全 文 ：第 22 卷　第 2 期
2006 年 4 月 　 　　　 　 　 　
忻 州 师 范 学 院 学 报
JOURNAL OF XINZHOU TEACHERS UNIVERSITY
　　　　　　 Vol.22　No.2　 Apr.2006　
太白红杉 DNA 的提取与鉴定
张二芳 ,阎桂琴 ,杨红爱
(吕梁高等专科学校 ,山西 离石 033000;山西师范大学 ,山西 临汾 041004)
摘　要:文章用 2XCTAB法 、SDS法 、一步法三种方法从含有大量多糖 、酚类 、醌类 、萜等
次生代谢产物的松科植物太白红杉中提取和纯化了基因组总 DNA ,并经 0.6%琼脂糖凝胶电
泳 ,紫外吸收值比值对所提 DNA 的产率 、质量和纯度作了鉴定 ,为太白红杉的分子生物学研
究 、鉴定提供了可靠的基础。
关键词:太白红杉;分子生物学;次生次谢产物
中图分类号:O636.9　　文献标识码:A　　文章编号:1671-1491(2006)02-0005-03
　　太白红杉(Larix chinensis)是松科落叶松属植
物 ,是我国特有的树种 ,属国家二类保护植物 ,仅分
布于陕西境内的秦岭山地 ,见于秦岭主峰太白山 、西
太白山 、长安光头山 、户县光头山 、宝鸡玉皇山 、佛坪
大润沟 、周至首阳山及洋县兴隆岭等处 ,垂直分布范
围在 2500 米(长安光头山)———3500 米(太白山),
是秦岭山地森林最上线的唯一的落叶乔木针叶耐寒
冷树种 。由于太白红杉在海拔 2700米—3500 米亚
高山地区的水源涵养 、水土保护方面发挥着重要作
用 ,从而引起了生物界的重视 。
太白红杉因其分布区山高路偏 ,生境严酷 ,目前
对它的研究仅限于野外调查 ,系统描述 ,而对太白红
杉进行深入的种群遗传结构 、系统演化 、遗传多样性
研究未见报道。本文对太白红杉这种高含多种次生
代谢物的“顽固”植物中提取高质量的 DNA 的方法
进行比较研究 ,为太白红杉的分子生物学研究提供
可靠的基础。
一 、材料与方法
(一)取材
2003年 5 月于户县光头山(海拔 2500 —2700
米)采样 31个;佛坪 、太白山各沿海拔每升高 50米
在阴坡 、半阴坡 、横向跨度上共采样 60个。取鲜嫩 、
无病斑的叶片 ,采集后稍微淋一些水 ,尽快带回实验
室 ,放于-80℃的冰箱中保存备用 。
(二)药品配制
1.CTAB法试剂
(1)提取液(PH8.0):1.4 M NaCl;20 mM ED-
TA;100mM Tris;2%CTAB;5%～ 10%巯基乙醇;
异丙醇;
(2)洗涤液:70%乙醇;100mM NH4Ac
(3)TE 缓冲液(PH8.0):1mM Tris;0.1 mM
EDTA
(4)DNA检测试剂
1xTAE 电泳缓冲液(PH8.0):0.04M Tris;
0.001M EDTA;0.1142%冰醋酸;0.6 %琼脂糖凝胶
(5)6x 点样染料:0.25%溴酚兰
2.SDS法主要试剂
(1)提取液:500 mM NaCl;50 mM EDTA;100
mM Tris;20 %SDS 以上试剂同 1
3.一步法主要试剂
0.5 M NaOH ;15 %巯基乙醇
(三)仪器
Eppendorf管 ,高速离心机 ,平板电泳仪 ,恒温水
浴器 ,750紫外分光光度计 ,冰箱
(四)方法
1.CTAB法
预热恒温水浴器 65℃,预热 2XCTAB 至 65℃。
将冷冻材料置于冷冻研钵(-80℃),迅速研成粉
收稿日期:2005-04-13
作者简介:张二芳(1975-), 女 ,吕梁高等专科学校生命科学系 , 助教。
末 ,装入 1.5 mL 的 Eppendorf 管中 , 立即加入
700 μL 2XCTAB和 70 μL 的巯基乙醇 ,放入恒温水
浴器反应 50分钟 ,其间每隔 10分钟轻轻摇动一次 。
每管中加入等体积(24/1)氯仿/异丙醇溶液 ,混匀 ,
置于离心机上 , 8000转/分 ,离心十分钟。
用剪掉尖端的枪头吸取上清液 ,移入另一管中 ,
重复上面步骤。用同样方法吸取上清 ,加入 2/3体
积异丙醇 ,置于-20℃冰箱沉淀 20分钟以上 。待出
现白色絮状沉淀时 , 10000 转/分离心 5 分钟 ,使沉
淀凝集。将液体倒掉 ,留下沉淀。用洗涤缓冲液清
洗沉淀 1-2 次 ,方法为加入洗涤液 1/3 体积置于
4℃冰箱放置 30分钟或过夜。倒掉洗涤液 ,只留下
沉淀加 70%乙醇约 1/3体积 ,放十分钟或过夜 。倒
掉乙醇 ,风干或吹干 ,溶于 0.1TE60-80μL中 ,轻弹
管壁使 DNA 沉淀重新溶解 , 4℃冰箱可保存一个
月。
2.SDS法
步骤同 1.4.1 , 只在第二步加的提取液为
500μL 缓冲液 ,200μL SDS提取液 。
3.一步法
本方法是引用张明永[遗传 22(2):106 , 2000]
的一步法提取植物 DNA 用于大规模 RARD 分析。
每取10—20μg 幼叶 ,加 100μL 0.5 M NaOH 并附加
1.5%的巯基乙醇 。
(五)DNA 的鉴定
