全 文 ：方案中更具有成本-效果性。
本研究中噻托溴铵组与异丙托溴铵组在每个状
态下概率的变化趋势基本相同。轻度 COPD健康状
态下的概率逐年升高。这说明 2 组的治疗都是有效
的，而噻托溴铵的治疗效果更加显著，在设定的 5 年
内可达到94． 79%，这与国内外大多数噻托溴铵与异
丙托溴铵的临床试验研究结果是一致的。
4 讨论
5 年内 COPD患者噻托溴铵与异丙托溴铵的治
疗方案对比，得到的生命质量调整年较高，所需成本
更低。噻托溴铵作为 COPD 治疗用药更具有成本-
效果性。本课题对于噻托溴铵与异丙托溴铵治疗
COPD的经济学评价分析在国内尚属首次，同时将
药物经济学与国计民生相结合，为政府和老百姓提
供直接的经济学数据，以期能够为临床治疗 COPD
的合理用药提供经济学评价支持，为国内研究
Markov模型在慢性疾病治疗中的成本-效果分析提
供经验。
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［收稿日期］2014-08-21
［基金项目］国家自然科学基金(编号:81402833) ;山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(编号:BS2009SW041) ［作者简介］刘玉红，女，
博士，副教授，研究方向:天然药物活性成分与质量控制，电话:0531-89628173，E-mail:liuyuhongwu@ 126． com ［通讯作者］刘玉国，男，硕士，
副主任药师，研究方向:抗肿瘤药物，电话:0531-67626285，E-mail:lyg7373007373@ 163． com
茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯的体内抗肿瘤作用与机制
刘玉红1，张文玉2，刘玉国3 (1． 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;2． 山东中医药大学教务处，山东 济南
250355;3．山东省肿瘤医院药学部，山东 济南 250117)
［摘要］ 目的:探讨茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯(PＲP-S)的体内抗肿瘤作用与机制。方法:建立小鼠 H22 实体瘤模型，分别
给于高低剂量 PＲP-S，测定小鼠肿瘤生长抑制率、脾脏指数和胸腺指数;采用免疫组织化学法测定肿瘤组织中 Bax、Bcl-2 和 bF-
GF蛋白表达;酶联免疫吸附实验法测定小鼠血清肿瘤坏死因子 TNF-α的含量。结果:PＲP-S10 和 PＲP-S16 在高剂量时对小鼠
肿瘤的抑制率分别为54． 6%和60． 6%，与模型组比较有极显著性差异(P ＜ 0． 01) ;并且对荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数没
有明显影响;PＲP-S10 和 PＲP-S16 均可以上调肿瘤组织中的促凋亡基因 Bax、下调凋亡抑制基因 Bcl-2 的蛋白表达;PＲP-S实验
组小鼠血清 TNF-α的含量显著高于模型组小鼠(P ＜ 0． 01) ;PＲP-S 可以显著降低肿瘤组织中 bFGF 水平(P ＜ 0． 01)。结论:
PＲP-S在抑制肿瘤的同时，免疫损伤不良反应小;其机制除促进细胞凋亡和肿瘤细胞坏死之外，还可能与抑制肿瘤的血管生成
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作用有关。
［关键词］ 茶藨子木层孔菌多糖;硫酸酯;抗肿瘤;机制
［中图分类号］Ｒ363 ［文献标识码］A ［文章编号］1001-5213(2015)11-0985-05 DOI:10． 13286 / j． cnki． chinhosppharmacyj． 2015． 11． 04
Study on antitumor activity in vivo and mechanisms of Phellinus ribis polysaccharide sulfates
LIU Yu-hong1，ZHANG Wen-yu2，LIU Yu-guo3(1． School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University of Traditional Chi-
nese Medicine，Shandong Jinan 250355，China;2． Office of Teaching Affairs，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，
