全 文 ：引进葡萄柚品种基因资源的 AFLP分析
刘惠民 ,何承忠 ,孟　瑜 ,周　敏 ,王　瑶
(西南林学院资源学院 ,云南昆明 650224)
摘　要: 采用 AFLP分子标记技术 ,对引进的 9个葡萄柚品种基因资源进行分析 ,评价引进资源的遗传多样
性 ,揭示遗传结构和品种间亲缘关系 ,为引进葡萄柚品种的进一步开发利用和遗传改良提供基础信息。 结果
表明 ,筛选出的 7对引物共扩增出 263条带 ,多态带比率为 7. 22%。多态性标记百分率、观测等位基因数、有效
等位基因数、N ei’ s基因多样性指数和 Sh ann on信息指数在物种水平分别为 7. 22% 、 0. 023 4、 0. 008 0、 0. 659
2和 0. 258 5,而在品种水平它们分别为 2. 41%、 1. 024 1、 1. 013 2、 0. 008 0和 0. 012 2。基因分化系数 Gst为 0.
659,表明葡萄柚的遗传差异主要来自于品种之间。 9个品种间的遗传距离变幅在 0. 000 5～ 0. 037 1之间 ,平
均为 0. 025 8。基于 UPGM A的聚类结果将 9个品种分为 2组 ,火焰、矮化、亨路比、哈路比、帕利斯和瑞路比聚
为一组 ,里德马叙、里约红和星路比构成另一组。
关键词: 分子生物学 ;葡萄柚 ;基因资源 ;遗传多样性 ; AFLP
中图分类号: S666. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1003- 8981( 2008) 02- 0001- 05
AFLP Analysis of Gene Resources in Introduced
Grapefruit Cultivars
LIU Hui-min, HE Cheng-zhong, MENG Yu, ZHOU Min, WANG Yao
( Schoo l o f Natural Resources, Southw est Fo rest ry Univ er sity , Kunming 650224, Yunnan, China)
Abstract: In o rder to prov ide basic da ta fo r further development and improvement o f g rapef ruit,
gene r esources of nine cultiv ar s in Citrus paradise Macf. int roduced fr om American w ere
evaluated and analy zed, by amplified fr agm ent leng th po lymorphism ( AFLP ) . The r esults
show ed tha t 263 bands w ere amplified by 7 primer combinations, and the r atio o f po lymo rphic
bands was 7. 22% . The percentag e o f polymorphic marke rs, the number of alleles, the effectiv e
num ber o f a lleles, th e Nei s gene div er sity index , and the Shannon s info rmation index w ere
7. 22% , 0. 023 4, 0. 008 0, 0. 659 2 and 0. 258 5 at the species lev el, respectiv ely , and w ere
2. 41% , 1. 024 1, 1. 013 2, 0. 008 0 and 0. 012 2 at the cultiv ar lev el, respectiv ely. The gene
differentia tion coefficient ( GST ) w as 0. 659. It showed tha t most g enetic div ersities existed
among cultiv ar s. The gene tic distances betw een the cultiv ar s ranged fr om 0. 000 5 to 0. 037 1,
and mean gene tic distance w as 0. 025 8. Nine g rapefruit cultiv ar s could be div ided into two
majo r g r oups obviously ba sed on the results of UPGM A cluster analysis. The g roup I consisted
of Flame, Gene tic Dwa rf, Henderson Ruby , Hudson Foster , Perlis and Ray Ruby. Th e g r oup
I I included Reed Marsh, Rio Red and Star Ruby.