方法一:
先制 0.6%的琼脂糖凝胶 ,熬胶以前加 70μL 的
溴化乙烷 。点样液中加 20μL 溴酚兰 ,再加样品 6μL
和 5μLDNA+5μL 水 。调电压 60伏 ,时间 15—30
分钟 。电泳检测 DNA的纯度和浓度 。最后置于透
射紫外光(254nm)下观察记录。
方法二:
DNA 在 260nm 处有一明显的吸收峰 ,通过对
260nm/280nm DNA的光吸收比值可鉴定其纯度。
对 260nm/230nm光吸收比值的计算 ,可鉴定其中
盐等小分子杂质的含量 。
二 、结果
1.用 SDS法提取的 DNA 样品经 0.6%琼脂糖
凝胶电泳显示出的带不很清晰 。用一步法提取的
DNA 根本不成带 。用 2XCTAB 法抽提得到 DNA
分子在琼脂糖凝胶上显示出一条迁移率很低的整齐
条带 ,在溴酚兰的前锋线之前无弥散性的荧光区 。
图 1　0.6%的琼脂糖凝胶电泳检测 2xCTAB 法抽提的 DNA 样品
　　(二)总 DNA 在 260nm/280nm 处光吸收比值
为 1.79—1.84(λ-DNA 的为 1.8 左右);260nm/
230nm 处光吸收比值为 2.3;260nm 处有一明显的
吸收峰。
三 、讨论
(一)化学试剂的作用机理与杂质的去除
一步法提取 DNA 用 NaOH 作提取液 ,是根据
RNA 溶于碱液 ,而 DNA 不溶于碱液的道理来除去
材料中的 RNA。此方法的缺点是容易有小分子物
质和部分酯类 、多糖和蛋白质的残留。另一方面可
能所加 NaOH 量与所提材料的比例 ,也会影响抽提
效果 ,从而影响到所抽提 DNA的电泳效果 。
2XCTAB法提取是一种成熟的 ,广泛使用的方
法。CTAB是一种去污剂 ,能裂解细胞又能沉淀多
糖。它能跟核酸形成复合物 ,这些复合物在高盐溶
液(0.7MNaCl)中可溶并且稳定存在 ,但如果降低盐
的浓度(0.3M NaCl), CTAB 与核酸的复合物就会
因溶解度降低而沉淀出来。而大部分的蛋白质及多
糖仍溶解于溶液中;太白红杉含有较多的酚类化合
物 ,酚类化合物非常容易发生褐变 ,提取液中的巯基
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乙醇可以防止酚类化合物褐变;EDTA 是 Mg2等二
阶酶激活离子的有效络合剂 ,可起到抑制 DNA 剪
切酶活性的作用;氯仿-异戊醇主要起除去杂合蛋
白质的作用;第五步中沉淀 DNA用异丙醇 ,一方面
异丙醇可选择性的沉淀 DNA , 而与留在溶液中的
RNA分离;另一方面由于太白红杉提取比较困难 ,
用异丙醇在室温下即可沉淀 ,而且小分子量 DNA
都能沉淀下来;(乙醇沉淀 DNA 时 ,室温下只能选
择性地沉淀大分子量 DNA);洗涤液主要是除去盐
类等小分子杂质;70%乙醇主要用来洗涤多糖和某
些在异丙醇中溶解较小的盐 ,以防这些盐同 DNA
一起沉淀下来。
SDS 法提取 DNA ,首先材料被研磨以破碎细胞
壁 ,提取液中 SDS 使细胞膜裂解 ,细胞核中染色体
DNA附着在细胞壁碎片上 ,离心时易被沉淀下来 。
SDS在裂解细胞膜的同时 ,能够破坏带正电荷的组
蛋白与带负电荷的 DNA 骨架间的离子作用 , SDS
能与蛋白质结合并使它们带上大量负电荷;此外 ,
SDS 也能使脱氧核糖核酸酶和其它蛋白质变性。本
方法中下面的试剂原理与 CTAB 法相同 。SDS 法
提取的 DNA 电泳效果不好 ,可能是细胞壁中的多
糖去除不彻底。
(二)操作过程中对 DNA纯度质量的影响
首先 ,使用的研钵要预先冷处理 ,这样就可以防
止冷冻材料在研磨时就被融化 。研磨好的材料粉末
加入管后要快速加入事先预热的提取介质 ,以便即
时钝化组织破坏时 DNA酶的活性 。
至于用氯仿异戊醇抽提时 ,一定要注意轻轻摇
匀 ,以避免 DNA的断裂;抽提后的上清液转移到另
一管时 ,一定要用较粗的枪头(可使用剪去最细部分
的枪头),从而是提取过程中的机械损伤降至最低 ,
得到尽可能大的 DNA 片段;DNA 沉淀经洗涤液乙
醇洗过后 ,一定要风干后再加 0.1 ,使 DNA 充分溶
解。
DNA鉴定所用的凝胶一定要均匀 ,无气泡 ,以
防影响 DNA的迁移效果 。
(三)三种方法抽提效果的讨论
用0.6%的琼脂糖凝胶电泳检测所得 DNA ,
SDS 法所得 DNA 所显示的电泳带不很清晰 ,并有
拖尾现象 ,说明其中混有的杂质较多;一步法所得
DNA 根本不成带 , 说明其中混有的杂质更多;
2XCTAB法所提 DNA所显示的是一条迁移率很低
的 ,整齐的条带 ,在溴酚兰的前锋线之前无弥散性的
荧光区 , 说明用法所提的 DNA 是比较纯的。用
2XCTAB用法所得的 DNA 在 260处有一明显的吸
收峰;在波长 260nm/280nm 处光吸收比值为 1.79
-1.84 之间 ,表明所提的纯度比较高 ,基本上没有
RNA 分子蛋白质或酚的污染;在波长 260nm/
230nm 处光吸收比值为 2.3 ,表明溶液中基本上没