Shandong Jinan 250355，China;3． Department of Pharmacy，Shandong Tumor Hospital，Shandong Jinan 250117，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To study antitumor activity and mechanisms of Phellinus ribis polysaccharide sulfates (PＲP-S)in vivo．
METHODS H22 tumor-bearing mice models were established and were given two doses of PＲP-S． The tumor growth inhibition rate，
spleen index and thymus index were calculated． Bcl-2，Bax and bFGF in the tumor were measured by immunohistochemistry． Serum
TNF-α was determined by ELISA． ＲESULTS Tumor inhibition rates of high-dose PＲP-S10 and PＲP-S16 were 54． 6% and 60． 6%，
respectively，significantly different compared with model group (P ＜ 0． 01)． PＲP-S had no obvious influences on spleen index or thy-
mus index． PＲP-S could up-regulate protein expression of Bax and down-regulate Bcl-2 in tumor． Serum TNF-α from PＲP-S-treated
mice increased significantly compared with model group (P ＜ 0． 01)． Additionally，PＲP-S could significantly reduce the level of bFGF
(P ＜ 0． 01)． CONCLUSION PＲP-S can inhibit growth of tumor in mice，without obvious immune damage． Except for promoting
tumor cell apoptosis and necrosis，the antitumoral mechanisms of PＲP-S are related to inhibiting angiogenesis of tumor．
KEY WOＲDS:Phellinus ribis polysaccharide;sulfates;antitumor activity;mechanisms
茶藨子木层孔菌(Phellinus ribis)是一种具有抗
肿瘤作用的药用真菌［1-3］。前期研究中，我们从中分
离获得一个结构新颖的葡聚糖(PＲP)［4］并进行了硫
酸化修饰制备得到了茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯
(PＲP-S)。研究表明，经硫酸化修饰后，PＲP-S的体外
抗肿瘤活性显著提高，在实验范围内，其活性与硫酸
根取代度成正比［5］。选取 2 个高硫酸根取代度的
PＲP-S进一步的体内抗肿瘤实验研究，发现高取代
的 PＲP-S22 比低硫酸化的 PＲP-S18 抑瘤率低，说明
PＲP-S体内抗肿瘤活性的发挥需要一个合适的硫酸
根取代度［6］。因此，本文通过建立肝癌 H22 荷瘤小
鼠模型，研究了另外 2个低硫酸根取代的 PＲP-S10 和
PＲP-S16的体内抗肿瘤作用，以确定活性最佳的
PＲP-S，为后续深入的作用机制探讨打下基础。
细胞凋亡是研究抗癌药物对肿瘤治疗敏感性非
常重要的一项指标，其中 Bcl-2 和 Bax 分别是抑制
凋亡和促进凋亡基因，在肿瘤的发生发展、化疗敏感
性等方面均起着重要调控作用［7-9］。碱性成纤维细
胞生长因子(bFGF)可以促进血管生成，从而在肿瘤
生长和转移中起着重要促进作用［10］。另外，小鼠外
周血肿瘤坏死因子(TNF-α)作为吞噬细胞产生的一
种多肽，可以通过多条途径杀伤肿瘤细胞［11］。因
此，本文通过免疫组化实验考察了 PＲP-S 对小鼠肿