Key words: molecular biolog y; g rapefruit; g ene resources; g enetic dive rsity; AFLP
葡萄柚Citrus paradise Macf.为世界四大主栽柑橘类群 (甜橙类、宽皮柑橘类、柠檬来檬类、葡萄柚和柚类 )
经济林研究　 2008, 26( 2): 1-5
Nonwood　 Forest　 Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期: 2008-03-05
基金项目: 国家林业局“ 948”项目 ( 2001-38) ;云南省自然科学基金项目 ( 2006C0035Q) ;云南省重点建设学科西南林学院森林培育学科资
助项目。
作者简介: 刘惠民 ( 1957- ) ,男 ,湖南武冈人。 教授 ,博士 ,主要从事经济林培育方面的教学与研究工作。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2008. 02. 016
之一 ,由于果实在树体上悬挂成串 ,簇生如葡萄 ,所以被称为葡萄柚 [1 ]。早在 20世纪 20年代前后 ,我国就已开始
引种葡萄柚 ,但由于早期品种的果实味酸、微苦 ,不适合我国消费者的口味 ,且人们不明葡萄柚的食用方法和营
养价值 ,未充分认识和掌握葡萄柚的特性和栽培技术 ,使其在我国的发展受到限制 [1, 2 ]。 随着新品种果实风味、
口感的改善和人们对葡萄柚营养价值认识的提高 ,葡萄柚逐渐为我国消费者所接受。 因此 ,近年来我国南方不
少地方相继开展了葡萄柚新品种的引种试验。云南省于 2002年初次从美国引进 9个葡萄柚品种 (品系 ) ,并开展
了不同砧木嫁接愈合过程观测 [3 ]、叶片营养分析 [4 ]、果实品质评价 [5 ]、适宜采收期及保鲜技术 [ 6]等方面的研究。
但针对这些引进葡萄柚品种基因资源的研究尚未见相关报道。本研究中采用 AFLP分子标记技术 ,对引种至云
南省的 9个葡萄柚品种基因资源进行评价 ,以期为引进葡萄柚品种的进一步开发利用、遗传改良和新品种培育
提供前期研究基础。
1　材料与方法
1. 1　研究材料
供试材料是 2002年首批从美国引进穗条 ,于当年在云南省普文林场以“曼赛罗”为砧木进行高接换冠繁殖
的 9个葡萄柚品种 ,每支穗条仅嫁接 1株 ,共计 74株。 品种分别为火焰 ( Flame,红肉 )、矮化 ( Genetic Dwa rf,白
肉 )、亨路比 ( Henderson Ruby ,粉红肉 )、哈路比 ( Hudson Foster,红肉 )、帕利斯 ( Perli st ,白肉 )、瑞路比 ( Ray
Ruby ,粉红肉 )、里德马叙 ( Reed M arsh,白肉 )、里约红 ( Rio Red,红肉 )和星路比 ( Sta r Ruby ,红肉 )。引进的 9个
品种均已正常开花结实。
1. 2　总 DNA提取
分别采取供试材料9个品种共 74株葡萄柚的嫩叶带回实验室 ,采用改良 SDS法依照标准酚 /氯仿流程提取
总 DNA[7 ] ,用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量 ,用紫外分光光度计 ( Spekl-1300)检测其浓度 ,最后分取各样
本 50μL DNA样品稀释至 20 mg /L,保存于 - 20℃冰箱中备用。
1. 3　 AFLP分析
AFLP分析的基本程序按照 V os等 [8 ]所描述的方法进行 ,并依据本实验室的前期经验对体系进行优化。采
用 EcoRI /Mse I酶切组合进行基因组限制性酶切 ,预扩增反应选用引物组合 E00 /M 00,选择性扩增反应采用引
物组合 E+ 3 /M+ 3。 PCR扩增反应在 PTC-100TM Thermal PCR仪上进行。
1. 4　电　泳
选择性扩增产物经 95℃ 5min变性后 ,在 6%的变性聚丙烯酰胺序列分析胶上电泳分离。应用 JY-CX2B型
(改进型 )测序电泳槽 ,在 90 W恒定功率条件下电泳约 90 min。电泳后采用银染检测法进行 AFLP指纹显色反
应 [9 ]。
1. 5　数据统计分析
按照电泳图谱中同一位置上 AFLP条带的有无进行统计 ,有带记为“ 1” ,无带记为“ 0” ,形成 0 /1矩阵图输
入计算机。应用 PO PGEN E 1. 31软件 [10 ]在假定种群处于 Hardy-Weinberg平衡状态下 ,对全部品种和各单个品
种分别进行遗传参数分析 ,计算多态位点百分率、观测等位基因数、有效等位基因数、 Nei s基因多样性指数、
