全 文 ：中国农学通报 2015,31(22):270-273
Chinese Agricultural Science Bulletin
响应面法优化乌苏里瓦韦热水提取绿原酸工艺
王丽红，姜晓婷，谭凤田
（佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007）
摘 要：旨在对乌苏里瓦韦中绿原酸的工艺条件进行优化。采用热水提取乌苏里瓦韦中绿原酸，根据
Box-Benhnken中心组合设计原理，设计了3因素3水平响应面分析试验，来确定乌苏里瓦韦中绿原酸的
最佳工艺条件。结果表明乌苏里瓦韦绿原酸最佳提取工艺条件为：液料比25:1，提取时间4 min，提取温
度96℃，在这种条件下绿原酸得率可达5.11%，与理论值相接近，表明响应面分析法优化乌苏里瓦韦中
绿原酸热水提取工艺具有良好的效果。水提法具有能耗少、时间短和低成本等特点，为乌苏里瓦韦提取
绿原酸的工业化生产提供了理论依据。
关键词：乌苏里瓦韦；响应面法；绿原酸
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 论文编号：2014-1317
Optimization of Extraction Process of Chlorogenic Acid from Lepisorus ussuriensis (Regel et Maack)
Ching in Hot Water by Response Surface Methodology
Wang Lihong, Jiang Xiaoting, Tan Fengtian
(College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi Heilongjiang 154007)
Abstract: The aim was to optimize the extraction process of chlorogenic acid from Lepisorus ussuriensis (Regel
et Maack) Ching. The hot water was used to extract chlorogenic acid from Lepisorus ussuriensis (Regel et Maack)
Ching. According to Box- Benhnken central composite design principles, three factors and three levels of
response surface analysis tests were designed to determine the optimum extraction conditions of chlorogenic
acid from Lepisorus ussuriensis (Regel et Maack) Ching. The results showed that the best extraction process of
chlorogenic acid was as follows: liquid to material ratio was 25:1, extraction time was 4 min, and extraction
temperature was 96℃ . Under such condition, chlorogenic acid yield was up to 5.11% and close to the
theoretical value, indicating that the hot water extraction process had good results with the response surface
methodology to optimize the extraction process of chlorogenic acid from Lepisorus ussuriensis (Regel et Maack)
Ching. The water extraction had characteristics such as low energy consumption, short time and low cost, which
provided theoretical basis for industrialized production of chlorogenic acid from Lepisorus ussuriensis (Regel et
Maack) Ching.
Key words: Lepisorus ussuriensis (Regel et Maack) Ching; response surface methodology; chlorogenic acid