瘤组织中 Bax、Bcl-2 和 bFGF蛋白表达的影响，并测
定了血清肿瘤坏死因子 TNF-α 水平，以探讨 PＲP-S
抗肿瘤作用可能的机制。
1 材料
1． 1 动物及瘤株 BALB /c 小鼠，雌性，清洁级，体
质量 18 ～ 20 g，由山东大学实验中心提供(动物生产
许可证号:SCXK 鲁 20030004) ;H22 肉瘤小鼠引自
山东省医学科学院。动物饲养条件:自由饮水摄食，
温度 21 ～ 23 ℃，相对湿度 45% ～55%，12 h明 /12 h
暗。
1． 2 试药与仪器 注射用环磷酰胺(CTX，江苏恒
瑞医药股份有限公司，批号 12052725，含量:
100%) ;Bax、Bcl-2、bFGF 抗体(北京中杉金桥生物
技术有限公司) ;小鼠 TNF-α 试剂盒(美国 Ｒ ＆
DSystems公司) ;茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯 PＲP-
S10(硫取代度1． 0)和 PＲP-S16(硫取代度 1． 6) ，参
照文献［5］方法自制。Bio-Ｒad 680 酶标仪(美国
Bio-Ｒad 公司) ;倒置光学显微镜(德国 Leica) ;
AE100 电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)。
2 方法
2． 1 肿瘤模型的建立［12］ 取接种 9 d 生长良好的
H22 小鼠，消毒腹部皮肤，用无菌空针抽吸腹水，生
理盐水稀释，台盼蓝染色后在倒置式显微镜下计数，
活细胞数为 98%以上，调整细胞密度为 1 × 107个 /
L。无菌条件下接种细胞悬液于小鼠右腋窝下，每
只0． 2 ml。
2． 2 分组及给药 将 60 只接种 H22 瘤株的小鼠
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称重，采用完全随机分组法分为 6 组:模型对照组
(生理盐水组)、阳性对照组环磷酰胺(CTX)、PＲP-
S10 高剂量组和低剂量组、PＲP-S16 高剂量组和低
剂量组，每组 10 只，另设空白对照组(10 只，不接种
瘤株)。接种 24 h 后，开始给药，CTX 组剂量为 20
mg·kg －1·d －1，PＲP-S 高、低剂量组分别为 20，10 mg
·kg －1·d －1，正常对照组和模型组均给等量的生理盐
水，给药方式为腹腔注射(ip)。每天固定时间给药
一次，连续 10 d。
2． 3 PＲP-S对小鼠肿瘤的抑制作用 末次给药 24
h后颈椎脱臼处死小鼠，摘取瘤块、脾脏及胸腺并称
重，计算抑瘤率、脾脏指数及胸腺指数。抑瘤率 =
(模型组瘤质量 －给药组瘤质量)/模型组瘤质量 ×
100%;脾脏指数 =小鼠的脾质量(mg)/小鼠的体质
量(g) ;胸腺指数 =小鼠的胸腺质量(mg)/小鼠的体
质量(g)。
2． 4 肿瘤组织病理学观察 瘤体用 10%甲醛固
定，常规石蜡包埋切片，脱蜡，HE染色后光镜观察。
2． 5 肿瘤组织中 Bax、Bcl-2、bFGF蛋白表达 瘤体
用 10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，脱蜡和水化
后，在0． 3%H2O2甲醇溶液中室温孵育 30 min。微
波法抗原修复后，滴加相应抗体，4 ℃孵育过夜，滴
加生物素标记的二抗室温孵育 30 min，DAB 显色，
封片。通过倒置光学显微进行观察，采用 Leica-
QWinV3 软件进行图像分析及灰度扫描，计算平均
灰度值。平均灰度值在图像分析中用图像的透光率
来表示，分为 256 级，最黑为 0 级，最亮为 256 级。
数值越大，说明其免疫组化的染色越浅，蛋白含量越
低，阳性表达越低。
2． 6 血清肿瘤坏死因子 TNF-α 的测定 末次给药
24 h后，小鼠眼眶取血，3 000 r·min －1(离心半径 5
cm)离心 5 min，分离血清，－ 70 ℃保存备用。采用
酶联免疫吸附实验法(ELISA)进行测定，严格按照
试剂盒说明书操作。
2． 7 数据统计 所有数据均以 珋x ± s 表示。t 检验
采用 SPSS 11． 5 统计软件包完成，以 P ＜ 0． 05表示
差异显著;P ＜ 0． 01表示差异极其显著。
3 结果
3． 1 PＲP-S 对小鼠移植性 H22 实体瘤生长的抑制
作用 结果如表 1，PＲP-S10 和 PＲP-S16 对小鼠 H22
实体瘤均表现出了明显的抑制作用，高剂量时的抑
瘤率分别为54． 6%和60． 6%。CTX能够显著降低肿
瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，而 PＲP-S 在抑制肿