Shannon信息指数和品种间基因分化系数 (GS T ) [11 ] ,以及种源间的 Nei s遗传距离 [ 12] ,采用 U PGM A方法对各
种源进行聚类分析。 进一步采用 WINAMOVA1. 55软件 [13 ]对品种间以及品种内的分子变异进行分析
( AMOVA) ,同时算出品种间的基因分化系数 (Hs t )。 PO PGEN E 1. 31软件和 WINAMOV A1. 55软件的输入
文件由 DCFA 1. 1软件 [14 ]制作。 WINAMOVA1. 55软件分析的显著性检验采用 1 000次置换。
2　结果与分析
2. 1　基因资源多样性
从 72对引物组合中筛选出 7对 AFLP引物组合 ,对引进的 9个葡萄柚品种的 74份 DNA样品进行 PCR扩
增。 7对引物组合扩增出的条带数从 30条至 50条不等 ,共扩增出 263条谱带 ,其中多态带百分率为 7. 22%。矮
化品种的多态性最低 ,仅为 0. 38% ;瑞路比的多态性最高 ,也只有 6. 46% (见表 1)。
2 经　　济　　林　　研　　究 第 26卷　
表 1　葡萄柚 9个品种的遗传多样性指数
Table 1　 Genetic diversity indexes of 9 cultivars in C. paradise
品种
Cul tivars
样本数
Number of
s amples
多态性标记百分率
Percentag e of
polymo rphic markers /%
观测等位基因数
Observed number
of alleles
有效等位基因数
Ef fective number
of al leles
Nei s基因多样性
Nei s gen e
diversi ty
Shannon信息指数
Shannon s
in formation index
火焰
Flame
10 1. 90 1. 019 0 1. 010 2 0. 006 1 0. 009 4
矮化
Genetic Dw arf
8 0. 38 1. 003 8 1. 000 5 0. 000 5 0. 000 9
亨路比
Henders on Ruby
11 2. 66 1. 026 6 1. 012 3 0. 008 2 0. 012 8
哈路比
Hudson Fos ter
8 3. 42 1. 034 2 1. 020 9 0. 012 4 0. 018 6
帕利斯
Perlis
7 3. 80 1. 038 0 1. 025 8 0. 014 7 0. 021 6
瑞路比
Ray Ruby
9 6. 46 1. 064 6 1. 031 6 0. 019 7 0. 030 4
里德马叙
Reed Marsh
9 1. 52 1. 015 2 1. 006 0 0. 004 2 0. 006 7
里约红
Rio Red
4 0. 76 1. 007 6 1. 006 5 0. 003 5 0. 004 9
星路比
Star Ruby
8 0. 76 1. 007 6 1. 005 0 0. 002 8 0. 004 1
品种水平
Cult ivar level
74 2. 41 1. 024 1 1. 013 2 0. 008 0 0. 012 2
物种水平
Species lev el
74 7. 22 0. 023 4 0. 008 0 0. 659 2 0. 258 5
　　在物种水平上 , Nei s基因多样性指数和 Shannon信息指数分别为 0. 659 2和 0. 258 5。而在 9个葡萄柚品
种中 , Nei s基因多样性指数以矮化品种为最低 ,瑞路比品种为最高。 9个品种按照 Nei s基因多样性指数从大
到小排序依次为瑞路比 ( 0. 019 7)、帕利斯 ( 0. 014 7)、哈路比 ( 0. 012 4)、亨路比 ( 0. 008 2)、火焰 ( 0. 006 1)、里德
马叙 ( 0. 004 2)、里约红 ( 0. 003 5)、星路比 ( 0. 002 8)、矮化 ( 0. 000 5)。 9个品种的 Shannon信息指数表现出与
Nei s基因多样性指数相同的变化趋势 (见表 1)。 POPGEN E软件分析结果显示 ,葡萄柚 9个品种间的基因分化
系数GST为 0. 659,说明葡萄柚的遗传差异主要存在于各品种之间 ,品种内的差异占总变异的 34. 1%。由此可见 ,
无论是 9个品种之间 ,还是品种内单株之间 ,遗传差异均表现出较小数值 ,表明引进的各个品种接穗的一致性
较好 ,确保了品种的纯净度。同时 ,品种之间相对较高的相似性 ,也降低了各品种间因授粉等引起果实品质混杂
