少产物，酶量太多又会造成酶的
浪费。ISSR-PCR反应也是一个酶促反应，对TaqDNA
M:200 bp DNA Ladder；1~5:模板DNA浓度分别为
10、20、30、40、50 ng/20μL
图3 模板浓度对 ISSR扩增的影响
M: 200 bp DNA Ladder；1~5: Mg2+浓度分别为
1.25、1.75、2.25、2.75、3.25 mmol/L
图4 Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
M: 200 bp DNA Ladder；1~5:dNTPs浓度分别为
0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L
图5 dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
M: 200 bp DNA Ladder；1~5:引物浓度分别为
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L
图6 引物浓度对 ISSR扩增的影响
1 2 3 4 5 M bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
M 1 2 3 4 5bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
1 2 3 4 5 M bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
1 2 3 4 5 M bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
·· 56
彭继庆等：壳菜果 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
聚合酶的优化就显得尤为重要。结果如显示：
TaqDNA聚合酶少于1.3 U时，扩增条带明显减少且不
清晰；当TaqDNA聚合酶浓度为 1.9~2.5 U时，条带清
晰明亮，因此Taq DNA聚合酶浓度为1.9~2.5 U较适宜
（图7）。
2.3.6 ISSR-PCR正交试验直观分析 壳菜果 ISSR-PCR
正交设计的各个组合均能较好地扩增出特异性条带，
由于不同组合间各个组分的浓度不同，扩增条带的多
少也存在着明显的差异，条带的明暗程度也不尽相
同。由图8可以看出，处理组合4、8、14的扩增条带数
较多，并且条带背景清晰明亮。相比较而言，处理组合
14的主带明显，背景清晰，扩增效果更佳。表明处理组
合 14（模板DNA为 50 ng，dNTPs浓度为 0.2 mmol/L，
Mg2 +浓度为 2.75 mmol/L，引物浓度为 0.4 μmol/L，
TaqDNA聚合酶为2.2 U）在正交试验设计的16个组合
中扩增效果最好。
2.3.7 ISSR-PCR正交试验数据分析 由于根据电泳条
带的多少、明暗程度及清晰度不同给不同的组合进行
评分，最好的赋值为 16，最差的赋值为 0，其余的在 0~
16之间，这样的赋值方式具有很大的主观随意性，因
此笔者在进行数据分析时并未采取这种方式，而是根
据电泳图中条带数目每个处理分别赋值，可辨别的条
1 2 3 4 5 M bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
M: 200 bp DNA Ladder；1~5: Taq DNA聚合酶浓度分别为
1.3、1.6、1.9、2.2、2.5 U/20 μL
图7 Taq DNA聚合酶对 ISSR扩增的影响
bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M: 200 bp DNA Ladder；1~16:正交试验设计表2中的16组组合
图8 均匀设计试验结果
带记为 1，根据每个处理可辨别的条带数目给每个处
理赋值，然后对正交试验结果进行极差分析，结果见表
3。在极差分析中，Ki(i=1、2、3、4)代表同一因素在同一
水平下不同组合之间的总和，R表示同一因素不同水
平间的极差值。极差值得大小反映了每个因素对
ISSR-PCR反应的影响程度，R值越大，说明该因素对
试验结果影响越大。从极差R值（表3）可以看出，Mg2+
对壳菜果 ISSR-PCR反应的影响最大，极差值为4.5；其
次是 dNTPs和 TaqDNA聚合酶，极差值为 1.5；模板
DNA浓度对壳菜果 ISSR-PCR反应的影响最小，极差
