全 文 :第41卷 第6期 西 南 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 2016年6月
Vol.41 No.6 Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition) Jun.2016
DOI:10.13718/j.cnki.xsxb.2016.06.013
响应面法优化藏药毛莲蒿总香豆素的
超声辅助提取工艺
①
杨正明1, 滕 云1, 韩亚涛1, 李 波1, 王景富1, 刘 圆2
1.西南民族大学 化学与环境保护工程学院,成都610041;2.西南民族大学 民族医药研究院,成都610041
摘要:通过单因素实验法考察乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度、料液比及超声时间对毛莲蒿总香豆素得率的影
响,并通过Box-Behnken试验设计优化毛莲蒿总香豆素的超声辅助提取工艺.结果表明,毛莲蒿总香豆素的最佳提
取工艺为乙醇体积分数72%,浸提时间71min,浸提温度68℃,料液比1∶58(g/mL)及超声时间30min,在该条
件下毛莲蒿总香豆素的平均得率为3.45%.优化后的提取工艺方便、可行,可为毛莲蒿中总香豆素类化合物的提
取提供参考.
关 键 词:毛莲蒿;总香豆素;响应面法;超声波辅助;提取工艺
中图分类号:R931 文献标志码:A 文章编号:1000-5471(2016)06-0074-07
毛莲蒿(Artemisia vestita Wal.)为菊科蒿属植物,藏药名普尔那,是西藏自治区藏药厂生产的结血蒿
膏的主要组成源药材[1-2],具有极高的药用价值[3-6],是作为防治瘟疫、止血以及抗炎消肿等的常用藏药材
之一[7].课题组前期研究表明,毛莲蒿中含有黄酮类、有机酸、香豆素、生物碱、挥发油及油脂、甾体或三
萜类等化学成分[8].其中,香豆素类化合物具有抗艾滋病、抗癌、抗氧化、抗炎及平滑肌松弛等多方面的生
物活性[9-10],但毛莲蒿中总香豆素的研究却鲜有报道,伞形花内酯为香豆素类化合物,因此,本文拟采用
热浸-超声辅助的提取方法,以伞形花内酯为对照品,通过响应面法优化出最佳提取工艺,以期为藏民族
药用植物毛莲蒿资源的进一步开发和利用提供一定的实验指导和理论依据.
1 仪器与材料
TU-1950型双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;KQ-250B超声波清洗器,
昆山市超声仪器有限公司;ESJ200-4电子天平,沈阳龙腾电子有限公司;HH-2数显恒温水浴锅,国华电
器有限公司;HX-200型高速中药粉碎机,浙江永康溪岸五金药具厂.
毛莲蒿药材于2013年11月6日购于西藏藏药厂,经西南民族大学刘圆教授鉴定为菊科蒿属植物毛莲
蒿的地上部分,粉碎,过3号筛,备用;伞形花内酯对照品(批号:MUST-14031012,成都曼斯特生物有限
公司);水为纯净水;无水乙醇为分析纯.
① 收稿日期:2015-06-23
基金项目:国家自然科学基金项目(81173653);四川省应用基础计划项目(2014JY0181);西南民族大学研究生学位点建设项目
(2015XWD-S0703).
作者简介:杨正明(1990-),男,云南丽江人,硕士研究生,主要从事少数民族药物的研究.
通信作者:刘 圆,博士,教授.
2 方法与结果
2.1 毛莲蒿总香豆素质量分数测定
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取3.3mg的伞形花内酯对照品,用无水乙醇定容至25mL,摇匀,即得0.132g/mL的伞形花
内酯对照品溶液.
2.1.2 线性关系的考察
精确量取0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45,0.50,0.55mL对照品溶液,精确加入无水乙醇至
9mL,摇匀,以无水乙醇作对照,于325nm处测定其吸光度.以伞形花内酯质量浓度(C)为横坐标,吸光
度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程为A=91.636 C+0.043 7,R2=0.999 7,表明伞形花
内酯对照品溶液在2.20~8.07μg/mL范围内与吸光度呈较好的线性关系.
2.1.3 毛莲蒿总香豆素的提取及质量分数测定
称取0.5g毛莲蒿药材粉末,精密称定,加入一定体积分数的乙醇,在设定的试验条件下按一定的浸
提时间、浸提温度、料液比和超声时间,超声辅助提取.过滤,并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶
中,摇匀,即得毛莲蒿总香豆素提取液.取0.2mL于10mL比色管中,精确加入无水乙醇至9mL,混匀,
以无水乙醇做空白对照,于325nm处测定其吸光度,由回归方程计算总香豆素的质量分数.