0 引言
乌苏里瓦韦[Lepisorus ussuriensis (Regel et Maack)
Ching]为蕨类水龙骨科瓦韦属植物，别名石茶、树茶、
还阳草、大石韦等。据记载该植物具有清热解毒，利
尿，止咳，止血，消肿等功能[1]。在中国分布于安徽、河
南、山东、河北、辽宁、吉林、黑龙江[2]。民间多用于茶
饮，具有良好的消肿、抗炎的功效。绿原酸为其主要活
性成分，绿原酸(chlorogenic acid)，是植物在有氧呼吸
过程中经磷酸戊糖途径的中间产物合成的一种苯丙素
类物质。研究表明，绿原酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、
基金项目：佳木斯大学研究生创新项目(LM2014_065)；佳木斯大学博士专项科研项目(BZ2015-06)。
第一作者简介：王丽红，女，1968年出生，辽宁海城人，教授，博士，研究方向：植物药的开发及利用。通信地址：154007佳木斯市向阳区学府路148
号，E-mail：wlh_6663@163.com。
收稿日期：2014-05-07，修回日期：2015-05-05。
王丽红等：响应面法优化乌苏里瓦韦热水提取绿原酸工艺
抗病毒、免疫调节、降糖等多种作用[3-7]，中国一直从金
银花中提取绿原酸，药典中规定金银花中绿原酸含量
不得少于 1.5%，产品主要是浸膏，其绿原酸含量为
15%~30%[8]。目前关于乌苏里瓦韦的报道有全草鉴
定[9]、化学成分分离[10-11]、活性成分测定及抗炎作用[12-15]
研究，尚无关于乌苏里瓦韦热水提取绿原酸工艺优化
的相关报道。因此，本实验为乌苏里瓦韦中绿原酸的
提取分离及工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 乌苏里瓦韦药材：采自佳木斯市汤原
县鹰山，经佳木斯大学药学院生药教研室王丽红教授
鉴定为水龙骨科瓦韦属植物乌苏里瓦韦全草。
1.1.2 主要试剂 绿原酸标准品，由成都康邦生物科技
有限公司生产，水为蒸馏水。
1.1.3 主要仪器 棱光 UV757CRT紫外分光光度仪、
SHB型循环水式多用真空泵由郑州杜甫仪器厂生产、
BP211D型 sartorius电子天平（德国），FA2004分析天
平仪由上海恒平科学技术有限公司生产，NH-Z4恒温
水浴锅由郑州长城科工贸有限公司。
1.2 方法
1.2.1 乌苏里瓦韦绿原酸提取 将乌苏里瓦韦全草置于
通风避光处阴干至恒重，粉碎，过80目筛，备用。精密
称取乌苏里瓦韦 0.2 g，加入一定量的蒸馏水，水浴加
热提取数次，合并滤液，真空抽滤，用蒸馏水定容。
1.2.2 标准曲线的绘制 绿原酸测定波长的选择，通过
全波长扫描得绿原酸标准溶液的吸收光谱图，测得绿
原酸在 324 nm处有较为平缓的最大吸收峰，故选
324 nm作为绿原酸的检测波长。精密称取绿原酸标
准品10 mg，用蒸馏水定容至50 mL的容量瓶中，得到
对照品储备液。精密吸取绿原酸标准溶液 0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5、0.7 mL置于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水
定容，配成系列标准溶液，取水作为空白对照，于
324 nm处测定 6种样品吸光值，以吸光度(A)为纵坐
标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。
1.2.3 单因素试验
（1）液料比的选择。固定提取温度60℃，提取时间
1 h，提取次数1次，选择液料比分别为15:1、20:1、25:1、
30:1、35:1进行试验，研究液料比对绿原酸得率的
影响。
（2）温度的选择。固定液料比25:1，提取时间1 h，
提取次数1次，选择温度分别为60、70、80、90、100℃进
行试验，研究温度对绿原酸得率的影响。
（3）提取时间的选择。固定液料比25:1，提取温度
100℃，提取次数 1次，选择提取时间 2、4、6、8、10 min
进行试验，研究提取时间对绿原酸得率的影响。
（4）提取次数的选择。固定液料比25:1，提取温度
100℃，提取时间 4 min，选择提取次数分别为 1、2、3、4
次进行试验，研究提取次数对绿原酸得率的影响。
1.2.4 响应面法优化提取工艺 通过单因素实验基础
上，选取液料比、温度、时间3个因素，每个因素3个水
平进行优化，以绿原酸得率作为响应值，设计响应曲面
试验，试验因素及水平见表1。
1.2.5 乌苏里瓦韦绿原酸得率的计算 测定各提取液在
因素
液料比(A)
提取时间(B)
提取温度(C)
单位
—
min
℃
间距
5
2
10
编码水平
-1
15:1
2
80
0
20:1
4
90
1
