全 文 ：63※工艺技术 食品科学 2012, Vol. 33, No. 12
响应面法优化碱蒿黄酮提取工艺及其
体外抗氧化作用
刘玉芬，夏海涛
(淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005)
摘 要：用响应面法优化野生碱蒿黄酮类化合物的提取条件，通过羟自由基、超氧阴离子自由基、总还原力及脂
质抗氧化实验测定碱蒿黄酮的体外抗氧化作用，并与抗坏血酸的抗氧化能力进行比较。结果表明提取工艺最佳条件
为：提取温度 80℃、提取时间 1.75h、液料比 27.5:1(mL/g)、提取 2次，该条件下黄酮提取率预测值 3.002%，验
证值 2.996%。对碱蒿黄酮的抗氧化研究表明，碱蒿黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用与抗坏血酸比相对较弱，
但对清除羟自由基、抗脂质体过氧化及还原能力均表现出较好的效果，是一种天然有效的抗氧化剂。
关键词：碱蒿；黄酮；响应面法；抗氧化作用
Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Artemisia anethifolia Web. ex Stechm by
Response Surface Methodology and Evaluation of Their Antioxidant Activity
LIU Yu-fen，XIA Hai-tao
(College of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)
Abstract ：Response surface methodology was employed to optimize the extraction of flavonoids from young stems and leaves
of Artemisia anethifolia Web. ex Stechm. Meanwhile, the antioxidant activity in vitro was evaluated by hydroxyl radical scavenging
assay, superoxide anion radical scavenging assay, total reducing power assay, and anti-lipid peroxidation assay with vitamin C
as the reference. The results indicated that the optimal extraction conditions were extraction temperature of 80 ℃, extraction
time of 1.75 h, material-to-liquid ratio of 1:27.5, and repeated extraction number of 2. Under these extraction conditions, the
predicted and actual values of flavonoids yield were 3.002% and 2.996%, respectively. Artemisia anethifolia Web. ex Stechm
flavonoids revealed a relatively weaker scavenging effect on superoxide anion radicals when compared with vitamin C, but
revealed better scavenging effect on hydroxyl free radicals, stronger inhibitory activity on lipid peroxidation and higher reducing
power. Therefore, Artemisia anethifolia flavonoids are effective natural antioxidants.
Key words：Artemisia anethifolia Web. ex Stechm；flavonoids；response surface methodology；antioxidant activity
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)12-0063-06
收稿日期：2012-01-28
作者简介：刘玉芬(1961—)，女，副教授，学士，主要从事应用化学及天然产物提取研究。E-mail：liu222005@hhit.edu.cn
碱蒿(Artemisia anethifolia Web. ex Stechm) 属菊科，
一年或两年生草本，植株有浓烈的香气。主要生长在
山坡、河谷、盐碱滩地，是蒿属最耐盐碱的专性盐生
植物，也是其他盐生植物群落的主要伴生种[ 1 -2 ]。民间
常用基生叶与幼叶作中药茵陈的代用品入药[3-4]。茵陈具
有清热利湿，利胆退黄，降血压等功效。用于黄疸型
肝炎，胆囊炎，小便不利等症的治疗，此外还具有解
热、镇痛、消炎、降血脂、增强免疫、保护细胞、
抗肿瘤等作用[ 5 -7 ]。目前，对茵陈的化学成分与药效研
究已经较为深入，但对碱蒿的研究未见报道。本实验
利用响应面法对碱蒿黄酮提取条件进行优化，并采用典
型的体外抗氧化体系，以抗坏血酸为对照，研究碱蒿
黄酮的抗氧化作用，为碱蒿的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
碱蒿嫩茎叶采自连云港市墟沟沿海滩涂，洗净在 60