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度试验
精密量取6份2.1.1对照品溶液0.35mL,按2.1.2方法于325nm处测定A,计算相对标准偏差
(RSD)为0.84%,表明仪器精密度好.
2.2.2 重复性试验
取6份0.50g毛莲蒿药材粉末,精密称定,按2.1.3方法制备供试品溶液,按2.1.2方法于325nm处
测定A,计算RSD为1.14%,表明本方法重复性较好.
2.2.3 稳定性试验
取同一供试品溶液,按2.1.2方法于325nm 处测定A,每隔2h(n=6)测定1次,计算RSD 为
1.12%,表明在12h内稳定性良好.
2.2.4 加样回收率试验
取6份50mg毛莲蒿药材粉末,精密称定,加入适量的伞形花内酯对照品,按2.1.3方法制备供试品
溶液,按2.1.2方法于325nm处测定A,计算平均回收率为99.18%,RSD 为1.48%,表明该方法准确
可靠.
2.3 单因素试验
以乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度、料液比及超声时间5个因素进行单因素试验,确定影响毛莲
蒿总香豆素得率的适宜单因素条件.
2.3.1 乙醇体积分数对毛莲蒿总香豆素得率的影响
称取5份0.5g毛莲蒿药材粉末,精密称定,分别加入不同体积分数的乙醇20mL,60℃水浴加热
30min,再超声提取20min.过滤,并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶中,摇匀,按2.1.3测定总
香豆素得率,结果见图1.
如图1可知,总香豆素得率随乙醇体积分数的增大呈先升高后降低的趋势.当乙醇体积分数为60%
时,得率达到最大,随着乙醇体积分数的继续增大,总香豆素得率反而降低,可能是乙醇体积分数的增大,
增加了脂溶性物质的溶出量,同时溶剂极性的降低,导致香豆素类化合物的溶解度降低等原因[11].因此,
确定适宜乙醇体积分数为60%.
2.3.2 浸提时间对毛莲蒿总香豆素得率的影响
称取6份0.5g毛莲蒿药材粉末,精密称定,分别加入60%乙醇20mL,60℃水浴加热15,30,45,60,
75,90min,再超声提取20min.过滤,并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶中,摇匀,按2.1.3测
57第6期 杨正明,等:响应面法优化藏药毛莲蒿总香豆素的超声辅助提取工艺
定总香豆素得率.结果见图2.
由图2可以看出,随着浸提时间的增加,总香豆素得率逐渐增大.浸提60min时,总香豆素得率最大,
超过60min后,总香豆素得率呈下降趋势.因此,确定适宜浸提时间为60min.
图1 乙醇体积分数对毛莲蒿总香豆素得率的影响 图2 浸提时间对毛莲蒿总香豆素得率的影响
2.3.3 浸提温度对毛莲蒿总香豆素得率的影响
称取5份0.5g毛莲蒿药材粉末,精密称定,分别加入60%乙醇20mL,于50,60,70,80,90℃水浴加
热60min,再超声提取20min.过滤,并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶中,摇匀,按2.1.3测定
总香豆素得率.结果见图3.
由图3可知,浸提温度为60℃时,总香豆素得率最高,随着温度的增加,总香豆素得率反而降低,可
能是由于温度过高,使部分香豆素升华或分解,亦或是温度达到溶剂沸点以后,造成溶剂的损失,从而使
得率降低[12-13].因此,确定适宜浸提温度为60℃.
2.3.4 料液比对毛莲蒿总香豆素得率的影响
称取5份0.5g毛莲蒿药材粉末,精密称定,分别加入不同体积的60%乙醇,于60℃水浴加热
60min,再超声提取20min.过滤,并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶中,摇匀,按2.1.3测定总
香豆素得率.结果见图4.
由图4可见,料液比为1∶40(g/mL)时,总香豆素得率最高,超过1∶40(g/mL)时,得率降低,可能
是由于料液比过大,增加了超声波破碎细胞的阻力,使得细胞破碎程度降低,从而使有效成分的得率降
低[14].因此,确定适宜料液比为1∶40(g/mL).
图3 浸提温度对毛莲蒿总香豆素得率的影响 图4 料液比对毛莲蒿总香豆素得率的影响
2.3.5 超声时间对毛莲蒿总香豆素得率的影响
称取5份0.5g毛莲蒿药材粉末,精密称定,分别加入60%乙醇20mL,于60℃水浴加热60min,再
超声提取10,20,30,40,50min.过滤,并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶中,摇匀,按2.1.3测
定总香豆素得率.结果见图5.
