全 文 ：第 28卷　第 5期 　　　　　　　　　　　　　　　　西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　 Vol.28　No.5
　 2008年 10月 　　　　　　　　　　　　JOURNALOFSOUTHWESTFORESTRYCOLLEGE　　　　　 Oct.2008　
＊　收稿日期:2008-03-03　　＊＊为通信作者
基金项目:云南省自然科学基金项目(2002C0047M)资助;云南省重点项目(2003NG12)资助.
作者简介:黄丽丹(1981—),女 ,广西百色人,硕士生 ,主要从事资源微生物的学习与研究.
茶藨生柱锈重寄生菌粗毒素的基本性质＊
黄丽丹 ,陈玉惠＊＊ ,李永和
(西南林学院基础部 ,云南 昆明 650224)
摘要:对茶藨生柱锈重寄生菌拟盘多毛孢之一种产生的粗毒素进行基本性质研究.结果表明:
该重寄生菌所产毒素是一类小分子 、极性较大的非蛋白类物质 ,具有热稳定性和酸碱稳定性 ,
能被甲醇从培养液中较好地提取出来.
关键词:重寄生菌;粗毒素;基本性质;茶藨生柱锈
中图分类号:S432.4　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-7179(2008)05-0049-03
　　华山松(PinusarmandiFranch)是云南省主要
用材树种 ,也是长江中上游防护林体系的主要造林
树种之一 ,其纯林已占长江防护林造林面积的
40%.随着华山松人工纯林的增多 ,华山松疱锈病已
使松林大面积受害.据调查 ,发病面积已达 1万
hm2 [ 1] .目前 ,该病以化学防治为主 ,配以修枝 、铲除
转主寄主植物等营林技术措施.但由于该病病原
菌—茶藨生柱锈菌(CronartiumribicolaJ.C.Fisch-
er)是长循环型转主寄生锈菌 ,所产接种体之一的锈
孢子能抵抗恶劣环境 ,侵染转主寄主 ,防治相当困
难 [ 2-3] .化学杀菌剂长期大量使用极易对环境造成
污染及对生态平衡的破坏 ,导致病原菌抗药性的产
生及有益生物减少.为此 ,人们越来越重视利用生
物控制因子(重寄生菌)进行生物防治[ 4-5] .
在研究茶藨生柱锈菌重寄生菌时 ,经筛选获
得 1株对锈孢子有强寄生能力且在寄生过程中能
分泌毒素的拟盘多毛孢 MM011[ 6] .该菌易于培养 ,
有良好的生产性状和生防效果 ,为具有高效生防
潜能的优良菌株.本研究对其毒素粗提物的基本
特性进行研究 ,为该菌株进一步开发及利用该菌
株的毒素生产生物农药奠定基础.
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试菌株为拟盘多毛孢 MM011菌株 ,分离自
茶藨生柱锈锈孢子堆并经鉴定为重寄生菌;生测材
料为华山松疱锈病发病林分的锈孢子 ,分别采自云
南昆明市东川区二二二林场 、巧家县马树林场 、洱
源县罗坪山林场和四川广元县天台山林场.
1.2　试验方法
1.2.1　生测方法　生测采用滤纸片法 ,即在直径
为 1cm的滤纸片上均匀涂抹一薄层锈孢子后 ,用
移液枪吸取各处理液 1mL将滤纸完全浸湿 ,以使
锈孢子被完全浸没 ,定时观察锈孢子的变化情况.
鲜黄色的为有活力的孢子 ,颜色变白的为活力丧
失的孢子 [ 7] .
1.2.2　毒素原液的制备 　将培养 15 d的供试
菌株培养物 ,用双层纱布滤去菌丝体后经布氏漏
斗真空抽滤获得培养滤液即毒素原液.操作均在
无菌条件下进行.滤液置于 4℃下保存备用.
1.2.3　毒素物质分子量范围的初步确定　吸取适
量的毒素原液移入截留分子量 3.5KD(1D=0.992 1
u)的透析袋内 ,于 4℃下用蒸馏水透析 ,每隔 12h换
水 1次 ,直至无色为止 ,取透析袋内溶液进行生物测
定 ,以未接菌体的培养液为对照 ,设 3次重复.