℃于电热恒温鼓风干燥箱中烘干至质量恒定，粉碎过 40
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目筛。用石油醚浸泡去色，重复浸泡至无色，余下的
固体粉末挥发干备用。
芦丁标准品 中国药品生物制品鉴定所；抗坏血
酸、邻苯三酚、水杨酸、硫代巴比妥酸、三羟基氨
基甲烷、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚
铁、乙醇、石油醚、丙酮、氯仿等其他试剂均为分
析纯 上海国药集团试剂公司；大豆卵磷脂 齐齐哈尔
三泰精细化工有限责任公司。
1.2 仪器与设备
UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津公司； RE-
5285A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DHG-9240A
型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司； TDL-
4型台式离心机 上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 碱蒿黄酮提取工艺
工艺流程：碱蒿干粉→ 60%乙醇水溶液提取→离
心→滤液→减压浓缩→提取液定容→测定总黄酮含量。
操作方法：称取碱蒿干粉 5g，置于三口瓶中，按
实验设计条件，加入 60%乙醇提取 2 次，浓缩提取液
并定容，测定黄酮含量。
1.3.2 黄酮定性与含量测定
取样品提取液于试管中，滴加氯化铁溶液，提取
液显墨绿色[8 ]；滴加 NaO H 溶液，提取液显橙红色[ 9]，
这些颜色反应表明提取液中含有黄酮类化合物[8-9]。
以芦丁为标样，按文献[10]方法测定黄酮含量。标
准曲线回归方程为A＝0.0056＋0.02899c(c为芦丁质量浓
度，线性范围为 5～40mg/L，A为吸光度)，R＝ 0.9998。
根据方程可计算黄酮含量。
提取液中黄酮含量
碱蒿黄酮提取率/%＝——————————× 100

原料质量
1.3.3 单因素试验
分别以不同的乙醇体积分数、液料比、提取温
度、提取时间以及提取次数为单因素进行试验，考察
其对碱蒿黄酮提取率的影响。
表 1 响应面优化试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of response surface design
水平
因素
A提取温度/℃ B提取时间/h C液料比(mL/g)
－ 1 60 1 20:1
0 70 2 30:1
1 80 3 40:1
1.3.4 响应面优化试验
在单因素试验基础上，固定乙醇体积分数 60%和提
取次数 2次，选取液料比、提取温度、提取时间为Box-
Behnken设计的自变量，碱蒿黄酮提取率为响应值进行
响应面优化组合。因素水平设计见表 1。
1.3.5 碱蒿黄酮的抗氧化活性测定
将提取液浓缩，烘干，用丙酮、氯仿等溶剂淋洗
后，低温干燥，配成黄酮质量浓度 500mg/L的储备液，
用于抗氧化活性测定。
1.3.5.1 还原力测定[11-12]
取不同质量浓度的样品溶液 1.0mL于 10mL比色管
中，加入 pH6.6磷酸缓冲溶液(200mmol/L) 2.5mL，质量
分数 1%铁氰化钾溶液 2.5mL，混匀后在 50℃水浴中保
温 20 mi n，迅速冷却，加入质量分数 10 % 三氯乙酸
2.5mL，用蒸馏水稀至刻度。以 3000r/min离心 10min，
取上清液 2.5mL，加入质量分数 0.1% FeC13 1.0mL，用
蒸馏水稀至 5mL，10min后于 700nm处测定吸光度，用
蒸馏水作参比，以 VC为对照，吸光度大小表示还原力
强弱。
1.3.5.2 羟自由基清除率测定[13]
在 10mL比色管中依次加入 10mmol/L FeSO4 1.0mL，
10mmol/L水杨酸 -乙醇1.0mL，不同质量浓度的样品溶液
1.0mL，9mmol/L H2O2 1.0mL，于 37℃水浴中反应 30min，
取出用蒸馏水稀至刻度。在 510nm处测定吸光度，以蒸
馏水作参比，V C 为对照，计算羟自由基清除率。

A0－(Ax－Ax0)
清除率 /%＝—————————× 100

A0
式中：A 0 为空白对照液的吸光度；A x 为加入黄酮
溶液后的吸光度；A x0为不加 H 2O 2的黄酮溶液吸光度。
1.3.5.3 超氧阴离子自由基清除率测定[14-15]
在 10mL比色管中加入 pH 8.2 Tr is -HC l缓冲液
(50mmol/L)4.0mL，不同质量浓度的样品溶液 1.0mL，于
25℃水浴中放置 20min，加入25mmol/L 邻苯三酚0.1mL，
混匀于 25℃保温 5min，立即加入 10mol/L HCl溶液 2滴
终止反应，于 325nm处测吸光度。以 Tris-HCl缓冲液
作参比，V C 为对照，计算清除率。

A0－(Ax－Ax0)
清除率 /%＝—————————× 100

A0
式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入黄酮溶
液后的吸光度；A x0为不加邻苯三酚的黄酮溶液吸光度。
1.3.5.4 抗脂质体过氧化活性的测定[16-18]
在 10mL比色管中加入不同质量浓度的样品溶液
1.00mL，卵磷脂溶液 1.0mL，0.4mmol/L FeSO4 1.0mL，
混匀，于 3 7℃水浴中放置 6 0 m i n，再加入三氯乙酸
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(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HC1)混合液2.0mL，100