瘤的同时，对荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数没有
显著的影响，说明没有出现明显的免疫损伤，这是与
化疗药 CTX的不同之处，其作用机制有待研究。
3． 2 小鼠 H22 瘤组织形态学观察 病理检测结果
如图 1 示，荷瘤对照瘤细胞生长致密、细胞完整、
PＲP-S10 和 PＲP-S16 高剂量组肿瘤细胞体积变小，
细胞间隙变大，部分细胞出现破裂，有小片状坏死。
3． 3 PＲP-S对 H22 瘤体 Bax、Bcl-2 和 bFGF蛋白表
达的影响 首先考察了 PＲP-S 对荷瘤小鼠 Bax 和
Bcl-2 蛋白表达的影响，结果见表 2。PＲP-S10 和
PＲP-S16 高低剂量组小鼠肿瘤组织中 Bax 蛋白阳性
表达均显著高于模型组，而 Bcl-2 蛋白阳性表达均
显著低于模型组，说明 PＲP-S 可以通过上调促凋亡
基因 Bax，下调凋亡抑制基因 Bcl-2 的蛋白表达，而
发挥抗肿瘤作用。比较结果发现，CTX 也可以上调
Bax和下调 Bcl-2，并且对之的影响比 PＲP-S 还大。
于是我们测定了肿瘤组织中 bFGF 蛋白表达情况，
结果表明(表 2) ，CTX 对 bFGF 没有显示明显的影
响，而 PＲP-S10 和 PＲP-S16 高低剂量组均可以显著
抑制肿瘤组织 bFGF 表达，提示抑制肿瘤血管生成
可能为其抗肿瘤的另一机制，也是与 CTX抗肿瘤机
制的不同之处。
3． 4 PＲP-S对荷瘤小鼠血清 TNF-α 的影响 PＲP-
S组小鼠血清中 TNF-α 的含量显著高于模型组，环
磷酰胺也可以提高荷瘤小鼠血清 TNF-α 水平，但低
于高剂量的 PＲP-S组。
表 1 PＲP-S对荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数和肿瘤质量的影响(n =10，珋x ± s)
Tab 1 Effects of PＲP-S on spleen index，thymus index and tumor weight of tumor-bearing mice(n = 10，珋x ± s)
组别 剂量 /mg·kg －1 脾脏指数 /mg·g － 1 胸腺指数 /mg·g － 1 肿瘤质量 / g 肿瘤抑制率 /%
空白对照组 － 5． 98 ± 1． 14 2． 65 ± 0． 73 － －
模型组 － 5． 67 ± 0． 93 2． 41 ± 0． 41 1． 03 ± 0． 18 －
PＲP-S10 10 5． 61 ± 1． 01 2． 83 ± 0． 59 0． 58 ± 0． 11b 43． 2
20 5． 95 ± 1． 09 2． 59 ± 0． 53 0． 47 ± 0． 08b 54． 6
PＲP-S16 10 5． 85 ± 0． 87 2． 77 ± 0． 62 0． 53 ± 0． 07b 48． 7
20 5． 86 ± 0． 97 2． 57 ± 0． 46 0． 41 ± 0． 09b 60． 6
CTX 20 3． 87 ± 0． 78a 1． 04 ± 0． 29b 0． 25 ± 0． 07b 75． 7
注:与模型组比较，aP ＜ 0． 05，bP ＜ 0． 01
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表 2 PＲP-S对肿瘤组织中 Bax、Bcl-2、bFGF和 TNF-α蛋白表达的影响(珋x ± s，n =10)
Tab 2 Effects of PＲP-S on protein expression of Bax，Bcl-2，bFGF and TNF-α in tumor tissues(珋x ± s，n = 10)
组别 剂量 /mg·kg －1 Bax Bcl-2 bFGF TNF-α /ng·ml －1
模型组 － 170． 58 ± 6． 56 121． 77 ± 5． 12 187． 21 ± 7． 54 0． 62 ± 0． 15
PＲP-S10 10 151． 79 ± 5． 13b 133． 68 ± 5． 87a 208． 78 ± 6． 73b 1． 06 ± 0． 23b
20 146． 20 ± 4． 67b 135． 44 ± 4． 67b 215． 70 ± 8． 98b 1． 25 ± 0． 21b
PＲP-S16 10 140． 68 ± 5． 01b 143． 88 ± 4． 64b 209． 01 ± 7． 12b 1． 17 ± 0． 17b