1.2.4　代谢物中蛋白与非蛋白部分活性的测定
　向毒素原液中加入 2 ～ 3倍体积的无水乙醇 ,充
分沉淀大分子蛋白质 、多糖及核酸类物质后于 2
℃ , 5 000r/min冷冻离心 15min获得蛋白部分与
非蛋白部分.将蛋白部分用蒸馏水稀释至原浓度 ,
非蛋白部分于 40 ℃下旋转蒸发充分挥发去除乙
醇后用蒸馏水稀释至原浓度.用锈孢子检测各部
分毒素的活性 ,以毒素原液为对照 ,设 3次重复.
1.2.5　毒素粗提物的制备　量取一定体积的毒
素原液 , 50℃下旋转蒸发至干燥(收集蒸出液),
分 3次加入甲醇充分振荡提取.合并提取液 , 40℃
下去除残留甲醇 ,用蒸馏水恢复至原体积即得到毒
素粗提物.甲醇提取后的残留物(主要为蛋白质 、核
酸 、多糖等大分子物质)用蒸馏水重新溶解至原体
积.对毒素粗提物 、甲醇提取后残留物及蒸出液分
别进行生物测定 ,以毒素原液为对照 ,设 3次重复.
1.2.6　不同温度下粗毒素活性测定　将毒素粗
提液分别在 0, 50, 100℃的水浴中和 121 ℃, 0.1
MPa下处理 20 min,对不同温度处理的毒素粗提
物进行生测 ,以毒素粗提物在常温下的生物活性
为对照 ,重复 3次.
1.2.7　不同 pH值下粗毒素活性测定　用精密 p
H试纸测得毒素粗提物的 pH值为 5.7,用 1mol/L
的 HCl和 NaOH调节毒素粗提物的 pH值使之分
别为 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0,再分别对锈
孢子进行生测 ,以未接菌的对应 pH值的培养液作
为对照 ,重复 3次 ,记录并比较生测结果.
1.2.8　毒素在不同极性有机溶剂中的分配　取
相同体积的 8份培养滤液 , 60℃下旋转蒸发浓缩
至一定体积 ,分别加入 3倍体积的不同极性有机
溶剂(甲醇 、乙酸乙酯 、三氯甲烷 、石油醚 、甲醇 +
氯仿),充分振荡后静置过夜 ,使沉淀析出或分层.
得溶剂相和残留沉淀物(水相),合并各萃取液于
40℃下旋转蒸发至干燥 ,沉淀物挥发去残留溶剂 ,
用蒸馏水恢复至一定体积 ,将各部分作生物测定 ,
以毒素原液为对照 ,重复 3次.
2　结果与分析
2.1　毒素物质分子量范围的初步确定
用毒素原液进行的透析试验结果见表 1.
表 1　 MM011毒素透析的生测结果
生测液 生测时间 /h
12 24 36 48
袋内截流液 - - - -　- - - - - - - -
毒素原液 +++ ++++++++ +++++++++ +++++++++
CK -- - -　- - - - - - - -
　　注:1.表 1中 CK为未接菌体的培养液.2.“ +++”为对锈
孢子伤害作用效果极为明显 , 90%以上的孢子变白;“ ++”为对
锈孢子伤害作用效果相当明显 , 大部分孢子(50% ～ 90%)变白;
“ +”为对锈孢子伤害作用效果比较明显 , 少数孢子(20% ～ 50%)
变白;“ -”为对锈孢子伤害作用效果不明显 ,几乎没有孢子变白.
表 1结果显示:具有生物活性的毒素原液经
透析后 ,对锈孢子失去了伤害作用.说明毒素原液
中具有的生物活性小分子物质在透析过程中扩散
或转移到了透析袋外 ,因此 ,该重寄生菌所产毒素
物质的分子量应 <3.5KD.