℃水浴 15min后急速冷却，以 3000r/min离心 10min，取
上清液在波长 532nm处测定吸光度，以蒸馏水作参比，
V C 为对照，计算抑制率。

A0－(Ax－Ax0)
抑制率 /%＝—————————× 100

A0
式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入黄酮溶
液后的吸光度；A x0为不加卵磷脂的黄酮溶液吸光度。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
图 1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of
flavonoids
2.1.1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
准确称取样品 1g，在提取温度 70℃、提取时间 2h、
液料比 30:1条件下，加入不同体积分数的乙醇溶液提取
黄酮 1 次，定容测定吸光度，结果如图 1 所示。在乙
醇体积分数 60%时，黄酮提取率达到最大值，当继续
增加乙醇体积分数，黄酮提取率反而下降。说明乙醇
体积分数过高，一些醇溶性和脂溶性物质溶出量增多，
导致黄酮类化合物溶出率下降，故乙醇体积分数选择
6 0 % 为宜。
图 2 提取时间对黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids
2.1.2 提取时间对黄酮提取率的影响
在其他条件与上述相同情况下，选择乙醇体积分数
为 60 %，考察不同提取时间对黄酮提取率的影响，结
果如图 2 所示。黄酮提取率随提取时间的增加而增大，
2h达到最大值，继续增加提取时间，黄酮提取率下降。
因为提取时间过长，醇溶性物质溶出率增加，部分黄
酮可能被氧化使黄酮提取率下降。因此，提取时间选
2 h 为宜。
2.1.3 提取温度对黄酮提取率的影响
在其他条件与上述相同情况下，考察不同提取温度
对黄酮提取率的影响，结果如图 3所示。黄酮提取率随
提取温度的上升而增加，70℃达到最大值。高于 80℃
后，黄酮提取率明显下降。温度过高，黄酮类物质的
化学结构受到破坏，同时杂质的溶出量增加，阻碍黄
酮类物质的溶出。因此，提取温度选 7 0℃为宜。
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
乙醇体积分数 /%
40 50 60 70 80
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
提取时间 /h
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
图 3 提取温度对黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
提取温度 /℃
50 60 70 80 90
2.1.4 液料比对黄酮提取率的影响
在其他条件与上述相同情况下，考察不同液料比对
黄酮提取率的影响，结果如图 4所示。黄酮提取率随着
液料比的增加而上升，在液料比超过 30:1后，黄酮提取
率略有下降。溶剂用量少，黄酮溶出量小，提取不完
全，溶剂用量过大，杂质溶解增加，且成本也增加，
综合考虑经济因素和后续工艺的简化，液料比 30:1为宜。
图 4 液料比对黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of flavonoids
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
液料比(mL/g)
10:1 20:1 30:1 40:1
2012, Vol. 33, No. 12 食品科学 ※工艺技术66
2.1.5 提取次数对黄酮提取率的影响
在提取条件相同下，考察重复提取次数对黄酮提取
率的影响，结果见图 5。随提取次数的增加，黄酮提
取率明显下降，说明碱蒿中残留的黄酮类物质已经很
少，再增加提取次数已无意义，因此，从减少操作环
节，节约成本考虑，黄酮重复提取 2 次为宜。
2.2 响应面试验结果
响应面试验优化碱蒿黄酮提取条件的结果见表 2。
将所得的试验数据采用Design Expert软件进行多元回归
拟合，得到碱蒿黄酮提取率对提取温度(A )、提取时间
(B)和液料比 C 的二次多项回归方程：
黄酮提取率 /%＝ 2.8407＋ 0.2565A－ 0.0081B－
0.0615C－0.1498AB－0.0470AC－0.1186BC－0.1295A2－
0.2408B2－0.1659C2
试验号 A提取温度 B提取时间 C 液料比 黄酮提取率 /%
1 0 0 0 2.8042
2 0 0 0 2.7998
3 0 － 1 － 1 2.3911
4 0 － 1 1 2.4884
5 0 0 0 2.8448
6 0 0 0 2.8977
7 0 1 1 2.2397
8 1 1 0 2.5696
9 － 1 0 － 1 2.2977
10 － 1 － 1 0 2.0716
11 － 1 0 1 2.2858
12 1 － 1 0 2.8901
13 0 0 0 2.8568
14 － 1 1 0 2.3504
15 0 1 － 1 2.6168
16 1 0 － 1 2.8989
17 1 0 1 2.6989
表 2 黄酮提取响应面试验设计方案及结果
Table 2 Response surface design arrangement and experimental results
能用此方程解释，所以可用此模型对碱蒿黄酮的提取进
行分析和预测。由回归模型的方差分析看，除方程一
次项 B和交互项 AC外，其他项对黄酮提取率的影响均