有残存的盐和小分子杂质。
四 、小结
以上所讨论的三种提取 DNA 的方法 ,对于提
取太白红杉 DNA 的效果 , 2XCTAB 法明显的优于
其它两种方法 ,它不仅质量高 ,而且纯度高 ,能够获
得高质量的基因组 DNA 。因此 ,在研究太白红杉分
子生物学的实际工作中应选取 CTAB法提取 DNA 。
(责编:李　丹)
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(下转第 16页)
7第 2 期　　　　　　　　　　　　　　张二芳 ,阎桂琴等:太白红杉 DNA 的提取与鉴定
适应中学生好奇 、好胜的心理特点 , 才能激发他们对新课学
习的兴趣 ,才能达到预定的教学目的。如果教师在使用复习
法 、对比法 、设疑法时能注意以下几点 ,相信学生的兴趣会高
一些:(1)不要长期采用同一种导入方法 ,尽量与其他方法交
错进行 ,让学生有新鲜感。(2)在采用同一种导入方法时 , 可
使用灵活新颖的形式 ,例如 , 在采用复习法导入时 ,不要总以
“前面我们学习了……这节课我们学习……”来开头 ,可以用
抢答 、小测试 、小竞赛等形式 ,利用学生的好胜心理 , 来激发
其兴趣。(3)用设疑法导入时 , 教师提出的问题 , 不能太难 ,
也不能太容易 ,刚好在学生的“最近发展区”为佳 , 学生只要
在教师的指导下 ,经过努力就能掌握 , 利用学生的探究心理
来激发其兴趣。(4)用对比法导入时 , 教师应巧妙地将前后
知识的对比点突出来 , 使学生产生认知冲突 , 以激起其惊奇
感 、好奇心 , 从而激发其兴趣。(5)教师可以用生动幽默的言
语将学生的积极性调动起来。
(责编:贺　霞)
参考文献:
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学报 , 1997 ,(3):57.
The Research on Interest of Learning at the Beginning
of Chemistry Class
CHEN Feng -jiao
(Zhangzhou Teachers Universi ty ,Zhangzhou , 363000 , China)
Abstract:Lead-in of class plays a very important part in students study .Interest of learning affects the effi-
ciency of students study too.I take several common lead-in methods as examples.I analy ze specifically the
causes that students are interested in chemistry lead-in in theory and practice.At last , I give some advice fo r
reference.
Key words:chemistry teaching;lead-in of class;interest of leraning
(上接第 7页)
DNA Isolation and Characterization of Larix Chinensis Beissn
ZHANG Er-fang ,YAN Gui-qin , YANG Hong-ai
(Lǜliang Teachers College Lishi , 033000;
Shanx i Teachers Universi ty , Linfen 041004 , China)
Abstract:Genome DNA was ex tracted from Larix Chinensis leaves ,which consist of polysaccharides and other
secondary metabolites such as polyphones.terpens and resins , by 2XCTAB method.SDS method and one step
method.The resulted DNA samples were tested using agarose gel electrophresis , propro tion of absorbing for ul-
traviolet ray f rom their quality , y ield and purity.The method provides a dependent basis fo r the w ork of molecu-
lar biology.
Key words:Larix Chinensis;molecular biology;secondary metabolites
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