值仅为 0.25。根据极差值的不同也可以得到
ISSR-PCR反应体系的最优组合为 A2B2C3D4E4或
A4B4C3D4E4或A2B4C3D4E4或A4B2C3D4E4。
极差分析只能直观形象地判断各因素对壳菜果
ISSR-PCR反应的影响，并不能判断其显著性。通过对
各个因素进行方差分析表明：只有镁离子浓度达到了
显著水平，其余各因素都没有达到显著水平（见表4）。
多重比较分析表明（见表 3），Mg2+浓度在 2.75 mmol/L
时，扩增条带最多，为 39条，大于或小于 2.75 mmol/L
时，扩增条带均减少，结合条带的亮度和背景清晰度等
方面，确定Mg2+的最适浓度为2.75 mmol/L。由于其余
4个因素对 ISSR-PCR反应体系的影响都没有达到显
著性水平，因此根据各因素对反应体系贡献的大小和
结合经济节约的原则确定壳菜果 ISSR-PCR反应的最
优体系为：在 20 μL反应体系中，模板DNA为 30 ng、
dNTPs浓度为 0.20 mmol/L、Mg2+浓度为 2.75 mmol/L、
引物浓度为 0.6 μmol/20 μL、TaqDNA聚合酶浓度为
2.2 U/20 μL。这与电泳图中的处理组合 14中的Mg2+
浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度完全一致，只
有引物浓度和模板DNA浓度不一样，而这2个因素对
壳菜果 ISSR-PCR反应体系影响不大，因此本体系可
以用于下一步试验。
·· 57
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
K1
K2
K3
K4
k1
k2
k3
k4
R
模板DNA
/(ng/20 μL)
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
29
30
29
30
7.25
7.50
7.25
7.50
0.25
dNTPs
/(mmol/L)
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
28
32
26
32
7.00
8.00
6.50
8.00
1.50
Mg2+
/(mmol/L)
1
2
3
4
2
1
4
3
3
4
1
2
4
3
2
1
21
26
39
32
5.25
6.50
9.75
8.00
4.50
TaqDNA聚合酶
/(U/20 μL)
1
2
3
4
3
4
1
2
4
3
2
1
2
1
4
3
28
29
29
32
7.00
7.25
7.25
8.00
1.00
引物
/(μL/L)
1
2
3
4
4
3
2
1
2
1
4
3
3
4
1
2
28
30
27
33
7.00
7.50
6.75
8.25
1.50
扩增片段/条
4
7
8
10
7
6
7
10
10
8
5
6
7
11
6
6
表3 正交试验数据分析
因素
模板DNA
dNTPs
Mg2+
引物
TaqDNA聚合酶
误差
偏差平方和
0.250
6.750
45.250
2.250
5.250
59.75
自由度
3
3
3
3
3
15
F
0.021
0.565
3.787*
0.188
0.439
—
F0.05(3,15)
3.290
—
—
—
—
—
2.4 ISSR-PCR反应体系稳定性检验
通过单因素试验、正交试验和方差分析得到了壳
菜果 ISSR-PCR反应的最优体系，利用引物UBC835对
新宁的12份样品进行扩增，以检验该反应体系的稳定
性。结果（如图 9）表明，新宁地区的 12份样品均能扩
增出清晰明亮、多态性高、重复性好的条带，从而证明
正交试验优化的壳菜果 ISSR-PCR反应的体系是稳定
可靠的，可用于后续试验。
3 结论与讨论
通过单因素试验对影响 ISSR-PCR反应体系的 5
表4 正交试验方差分析
注：*表示在0.05水平差异显著。
·· 58
彭继庆等：壳菜果 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
个因素即模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和
引物浓度进行研究，确定了适合反应体系的 5个因素
的浓度范围。然后通过正交试验、方差分析和多重比
较分析确定适合壳菜果 ISSR-PCR反应的最优体系，即
在 20 μL反应体系中，模板DNA浓度为 30 ng/20 μL、
dNTPs浓度为 0.20 mmol/L、Mg2+浓度为 2.75 mmol/L、