达极显著水平。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 1.1886 9 0.1321 128.0695 ＜ 0.0001
A 0.5263 1 0.5263 510.404 ＜ 0.0001
B 0.0005 1 0.0005 0.5074 0.4993
C 0.0303 1 0.0303 29.3062 0.0010
AB 0.0898 1 0.0898 87.0719 ＜ 0.0001
AC 0.0088 1 0.0088 8.5776 0.0221
BC 0.0563 1 0.0563 54.5605 0.0002
A2 0.0706 1 0.0706 68.4264 ＜ 0.0001
B2 0.2441 1 0.2441 236.7154 ＜ 0.0001
C2 0.1159 1 0.1159 112.3502 ＜ 0.0001
残差 0.0072 7 0.0010
失拟项 0.0007 3 0.0002 0.1406 0.9306
纯误差 0.0065 4 0.0016
总变异 1.1958 16
R2=0.9940 R2Adj=0.9862 CV=1.24%
表 3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis for the established regression model
注：P ＜ 0 . 0 5，差异显著；P ＜ 0 . 0 1，差异极显著。
由回归模型的响应面图(图 6)可以看出，黄酮提取
率随着各两因素的增加先呈上升趋势，当各两因素达到
某一水平时，黄酮提取率增加缓慢，随后下降。等高
线的形状可反映交互作用的强弱大小，椭圆形表示两因
素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图 6 可见，
各两因素交互作用的等高线均呈椭圆形，表明各两因素
之间有明显的交互作用，影响显著。沿提取温度轴向
等高线相对密集，表明提取温度对黄酮提取率的影响比
时间和液料比大。
通过软件Design-Expert求解回归方程，得到碱蒿
黄酮的最佳提取工艺条件为提取温度 80℃、提取时间
1.70～1.81h、液料比 27.31～27.83:1(mL/g)，碱蒿黄酮提
取率可达 3.002%。考虑实际操作，将实验条件修改为
提取温度 80℃、提取时间 1.75h、液料比 27.5:1(mL/g)。
在此条件下用 60%乙醇提取 2次进行 3组平行实验，测
定实际提取率为 2 .996%，与预测值相近，偏差较小。
说明回归方程能较真实地反映各因素对碱蒿黄酮提取率
的影响，证明该模型用于优化筛选碱蒿黄酮提取工艺是
可行的。
图 5 提取次数对对黄酮提取率的影响
Fig.5 Effect of repeated extraction number on extraction rate of
flavonoids
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
提取次数
1 2 3
由表 3回归模型方差分析可知，模型P＜ 0.0001，表
明响应回归模型达到了极显著水平，失拟项P＝ 0.9306＞
0.05，不显著。模型的校正确定系数 R2和修正相关系数
R2Adj表明该模型拟合程度较好，总变异中只有 1.38%不 a.温度和时间
3.2
2.6
2.0
黄
酮
提
取
率
/%
B：时间
1
0
－1
1
0
－1 A：
温度
67※工艺技术 食品科学 2012, Vol. 33, No. 12
2.3 体外抗氧化试验结果
2.3.1 碱蒿黄酮的还原力
随着黄酮质量浓度的增加，对羟自由基的清除效果增
强。根据线性回归方程可以得到碱蒿黄酮清除羟基自由
基的 IC50为 208μg/mL，而VC的 IC50为 268μg/mL，说
明碱蒿黄酮具有较强的清除羟自由基的能力，其作用比
V C 更强。
b.液料比和温度
3.2
2.6
2.0黄
酮
提
取
率
/%
C：液料比
1
－1
1
0
－1
A：
温度
0
c.液料比和时间
固定水平：提取温度 70℃；提取时间 2h；液料比 30:1(m L/g)。
图 6 各两因素交互作用对黄酮提取率影响的响应面图
Fig.6 Response surface plot for the effects of extraction parameters on
extraction rate of flavonoids
3.2
2.6
2.0
黄
酮
提
取
率
/%
C：液料比
1
－1
1
0
－1 B ：
时间
0
图 7 碱蒿黄酮的还原力
Fig.7 Reducing power of flavonoids from Artemisia anethifolia
Web. ex Stechm
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
碱蒿黄酮
VC
吸
光
度
质量浓度 /(μg/mL)
0 15 30 45 60
一种物质的还原能力与其抗氧化能力之间有着密切
的关系，还原力越强，抗氧化性越强[19 ]。由图 7可知，
在实验质量浓度范围内，碱蒿黄酮的还原力随其质量浓
度的增加而增大，且还原力与质量浓度呈线性关系，与
同质量浓度 VC相比，还原力效果相当，说明碱蒿黄酮
对 Fe 3+具有较好的还原作用。
2.3.2 羟自由基清除能力
羟基自由基是最强的氧化剂，在生物体内几乎可以
和所有细胞成分发生反应，对机体危害很大。由图 8可
知，在测定范围内碱蒿黄酮具有清除羟自由基的作用，
图 8 碱蒿黄酮对羟自由基的清除率
Fig.8 Scavenging effect of flavonoids from Artemisia anethifolia Web.