25:1
6
100
表1 响应面试验因素与水平
324 nm处的吸光度代入回归方程计算绿原酸含量，乌
苏里瓦韦绿原酸得率=（乌苏里瓦韦中绿原酸质量/乌
苏里瓦韦质量）×100%。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
紫外回归方程为 y=0.056x+0.0034，R2=0.9994，结
果表明，绿原酸在2~14 µg/mL范围内与吸光度呈良好
的线性关系。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对乌苏里瓦韦绿原酸得率的影响 按
1.2.3（1）条件提取，绿原酸得率依次为 3.250%、
3.800%、3.838%、3.822%、3.873%。表明液料比为25:1
时，绿原酸得率达到最大值，继续增加溶剂，绿原酸得
率无明显变化，因此液料比为25:1为宜。
2.2.2 提取温度对乌苏里瓦韦绿原酸得率影响 按
1.2.3（2）条件提取，绿原酸得率依次为3.804%、4.01%、
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4.328%、4.48%、4.573%，随着温度的增加绿原酸得率
随之增加，故提取温度100℃为宜。
2.2.3 提取时间对乌苏里瓦韦绿原酸得率影响 按
1.2.3（3）条件提取，绿原酸得率依次为 4.748%、
5.006%、4.879%、4.845%、4.851%，绿原酸得率在4 min
达到最大，故提取时间以4 min为宜。
2.2.4 提取次数对乌苏里瓦韦绿原酸得率影响 提取次
数 1、2、3、4次，绿原酸得率依次为 4.975%、5.219%、
5.147%、5.06%，提取2次可达到最高提取率，故提取次
数以2次为宜。
2.3 响应面法优化试验方案和结果
根据Box-Benhnken实验设计原理和运用Design-
Expert8.0.5.0设计实验方案[3-5]，采用响应面法设计3因
素3水平试验对绿原酸提取工艺进行优化，结果见表2
及表3。对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到
液料比、提取时间、提取温度之间的二次多项回归方程
得率 =5.08 + 0.075A + 0.055B + 0.076C + 0.054AB +
0.048AC-0.10BC-0.062A2-0.077B2-0.071C2。
从表 3可以看出，模型回归 P为 0.0185，P<0.005，
R2=0.8741，Adj R2=0.7121说明模型拟合度较好，试验
误差较小，可以用于对乌苏里瓦韦绿原酸得率进行预
测分析。由表3可看出，模型一次相A、C显著，B不显
著；BC的交互项显著，AB、AC不显著，同时根据F值
大小可得出各因素对绿原酸得率的影响程度依次为
C>A>B，即提取温度>液料比>提取时间。
根据回归方程做出的模型响应面曲面如图 1~3，
由图直观地反映了各个因素对响应值的影响。通过该
组图可以看出各因素对绿原酸得率的影响，利用
Design-Expert根据所建立的数学模型进行参数的最优
化分析，得出绿原酸最佳提取工艺条件为液料比为
24.85:1，提取时间 4.48 min，提取温度 96.94℃，乌苏里
瓦韦中绿原酸的理论得率5.14953%。
2.4 验证实验
结合实际操作，将工艺条件修改为液料比25:1，提
取时间4 min，提取温度96℃。该工艺进行3次验证实
验，结果乌苏里瓦韦中绿原酸得率5.11%，与预测值基
本一致，表明该三元二次方程与实际情况拟合较好，充
分验证了所建模型的正确性。
方差来源
模型
A
B
C
AB
AC
BC
残差
失拟项
纯误差
总误差
自由度
9
1
1
1
1
1
1
7
3
4
16
平方和
0.25
0.045
0.024
0.046
0.012
0.009216
0.041
0.036
0.031
0.005125
0.28
均方
0.028
0.045
0.024
0.046
0.012
0.009216
0.041
0.005097
0.010
0.001281
F值
5.40
8.80
4.77
9.07
2.31
1.18
8.08
7.95
P值
0.0185*
0.0209*
0.0653
0.0196*
0.1724
0.2207
0.0249*
0.0368
实验编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
A
0
-1
0
0
1
0
1
0
-1
1
-1
0
-1
0
0
1
0
B/min
0
0
-1
-1
-1
1
0
0
1
0
-1
1
0
0
0
1
0
C/℃
0
-1
1
-1
0
-1
1
0
0
-1
0
1
1
0
0
0
0
Y/%
5.075
4.771