2.2　毒素原液中蛋白部分与非蛋白部分活性的比较
乙醇处理后 ,大分子的蛋白质和多糖物质等
沉淀下来 ,毒素原液被分成蛋白及非蛋白 2部分 ,
2部分的生测结果见表 2.
表 2　毒素原液中蛋白质部分与非蛋白质部分的生物活性
生测液 生测时间 / h
12 24 36 48
蛋白部分 -　-　- -　-　 - -　 -　 - +　-　-
非蛋白部分 -　-　- + + + +++++++ +++++++++
CK ++ + ++++++++ +++++++++ +++++++++
表 2结果显示:蛋白质等大分子物质部分对
锈孢子没有伤害作用 ,而能够溶于乙醇的小分子
物质保留了毒素原液的生物活性.
2.3　毒素原液中不同提取组分的生物活性
毒素原液经甲醇粗提 ,分出 3种不同组分:毒
素粗提物 、残留物水溶液 、蒸出液.3种组分的生测
结果见表 3.
表 3　毒素原液不同提取部分的生测结果
提取组分 生测时间 /h
12 24 36 48
毒素粗提液 -　-　- ++　　+　　+ ++　　++　　+++ +++　　+++　　+++
甲醇提取残
留物水溶液 -　-　- -　-　- -　-　 - -　 -　 -
蒸出液 -　-　- -　-　- -　-　 - -　 -　 -
CK + + + ++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　　+++　　+++
表 3结果表明:毒素原液蒸出液和甲醇沉淀物
溶解液对锈孢子基本无毒性 ,仅毒素粗提物有明显
的生物活性 ,这与用乙醇沉淀后非蛋白部分表现出
的生物活性结果一致 ,表明用甲醇提取时 ,毒素原
液中的绝大多数毒素物质可以被抽提出来.
2.4　温度对毒素生物活性的影响
热稳定性是毒素物质的基本性质之一.
MM011所产毒素粗提物在不同温度处理下的生测
结果见表 4.
表 4　温度对毒素生物活性的影响
温度 /℃ 生测时间 /h
12 24 36 48
0 ++　++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++
20 ++　+　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++
50 ++　++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++
100 +++++　++ +++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++
121 +　++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++
CK(常温) ++　++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++ +++　+++　+++
　　表 4显示:该毒素粗提物在 0 ～ 121℃范围内
处理后毒素的生物活性无明显变化 ,具有很高的
热稳定性.
2.5　pH值对毒素生物活性的影响
MM011所产毒素类物质在 pH3 ～ 9范围内具
有一定的酸碱稳定性 ,不同 pH值处理的毒素粗提
物对锈孢子的伤害作用无显著性差异 ,而作为相
应 pH值的对照在此范围内对生测锈孢子无伤害
作用(表 5),表明 MM011毒素在 pH3 ～ 9范围内
具有一定的酸碱稳定性 ,且毒素对锈孢子的伤害
作用不是由培养液的酸碱度引起的.
50 西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　第 28卷
表 5　pH值对毒素生物活性的影响
pH值 毒素粗提物生测时间 /h
12 24 36 48
CK生测时间 /h
12 24 36 48
3 +　　　　　+　　　　　+ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-
4 +　　　　　+　　　　　+ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-
5 +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-
6 +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-
7 +++　　++　　　++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-
8 +++　　++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-
9 ++　　　++　　　　+ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ -　-　- -　-　- -　-　- -　-　-原液 +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++ +++　　+++　　+++
　　注:对照为调到相应 pH值的未接菌体培养液.
2.6　毒素在不同有机溶剂中的分配
MM011所产毒素成分不溶于石油醚 、氯仿 、乙
酸乙酯 ,能够部分溶于甲醇氯仿的混合溶剂 ,而甲
醇能够将毒素成分从水溶液中充分提取出来 (表
6).由此可见 , MM011所产的毒素是一类极性较
大的物质.