的风险。
2. 2　遗传差异的分子方差分析
WINAMOVA分析结果表明 ,引进的 9个葡萄柚品种间的遗传变异分量为 2. 167 8,占总变异的 59. 95% ;
而品种内遗传变异分量为 1. 448 4,占总变异的 40. 05%。 基因分化系数 Hs t为 0. 599,即总的遗传变异中有
59. 9%的变异存在于各品种间 ,品种内的遗传变异占总遗传变异的 40. 1% ,品种间的遗传变异达极显著水平
(P < 0. 001) (见表 2)。品种间的异质性指数 Bp为 20. 29,说明品种间具有大约 80%的相似性。两两品种间异质
性指数在 0. 453～ 30. 883之间 ,帕利斯与哈路比之间的异质性指数最低 ,Bp= 0. 453,矮化与星路比之间的异质
性指数最高 ,Bp= 30. 883(见表 3)。
表 2　品种间和品种内分子变异的 AMOVA分析
Table 2　Analysis of molecular var iance (AMOVA) among and within cultivars inC . paradise
变异来源
Variation
sources
自由度
Degree of
f reedom
平方和
Sum s of
squares
均方
Mean squares
变异组分
Variation
com ponen ts
总变异百分率
Percentag e of
total variation
P值
Pvalue Hst Bp
品种间
Betw een cultiv ars
8 153. 26 19. 157 2. 167 8 59. 95 < 0. 001 0. 599 20. 29
品种内
Within cul tivars
65 94. 15 1. 448 1. 448 4 40. 05
总计
Total
73 247. 41
3第 2期 刘惠民等: 引进葡萄柚品种基因资源的 AFLP分析
表 3　葡萄柚 9个品种间的 Nei s遗传距离和异质性指数†
Table 3　Nei s genet ic distances and B-test indexes between 9 cultivars in C. paradise
品种
Cult ivar
火焰
Flam e
矮化
Genetic
Dwarf
亨路比
Henderson
Ruby
哈路比
Hudson
Fos ter
帕利斯
Perlis
瑞路比
Ray Ruby
里德马叙
Reed Marsh
里约红
Rio Red
星路比
Star Ruby
火焰
Flame
12. 210 2. 539 4. 330 4. 627 5. 315 20. 845 13. 566 22. 847
矮化
Genetic Dw arf
0. 001 5 12. 791 17. 733 16. 884 17. 187 29. 534 22. 454 30. 883
亨路比
Henders on Ruby
0. 000 6 0. 000 9 2. 455 1. 678 2. 240 18. 094 11. 217 20. 148
哈路比
Hudson Fos ter
0. 002 3 0. 006 5 0. 002 8 0. 453 1. 651 16. 065 10. 071 18. 784
帕利斯
Perlis
0. 001 8 0. 003 7 0. 000 5 0. 000 5 0. 755 14. 736 9. 193 17. 546
瑞路比
Ray Ruby
0. 003 0 0. 004 2 0. 001 7 0. 003 8 0. 001 2 13. 757 8. 096 16. 498
里德马叙
Reed Marsh
0. 034 6 0. 033 3 0. 033 0 0. 037 1 0. 034 9 0. 026 1 0. 975 3. 747
里约红
Rio Red
0. 035 5 0. 033 7 0. 034 1 0. 039 2 0. 036 6 0. 027 4 0. 000 8 2. 044
星路比
Star Ruby
0. 029 8 0. 028 0 0. 028 1 0. 032 9 0. 030 4 0. 023 5 0. 003 0 0. 003 5
　　　† 对角线上方数值为 B-t est指数 ,对角线下方数值为 Nei s遗传距离。
B-test indexes are above diag onal and Nei s g enetic distances a re below diagona l.