5.053
4.727
4.834
5.014
5.219
5.130
4.938
4.942
4.910
4.934
4.856
5.094
5.032
5.079
5.070
表3 回归分析结果
表2 响应面试验结果
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王丽红等：响应面法优化乌苏里瓦韦热水提取绿原酸工艺
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液 0.5 mL共 6份，分别置于
25 mL量瓶中，按2.3方法进行，RSD为0.37%，表明本
方法精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密称取0.2 g乌苏里瓦韦，按2.4方法进行，分别
于0、2、4、6、8、12 h在上述条件下进样分析。分别计算
绿原酸的含量，RSD=1.1%，结果表明供试品在12 h内
稳定。
2.7 加标回收率试验
精密称取0.1 g乌苏里瓦韦6份，各加入0.2 mL标
准品，在上述条件下分析，计算得平均回收率为
101.35%，RSD=0.1%，故认为用上述方法测定乌苏里
瓦韦中绿原酸含量是可行的。
3 结论与讨论
试验表明利用统计学方法对该模型进行显著性检
验，优化了内在因素水平，找出了最佳工艺条件。经研
究，各因素对绿原酸得率的影响程度依次为提取温度
>液料比>提取时间，提取温度和料液比是影响绿原酸
得率的关键因子，乌苏里瓦韦绿原酸最佳提取工艺条
件为：液料比 25:1，提取时间 4 min，提取温度 96℃，在
这种条件下绿原酸得率可达 5.11%，本研究通过热水
提取乌苏里瓦韦中绿原酸，具有提取时间短，价格低廉
且得率较高等优点，试验结果具有应用价值，通过中心
组合设计试验和响应面优化乌苏里瓦韦绿原酸提取工
艺，确定最佳提取工艺，为乌苏里瓦韦中绿原酸的提取
和分离纯化提供了参考依据。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第二册）[M].上
海:上海科学技术出版社,1999:238.
[2] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志.第6(2)卷[M].
北京:科学出版社.
[3] 李玉山,范鹏辉.杜仲叶中绿原酸提取工艺的优化[J].湖北农业科
学,2012,51(17):3830.
[4] 魏锐,田惠玲,周建军,等.响应面分析法优化杜仲叶中绿原酸水提
工艺[J].安徽农业科学,2011,39(7):3965-3967.
[5] 潘雪峰,李明.山银花叶中绿原酸水提工艺研究[J].中国农学通报,
2013,29(33):302-306.
[6] 吴卫华,康桢,欧阳冬生,等.绿原酸的药理学研究进展[J].天然产物
研究与开发,2006,18:109.
[7] 王丽萍,郭栋,王果,等.中药绿原酸的研究进展[J].时珍国医国药,
2011,22(4):961-963.
[8] 国家药典委员会.中国药典 2000版第一部[M].北京:化学工业出
版社,2005:152-153.
[9] 王丽红,赵龙,刘德江,等.乌苏里瓦韦的性状及显微鉴定[J].中药材,
2013,33(36):394.
[10] Choi Y H, Dm Y H, Yeo H, et al. A flavonoed diglycoside from
Lepisorus ussuriensis[J].Pergamon,1996:1111.
[11] Choi Y H, Kim J, ChoiY H. A steroidal glycoside from Lepisorus
ussuriensis[J].Phytoehemistry,1999,51(3):453.
[12] 肖文平,李娟.金银花中绿原酸的提取和含量测定[J].安徽农业科
学,2011,39(35):21675-21676.
[13] 王丽红,谭凤田,赵宏,等.Box-Behnken响应面分析法优化乌苏里
瓦韦中绿原酸提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2014,17(20):24-
26.
[14] 王丽红,宋琳琳,吴宏斌,等.HPLC法测定乌苏里瓦韦药材中2种活
性成分[J].中成药,2014,36(3):654-657.
[15] 王丽红,赵龙,吴莉莉,等.乌苏里瓦韦不同提取物的抗炎作用研究
[J].安徽农业科学,2013,14(32):12578-12579.
图1 提取温度和时间对绿原酸得率影响
图2 提取温度和液料比对绿原酸得率影响
图3 提取时间和液料比对绿原酸得率影响
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