67 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.edu.cn 第41卷
图5 超声时间对毛莲蒿总香豆素得率的影响
如图5所示,随着超声时间的延长,总香豆素
得率先增加再减少,以超声30min为得率最大.
超过30min后,得率降低,这可能是超声波具有
机械剪切作用,长时间的作用破坏了香豆素的结
构,使得后处理过程中,香豆素损失而影响得
率[15].因此,确定适宜超声时间为30min.
2.4 响应面法优化提取工艺
根据单因素试验结果,选取乙醇体积分数、浸
提时间、浸提温度和料液比4个因素,采用3水平
4因素的Box-Behnken响应面试验设计,优选总香
豆素的最佳提取工艺.响应面分析因素与水平设
计见表1,试验设计与结果见表2.
表1 响应面分析因素与水平表
水平
因 素
乙醇体积分数A/% 浸提时间B/h 浸提温度C/℃ 料液比D/(g·mL-1)
-1 60 45 60 1∶40
0 70 60 70 1∶50
1 80 75 80 1∶60
表2 响应面试验设计与结果
试验号 乙醇体积分数 浸提时间 浸提温度 料液比 总香豆素得率/%
1 1 0 0 -1 3.07
2 1 0 1 0 3.25
3 0 0 0 0 3.41
4 0 0 -1 1 3.36
5 -1 0 -1 0 3.23
6 0 -1 -1 0 3.26
7 -1 1 0 0 3.22
8 0 0 1 1 3.33
9 0 0 -1 -1 3.21
10 0 1 0 -1 3.12
11 0 0 0 0 3.45
12 -1 -1 0 0 3.28
13 0 0 0 0 3.42
14 -1 0 0 1 3.26
15 -1 0 0 -1 3.14
16 1 1 0 0 3.34
17 0 -1 1 0 3.27
18 1 -1 0 0 3.14
19 0 -1 0 1 3.34
20 0 1 0 1 3.43
21 1 0 -1 0 3.19
22 0 0 0 0 3.43
23 0 1 1 0 3.23
24 0 0 1 -1 3.14
25 1 0 0 1 3.30
26 0 0 0 0 3.42
27 -1 0 1 0 3.20
28 0 1 -1 0 3.35
29 0 -1 0 -1 3.27
77第6期 杨正明,等:响应面法优化藏药毛莲蒿总香豆素的超声辅助提取工艺
2.5 响应面分析
根据表2中的实验数据,采用Design-Expert V8.0.5b软件对其进行数据分析,得到的总香豆素得率
R对乙醇体积分数(A)、浸提时间(B)、浸提温度(C)和料液比(D)的回归方程为
R=-6.035 17+0.129 78 A-0.005 733 33 B+0.106 37 C+0.047 5 D+0.000 433 333 AB+0.000 225 AC+
0.000 275 AD-0.000 216 667 BC+0.000 4 BD+0.000 1 CD-0.001 325 83 A2-0.000 239 259 B2-
0.000 825 833 C2-0.000 888 333 D2
方程回归分析及方差分析结果见表3.由表3可知,选用的模型P<0.000 1,具有统计学意义;失拟项
无统计学意义(P=0.081 3>0.05),并且模型的R2=0.963 9,R2adj=0.927 8,表明模型拟合度良好,可用
来分析和预测毛莲蒿总香豆素的得率;料液比(D)对毛莲蒿总香豆素的得率影响有统计学意义(P<0.000 1),
二次项A2,B2,C2 和D2 影响有统计学意义(P<0.01);交互项AB和BD 影响有统计学意义(P<0.01),
BC影响有统计学意义(P<0.05),影响大小排列依次为AB,BD,BC,AD,AC和CD,交互作用对毛莲蒿
总香豆素得率影响见图6.