20 136． 89 ± 3． 98b 145． 06 ± 6． 38b 220． 91 ± 9． 23b 1． 28 ± 0． 22b
CTX 20 110． 98 ± 5． 01b 161． 65 ± 7． 23b 196． 36 ± 8． 23 1． 13 ± 0． 19b
注:与模型组比较，aP ＜ 0． 05，bP ＜ 0． 01
A．模型组;B． PＲP-S10 (20 mg·kg －1) ;C． PＲP-S16 (20 mg·kg －1) ;
D． CTX
A． model group;B． PＲP-S10 (20 mg·kg －1) ;C． PＲP-S16 (20 mg·
kg －1) ;D． CTX
图 1 肿瘤组织病理改变(× 200)
Fig 1 Pathological changes of tumor tissues(× 200)
4 讨论
前期研究表明［5-6］，PＲP-S体外对肿瘤细胞的抑
制作用随着硫酸化程度的提高而增加;而体内实验
发现同剂量下低硫酸化的 PＲP-S18 比高硫酸化的
PＲP-S22 抑瘤率高，并且同一硫酸化样品，高剂量时
抑瘤率反而下降。提示虽然 SO2-4的引入可以引起肿
瘤的抑制，但过多的 SO2-4 可能会因溶血等不良反应
引起小鼠整体状况下降，从而使小鼠的肿瘤抑制率
降低。因此，本实验选取了低硫酸化取代的 PＲP-
S10 和 PＲP-S16，设计了较低的剂量进行体内抗肿
瘤实验研究。结果表明，在 10，20 mg·kg －1剂量下，
PＲP-S10 和 PＲP-S16 对小鼠 H22 实体瘤均表现出
明显的抑制作用，实验组中高硫酸根取代度 PＲP-
S16 的活性大于低取代的 PＲP-S10。通过与前期研
究的 PＲP-S18 和 PＲP-S22 相比，以相对肿瘤抑制率
(均相对于 CTX)计，PＲP-S16 活性最好，PＲP-S18 次
之。另外，本实验发现，PＲP-S 在抑制肿瘤的同时，
对机体的免疫功能损伤较小，表现为小鼠脾脏指数
和胸腺指数没有明显改变，这一点与化疗药物 CTX
不同，为 PＲP-S治疗肿瘤的优势。
Bcl-2 是第一个被确认有抑制细胞凋亡作用的
基因，Bax是近年来发现的一种凋亡促进基因［7-8］。
它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控，当细胞受
到死亡信号刺激，与 Bcl-2 相结合的蛋白 Bax 就会
被置换出来，线粒体膜通透性增加，释放出一系列物
质，最终导致细胞死亡。实验结果发现，PＲP-S 可以
通过上调 Bax、下调 Bcl-2 的蛋白表达而发挥抗肿瘤
作用。另外，PＲP-S 可以显著提高荷瘤小鼠血清
TNF-α的含量，说明 PＲP-S 对肿瘤的抑制作用还与
影响机体产生 TNF-α，从而促进肿瘤的坏死有关。
肿瘤的发生和发展依赖于新生血管生成，当肿
瘤生长到一定体积时需要新生血管为其输送营养并
运走代谢废物，哈佛大学医学院的 Folkman 等［13-14］
因此提出了“饿死肿瘤学说”，即通过一种有效的血
管生成抑制剂切断肿瘤的营养供给起到抑制肿瘤生
长和转移的作用。碱性成纤维细胞生长因子(bF-
GF) ，可以通过促进血管内皮细胞迁移、增殖和形成
管状结构，从而促进血管生成［10，15］。特别需要提出
的是，PＲP-S 可以显著抑制小鼠肿瘤组织中 bFGF
表达，提示了 PＲP-S可能通过抑制肿瘤新生血管的
生成抗肿瘤，这是与 CTX机制不同之处。关于其抑
制肿瘤血管生成的实验及深入机制，正在进一步的
研究中。
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［收稿日期］2014-06-23
［基金项目］国家科技支撑计划课题(编号:2013BAI11B01) ;贵州省科技重大专项项目(编号:黔科合重大专项字［2011］6019 号) ;贵阳市科技
计划项目(编号:筑科合同［2011401］社 6-2 号) ［作者简介］郑林，女，博士研究生，研究方向:中药药效物质基础与质量控制研究，电话:
0851-6908468，E-mail:mailofzl@ 126． com ［通讯作者］ 李勇军，男，教授，研究方向:中药新药研究开发，电话:0851-6908468，E-mail:
liyongjun026@ 126． com
基于耐缺氧能力的参芎葡萄糖注射液生物活性测定方法的建立
郑林1，2，董莉1，2，董永喜1，3，张晓红1，2，刘星星1，2，李勇军1，3 (1．贵阳医学院药学院，贵州 贵阳 550004;2．贵州省
药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004;3．民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004)