引物浓度为 0.6 μmol/20 μL、TaqDNA聚合酶浓度为
2.2 U/20 μL。通过显著性分析，表明Mg2+浓度对反应
体系影响最大，达到了显著性水平，因为Mg2+不仅对
TaqDNA聚合酶有很大影响，而且对PCR扩增的效率、
特异性、退火温度都有影响；并且Mg2+可以和 dNTPs、
DNA和引物形成复合物[9-10]，因此Mg2+浓度对反应体
系的影响最大，这与安静等 [11]用正交试验优化杉木
ISSR-PCR反应体系中通过赋值法处理实验结果得到
的结论一致。其余 4个因素并未达到显著性水平，但
dNTPs 和 TaqDNA 聚合酶对反应体系影响较大，
dNTPs浓度过低，即使引物和模板DNA能够很好的结
合，也并不能很好的延伸从而影响扩增效率；dNTPs浓
度过高，则会影响Mg2 +浓度 [12]，从而影响反应体系。
TaqDNA聚合酶浓度过高容易产生非特异性扩增产
物,过低则会影响产物的合成效率[13]。模板DNA浓度
影响最小，这与杜欣等[14]均匀设计优化 ISSR-PCR体系
得到的结果一致。5个因素对不同植物的反应体系的
影响也不尽相同，如梁文汇等[15]就得到TaqDNA聚合
酶是主要影响因素，因此为了得到稳定、清晰明亮的条
带，对每一种植物的反应体系进行优化是非常必要的。
本试验在数据处理过程中，根据扩增的条带数目
对不同的组合方式进行赋值，避免了赋值时人为的主
观性，但这种赋值方式无法区分条带的明暗程度，对反
应体系的评价存在一定的不足，希望今后能找到一种
新的数据处理方法。
参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出
版社,1979:50-52.
[2] 梁善庆,罗建举.人工林壳菜果木材化学成分及其在树干高度上的
变异[J].中南林学院学报,2004,24(5):28-31.
[3] 梁善庆,罗建举.人工林壳菜果木材的物理力学性质[J].中南林业
科技大学学报,2007,27(5):97-100,116.
[4] 郑万钧.中国树木志(第二册)[M].北京:中国林业出版社,1985.
[5] Gilbert J E, Lewis R V, Wilkinsonm J, et al. Developing an
appropriate strategy to assess genetic variability in plant germ
plasm collections[J]. Theor Appl Genet, 1999,98:1125-1131.
[6] 魏小玲,曹福祥,陈建.海南木莲基因组DNA提取及 ISSR反应体系
的优化[J].中南林业科技大学学报,2010,30(5):91-96.
[7] 李房英,黄彦晶,吴少华,等.三角梅 ISSR反应体系的建立和优化
[J].生物技术通报,2010,7:142-145.
[8] 周凌瑜,吴晨炜,唐东芹.利用正交设计优化小苍兰 ISSR-PCR反应
体系[J].植物研究,2008,28(4):402-407.
[9] 王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社,
1998,421.
[10] 孙朝霞,王海燕,王玉国,等.枣树RAPD分析体系优化研究[J].华北
农学报,2008,23(4):115-118.
[11] 安静,徐刚标,申响保,等.杉木 ISSR-PCR反应体系的正交优化[J].
中南林业科技大学学报,2011,30(5):91-96.
[12] 范海艳,曹福祥,彭继庆,等.博白大果油茶 ISSR-PCR反应体系的
建立与优化[J].中南林业科技大学学报,2011,31(4):97-103.
[13] 李嵘,王喆之.丹麦 ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化[J].广西
植物,2008,28(5):599-603.
[14] 杜欣,董玉芝,陈虹,等.均匀设计优化喜盐鸢尾 ISSR-PCR体系[J].
新疆农业科学,2008,45(3):386-392.
[15] 梁文汇,谭健晖,黄寿先,等.大叶栎 ISSR扩增体系的优化[J].安徽
农业科学,2009,37(22):10424-10425.
bp
3000
2000
1600
1200
1000
800
600
400
200
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
图9 UBC835对壳菜果的 ISSR扩增电泳结果
·· 59