表3 回归模型方差分析
来源 平方和 自由度 均方 F值 P>F 显著性
模型 0.3 14 0.021 26.7 <0.000 1 ***
乙醇体积分数A 1.33E-04 1 1.33E-04 0.17 0.689
浸提时间B 1.41E-03 1 1.41E-03 1.76 0.205 4
浸提温度C 2.70E-03 1 2.70E-03 3.38 0.087 2
料液比D 0.095 1 0.095 119.49 <0.0001 ***
AB 0.017 1 0.017 21.17 0.000 4 ***
AC 2.03E-03 1 2.03E-03 2.54 0.133 6
AD 3.03E-03 1 3.03E-03 3.79 0.072
BC 4.23E-03 1 4.23E-03 5.29 0.037 3 *
BD 0.014 1 0.014 18.03 0.0008 ***
CD 4.00E-04 1 4.00E-04 0.5 0.490 7
A2 0.11 1 0.11 142.8 <0.0001 ***
B2 0.019 1 0.019 23.54 0.000 3 ***
C2 0.044 1 0.044 55.4 <0.000 1 ***
D2 0.051 1 0.051 64.11 <0.000 1 ***
残差 0.011 14 7.99E-04
失拟项 0.01 10 1.03E-03 4.46 0.081 3
误差 9.20E-04 4 2.30E-04
总和 0.31 28
校正系数 R2=0.963 9;R2adj=0.927 8
注:***表示差异有统计学意义,P<0.001,*表示差异有统计学意义,P<0.05.
2.6 验证试验
采用Design-Expert V8.0.5b软件分析,得到毛莲蒿总香豆素最佳超声辅助提取工艺为乙醇体积分数
72.29%,浸提时间70.73min,浸提温度68.46℃,料液比1∶57.71(g/mL),超声时间30min,得率为
3.46%.
为验证响应面法的可靠性,同时考虑到实际操作的可行性,将工艺条件修正为乙醇体积分数72%,浸
提时间71min,浸提温度68℃,料液比1∶58(g/mL),超声时间30min.采用上述优化条件进行3次验证
试验,毛莲蒿总香豆素得率实测值为3.45%,与理论预测值的相对偏差为0.29%,与理论预测值基本
一致.
2.7 毛莲蒿中总香豆素质量分数测定
分别取6份毛莲蒿药材样品,按优化得到的最佳工艺制备供试品溶液,依法进行测定,结果测得6份
样品中总香豆素平均质量分数为34.65mg/g,RSD低于2% ,表明该提取工艺及质量分数测定方法稳定
可行,质量分数测定结果见表4.
87 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.edu.cn 第41卷
图6 各因素两两交互作用对毛莲蒿总香豆素得率影响的响应面图
表4 毛莲蒿中总香豆素质量分数测定结果
序号
总香豆素质量分数/
(mg·g-1)
平均质量分数/
(mg·g-1)
RSD/%
1 34.65
2 34.36
3 34.82
4 34.28
5 34.46
6 35.35
34.65 1.14
3 讨 论
本文采用热浸-超声辅助提取法提取毛莲蒿中的总香豆素类成分,通过单因素试验设计,并在此基础上
运用3水平4因素响应面法优化总香豆素的提取工艺.结果表明,料液比对总香豆素得率的影响有统计学意
义,确定最佳提取工艺为乙醇体积分数72%,浸提时间71min,浸提温度68℃,料液比1∶58(g/mL),超声
时间为30min,测定毛莲蒿中总香豆素质量分数达到34.65mg/g.
97第6期 杨正明,等:响应面法优化藏药毛莲蒿总香豆素的超声辅助提取工艺
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On Optimization of Ultrasonic Extraction Conditions of
Total Coumarins from Tibetan Medicine Artemisia Vestita
Wal.by Response Surface Methodology
YANG Zheng-ming1, TENG Yun1, HAN Ya-tao1,
LI Bo1, WANG Jing-fu1, LIU Yuan2
1.School of Chemistry and Environmental Protection Engineering,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;
2.Ethnic Medicine Institute,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China
Abstract:The effects of ethanol concentration,extraction time,extraction temperature,ratio of solid to
liquid and ultrasonic time in extraction procedure on the extraction rate of total coumarins in Artemisia ves-
tita Wal have beenresearched by single factor experiment,and the Box-Behnken experimental design has
beenused to optimize the extraction of total coumarins in A.vestita Wal.Results show that the optimum
extraction conditions are as folows:72%ethanol,extraction time 71min,extraction temperature 68℃,
ratio of solid to liquid 1∶58(g/mL)and ultrasonic time 30min.Under the conditions,the average extrac-
tion yield of total coumarins reaches 3.45%.The optimized method is convenient and feasible,which can
provide reference for the extraction of total coumarins fromA.vestita Wal.
Key words:Artemisia vestita Wal.;total coumarins;response surface methodology;ultrasonic extrac-
tion;extraction techniques
责任编辑 周仁惠
08 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.edu.cn 第41卷