ex Stechm on hydroxyl free radicals
80
60
40
20
清
除
率
/%
质量浓度 /(μg/mL)
0 100 200 300 400
碱蒿黄酮
VC
2.3.3 超氧阴离子自由基清除能力
图 9 碱蒿黄酮对超氧阴离子自由基的清除率
Fig.9 Scavenging effect of flavonoids from Artemisia anethifolia Web.
ex Stechm on superoxide anion free radicals
100
80
60
40
20
0
碱蒿黄酮
VC
清
除
率
/%
质量浓度/(μg/mL)
0 50 100 150 200 250
从图 9 可知，在所选质量浓度范围内，碱蒿黄酮
具有清除超氧阴离子自由基的能力。随着碱蒿黄酮质量
浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用增强，呈
现量效关系。碱蒿黄酮的 IC50为 256μg/mL，VC的 IC50
为 108μg/mL，由此可见碱蒿黄酮对超氧阴离子自由基
的清除作用低于VC。在碱蒿黄酮质量浓度小于 50μg/mL
时，与 VC清除超氧阴离子自由基的能力相比，差别不
是很大，但是随着质量浓度的增大，VC 对超氧阴离子
自由基的清除能力明显强于碱蒿黄酮，质量浓度越大，
差别越显著。
2.3.4 抗脂质体过氧化能力
脂质过氧化损伤与许多疾病的发生有关，如肿瘤、
衰老、心脑血管、自身免疫疾病等。由图 10可知，碱
蒿黄酮质量对 Fe2+引发的卵磷脂脂质体过氧化有抑制作
2012, Vol. 33, No. 12 食品科学 ※工艺技术68
用，随着黄酮质量浓度的增加抑制率增强。其 IC 50 为
135μg/mL，具有较强的抗脂质体过氧化能力。在实验
质量浓度范围内，未测出 VC 有抗脂质体过氧化能力，
可能 VC属于水溶性极性物质，在乳化脂质体系中主要
集中在水相，从而影响其抑制作用[ 1 7 ]。
3 结 论
3.1 利用响应面法优化碱蒿黄酮的提取率，得到的最佳
提取工艺修正条件为提取温度 80℃、提取时间 1.75h、液
料比 27.5:1(mL/g)。在此条件下的黄酮提取率为 2.996%，
与预测值相差较小，说明Box-Behnken设计法得到的模
型拟合程度高，准确有效，用于碱蒿黄酮提取工艺的
优化筛选是可行的。
3.2 体外抗氧化试验结果表明，碱蒿黄酮具有较强的
还原力，与同质量浓度 V C 的还原力效果相当。
3.3 在不同的抗氧化体系中碱蒿黄酮对不同的自由基表
现出不同的清除能力，总体上表现为抗脂质体过氧化能
力＞羟自由基清除能力＞超氧阴离子自由基清除能力，
且在一定浓度范围内呈现量效关系，这可能与碱蒿黄酮
对不同自由基的敏感性有关。
3.4 与同质量浓度VC相比，碱蒿黄酮的抗脂质体过氧
化能力和羟自由基清除能力更强，而超氧自由基清除能
力较弱。
实验中所用的碱蒿黄酮未进一步纯化，经过纯化
后，其抗氧化活性会进一步提高。由此可见，碱蒿黄
酮是一种很好的天然抗氧化剂，具有广泛的应用前景
和开发价值。在目前一些人工合成抗氧化剂存在不安
全、有毒性等问题下，天然抗氧化剂会越来越受到人
们的关注。
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图 10 碱蒿黄酮抗脂质体过氧化能力
Fig.10 Inhibitory effect of flavonoids from Artemisia anethifolia
Web. ex Stechm on lipid peroxidation
70
60
50
40
抑
制
率
/%
质量浓度/(μg/mL)
100 200 300 400