表 6　毒素在不同有机溶剂中的分配
有机溶剂
(提取液)
生测时间 /h
12 24 36 48
甲醇 ++++++　+++　+++ +++　+++　++++++　+++　+++
乙酸乙酯 -　-　- -　 -　 - -　 -　 - -　 -　 -
氯仿 -　-　- -　 -　 - -　 -　 - -　 -　 -
石油醚 -　-　- -　 -　 - -　 -　 - -　 -　 -
甲醇:氯仿(1∶4)-　-　- -　 -　 - -　 -　 - -　 -　 -
甲醇:氯仿(2∶3)-　-　- -　 -　 - -　 -　 - -　 -　 -
甲醇:氯仿(3∶2)-　-　- -　 -　 - - + - -　 +　-
甲醇:氯仿(4∶1)-　-　- +　-　 - + - - + +　-
CK + ++++　+++　+++ +++　+++　++++++　+++　+++
3　结论与讨论
(1)拟盘多毛孢 MM011菌株所产毒素是一
类小分子 、极性较大的非蛋白类物质 ,具有较高的
热稳定性和酸碱稳定性;甲醇能将其从培养液中
较好地提取出来.
(2)探讨毒素的基本性质是进一步弄清毒素
作用机制和如何利用毒素的基础.毒素的基本性
质与其活性成分的种类有关 ,一般情况下 ,对毒素
的基本性质研究应在分离纯化后进行 ,本文所作
毒素粗提物的有关特性研究也许不能完全说明纯
毒素的性质 ,但可部分揭示该毒素的一般特性.
(3)真菌毒素的稳定性是评价其利用价值的
关键因素之一.从温度 、pH对粗毒素活性的影响
来看 ,该菌株产生的毒素很稳定 ,具有较高的开发
利用价值.但是 ,一种毒素要作为生防制剂应用于
田间 ,除稳定性研究之外 ,其他方面的研究如贮藏
时间 、贮藏条件等也是今后研究的重点.
[参　考　文　献 ]
[ 1] 　李永和 ,谢开立 ,曹葵光.华山松主要病虫害综合治
理研究 [ J] .中国森林病虫 , 2002, 21(3):13-16.
[ 2] 　马建鹏,杨宏波 ,金元锋, 等.云南华山松疱锈病综合治
理技术研究[ J].西南林学院学报, 2002, 22(1):47-49.
[ 3] 　杨松.云南省华山松疱锈病发生与林分条件关系及
防治的初步研究 [ D] .昆明:西南林学院 , 2003.
[ 4] 　袁秀英 ,韩彦洁.锈寄生菌对杨柴锈病菌的寄生及控
病作用 [ J] .林业科学研究 , 2000, 13(1):103-106.
[ 5] 　黄云 ,陈幼林.梨胶锈重寄生菌对贴梗海棠锈病菌的寄
生及控病作用 [ J] .中国生物防治 , 1997, 13(1):10-13.
[ 6] 　杨艳红 , 陈玉惠 , 朱云峰 , 等.西南地区茶藨生柱锈
重寄生菌的分离与鉴定 [ J] .浙江林学院学报 ,
2005, 22(4):414-419.
[ 7] 　杨艳红.华山松疤锈菌重寄生菌的筛选及其作用机
理初步研究 [ D] .昆明:西南林学院 , 2004.
ElementaryPropertiesofCrudeToxinProducedby
MycoparasiteofCronartiumribicola(Pestalotiopsissp.)
HUANGLi-dan, CHENYu-hui, LIYong-he
(DepartmentofBasicCourses, SouthwestForestryColege, KunmingYunnan650224, China)
Abstract:TheelementarypropertiesofcrudeextractofthetoxinproducedbymycoparasiteofCronartium
ribicola(Pestalotiopsissp.)werestudied.Theresultsshowedthatthetoxinproducedbythismycoparasitewasa
kindofsmalmolecularmaterialnon-proteinwithgreatpolarity.ItwastoleranttohightemperatureandpH
valuevariations, andcouldbefulyextractedbymethanolfromitscultureliquid.
Keywords:mycoparasite;crudetoxin;elementaryproperty;Cronartiumribicola
51第 3期　　　　　　　　　　　　　　　黄丽丹等:茶藨生柱锈重寄生菌粗毒素的基本性质