［摘要］ 目的:建立参芎葡萄糖注射液生物活性的测定方法并用于质量控制。方法:采用小鼠皮下注射异丙肾上腺素(Iso)
诱导心肌缺血建立常压耐缺氧模型，观察参芎葡萄糖注射液对小鼠存活时间的影响。以小鼠耐缺氧试验作为参芎葡萄糖注
射液生物活性测定方法和限值剂量确定依据，并对 10 批参芎葡萄糖注射液生物活性进行测定。结果:参芎葡萄糖注射液以临
床人用剂量的 20 倍(56． 0 mg·kg －1，以川芎嗪计)连续给药 3 d，可明显延长缺氧小鼠的存活时间，且 10 批样品均显示出较好
的生物活性。结论:基于耐缺氧能力的参芎葡萄糖注射液生物活性测定方法准确、可靠，能有效控制参芎葡萄糖注射液的内
在质量。
［关键词］ 参芎葡萄糖注射液;生物活性测定;小鼠耐缺氧实验;质量控制
［中图分类号］Ｒ927． 2 ［文献标识码］A ［文章编号］1001-5213(2015)11-0989-03 DOI:10． 13286 / j． cnki． chinhosppharmacyj． 2015． 11． 05
Establishment of bioactivity assay method for Shenxiong Glucose Injection based on hypoxia
tolerance
ZHENG Lin1，2，DONG Li1，2，DONG Yong-xi1，3，ZHANG Xiao-hong1，2，LIU Xing-xing1，2，LI Yong-jun1，3(1． School
of Pharmacy，Guiyang Medical College，Guizhou Guiyang 550004，China;2． Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，
Guizhou Guiyang 550004，China;3． Engineering Ｒesearch Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，
Ministry of Education，Guizhou Guiyang 550004，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To establish a bioactivity assay method for quality control of Shenxiong glucose injection．METHODS
The model of hypoxia tolerance in mice was established via subcutaneous injection of isoprenaline，and survival time was observed．
Bioactivity was detected in 10 batches of Shenxiong glucose injection samples． ＲESULTS Shenxiong glucose injection could signifi-
cantly prolong survival time after administration for 3 days at a dose 56． 0 mg·kg －1 ． All 10 batches of Shenxiong glucose injection
showed good bioactivity (P ＜ 0． 05)． CONCLUSION This method is simple and reliable，can be used for quality control of Shenx-
iong glucose injection．
KEY WOＲDS:Shenxiong glucose injection;bioactivity assay;the test of hypoxia tolerance in mice;quality control
参芎葡萄糖注射液是由丹参和盐酸川芎嗪配伍
组成的复方制剂，具有抗血小板聚集，扩张冠状动
脉，降低血液黏度，加速红细胞的流速，改善微循环，
抗心肌缺血和心肌梗死的作用［1-3］。临床主要用于
冠心病心绞痛等缺血性血管疾病的治疗，疗效显著，
受到广大医生和患者的欢迎。参芎葡萄糖注射液现
行质量标准主要采用理化分析方法，对丹参素和盐
酸川芎嗪进行含量测定，难以全面反映制剂的化学
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