图 1　基于 Nei s遗传距离的 9个葡萄柚品种 UPGM A聚类关系图
Fig. 1　 UPGMA dendrogram of 9 cultivars inC. paradise based on Nei s
genetic distances
2. 3　聚类分析
POPGENE分析结果显示 ,葡萄柚 9
个品种间的遗传距离 (D )在 0. 000 5～
0. 037 1之间 ,平均为 0. 025 8(见表 3)。
基于 Nei’ s遗传距离 ,采用 U PGM A法
进行聚类得到系统关系树 ,将葡萄柚 9
个品种聚类为 2个大组 (见图 1)。第 I大
组包括火焰、矮化、亨路比、哈路比、帕利
斯和瑞路比 6个品种 ,第 II大组由里德
马叙、里约红和星路比 3个品种组成。其
中 ,第 I大组又可细分为 2个亚组 ,第 1
亚组由火焰、矮化和亨路比 3个品种构
成 ,第 2亚组由哈路比、帕利斯和瑞路比
3个品种构成。
3　讨　论
AFLP标记所揭示的是分析样本基因组 DNA在酶切位点和其后的选择性碱基的变异 ,多态性条带的数量
反映了供试材料之间在 DNA水平上酶切位点的差异性 [15 ]。本研究中应用 AFLP分子标记技术 ,对 9个葡萄柚
品种之间的遗传差异分析显示 ,多态带百分率仅为 7. 22% ,说明供试葡萄柚品种之间在 DNA水平上具有较低
的遗传变异。Co razza-Nunes等应用 RAPD和 SSR标记对 38个葡萄柚品种的分析结果也表明 ,葡萄柚品种间的
遗传变异水平较低 [1 6]。这与葡萄柚品种的培育及繁殖方法有关。在主栽的 20多个葡萄柚品种中 ,无核粉红肉
的星路比是用热中子处理哈德森葡萄柚而选育出的品种 ,其余品种大部分是从邓肯葡萄柚自然芽变后选育而
来的 [1 ]。 而一般从中选育出具有优良特性的个体后 ,往往又以柑桔属其它种作为砧木 ,通过嫁接等方式进行无
性繁殖 ,很少通过实生繁殖。因此 ,尽管葡萄柚可能起源于柚与橙的自然杂交 [17, 18 ] ,但各品种选育亲本的相近
性、芽变等培育途径的相对单一性、以及无性繁殖方法等因素 ,造成了葡萄柚品种拥有的遗传基础较窄。
在对葡萄柚品种遗传结构的分析中 , PO PGEN E软件分析结果 (GST= 0. 659)与 AMOVA软件分析结果
(Hs t= 0. 599)基本一致 ,前者仅比后者高出 6% 。二者所揭示的葡萄柚遗传变异规律均表明 ,葡萄柚的遗传多样
性主要存在于品种之间。因此 ,每一个引进的葡萄柚品种材料都是一份宝贵的基因资源。 9个葡萄柚品种的引进 ,
4 经　　济　　林　　研　　究 第 26卷　
既增加了我国柑桔类果树的栽培品种 ,又为结合我国丰富的柚类资源进行新品种培育提供了难得的遗传材料。
4　结　论
( 1)利用 7对 AFLP引物组合从 9个葡萄柚品种的 74份 DNA样品中共扩增出 263条谱带 ,其中多态带百分
率仅为 7. 22% ,表明引进的葡萄柚品种间的遗传变异水平较低 ,遗传相似性较高 ,这与葡萄柚品种的培育途径
和繁殖方法有关。
( 2) 9个葡萄柚品种间的遗传分化系数 GST= 0. 659,说明引进的葡萄柚基因资源的遗传差异主要存在于不
同品种之间 , 9个葡萄柚品种都是宝贵的遗传育种资源。
( 3) 9个葡萄品种可以划分为 2个大类 ,第 I大类包括火焰、矮化、亨路比、哈路比、帕利斯和瑞路比 6个品
种 ,第 II大类包括里德马叙、里约红和星路比 3个品种。 品种间的遗传关系与各品种果肉的色泽不一致。
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[本文编校:闻　丽 ]
5第 2期 刘惠民等: 引进葡萄柚品种基因资源的 AFLP分析