全 文 ：茶藨生柱锈(Cronartium ribicola )是世界林木三
大病害之一的五针松疱锈病的病原，在中国主要危
害红松（Pinus koraiensis）及华山松（P.armandii）[1-3]。
据调查，茶藨生柱锈目前仅在云南已使上万公顷
华山松林发病 [4-7]，严重威胁着长江上游防护林体
系的建立，给生态恢复带来极大困难。长期以来,
对华山松疱锈病的治理以化学防治为主,并配以
修枝、铲除转主寄主等营林技术措施。然而，由
于茶藨生柱锈菌为长循环型转主寄生锈菌,防治
相当困难 [6,8]。
在华山松疱锈病防治研究过程中，从茶藨生
柱锈菌锈孢子堆中分离获得 1 株重寄生木霉
SS003菌株（Trichoderma atroviride）。该菌株通过
分泌毒素和胞壁降解酶破坏锈孢子，且生物学性
状优良，并具有良好的生防效果 [9-11]。笔者对该菌
株所产粗毒素的基本性质进行研究,为该菌的活
性成分研究及进一步开发利用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
供试菌株为重寄生菌木霉 SS003菌株，分离自
茶藨生柱锈锈孢子堆[11]，由西南林业大学提供。生
测材料为茶藨生柱锈菌的新鲜成熟锈孢子。
1.2 试验方法
1.2.1 培养方法 将供试菌株接于 PDA培养基上
扩繁 5 d，然后用Φ=0.6 cm的打孔器在培养好的木
霉平皿上打孔，将打好的菌块接种在装有 100 mL
植物生理与生物技术
茶藨生柱锈重寄生木霉粗毒素的基本性质
李永艳 1，敖新宇 2 ，陈玉惠 2
（1.西南林业大学 保护生物学学院，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 基础部，云南 昆明 650224）
摘 要：采用液体发酵和生物测定相结合的方法，研究了茶藨生柱锈(Cronartium ribicola)重寄生木霉 SS003菌株（Trichoderma
atroviride）所产粗毒素的基本性质。结果表明，SS003所产粗毒素为一类非蛋白质、极性较大的物质,具有较高的热稳定性和
酸碱稳定性,能被甲醇较好地提取出来,可被活性碳有效地吸附并为甲醇所洗脱。该结果为 SS003菌株的活性成分研究及进
一步开发利用奠定基础。
关键词：木霉；粗毒素;基本性质;茶藨生柱锈
中图分类号：S432.4 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.02.004
Elementary Properties of Crude Toxin Produced by Mycoparasite (Trichoderma atroviride) of Cronartium
ribicola
LI Yong-yan1, AO Xin-yu2, CHEN Yu-hui2
(1.Faculty of Conservation Biology, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China; 2. Department of Fundamental Courses, Southwest
Forestry University, Kunming , Yunnan 650224, China)
Abstract：Adopting the methods of liquid culture and biologic detection, the elementary properties of crude toxin produced by
mycoparasite (Trichoderma atroviride) SS003 of Cronartium ribicola were studied. The results showed that the crude toxin produced by
SS003 was a kind of non-protein material with higher polarity. The produced toxin ,which could be tolerant to high temperature and pH
value variations，could be fully extracted by methanol, the toxin was effectively absorbed by the activated charcoal and be eluted by
methanol. This result could lay the foundation for the active constituent research and further development usage of SS003 strain.
Key words: Trichoderma spp.; crude toxin; elementary property; Cronartium ribicola
收稿日期：2010-09-28；修订日期：2011-01-05
基金项目：西南林业大学重点基金项目（110706）；云南省森林灾害预警与控制重点实验室资助项目（ZK09A105）
作者简介：李永艳（1984-），女，陕西人，在读硕士生，主要从事资源微生物方面研究。
通讯作者简介：陈玉惠（1961-），女，云南人，教授，主要从事植物病理学和生物化学方面的研究。
2011，17（2）：11-15天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences
第17卷天津农业科学
表 1 毒素原液及其蛋白与非蛋白部分的生测结果
Richard培养液的 250 mL三角瓶中，每瓶接种 3块，
以 120 r·min-1振荡培养 (25 ℃ , L ∶ D=12 ∶ 12)，
培养液保持自然 pH值。每处理重复 3次。
1.2.2 毒素原液的制备 将培养 8 d的供试菌株
培养物，先用 8 层纱布滤去菌丝体，所得的滤液经
8 ℃，4 000 r·min-1离心 20 min，上清液即为毒素原
液。以上操作均在无菌条件下进行。滤液置于
4 ℃下保存，备用。
1.2.3 生测方法 生测采用凹玻片法，即在灭过
菌的凹玻片内注入 100 μL毒素原液，取少量锈
孢子浸于其中，适当搅拌使锈孢子与培养滤液
充分接触。盖上盖玻片后置于放有浸湿滤纸的
培养皿内，室温下定时观察锈孢子的变化情况，
每处理重复 3次。按照杨艳红 [11]的方法判断锈
孢子的活力。
1.2.4 毒素原液中蛋白与非蛋白部分的活性
测定 参照黄丽丹等 [12]的方法进行。
1.2.5 毒素在不同极性有机溶剂中的分配 取相
同体积的 10份毒素原液，用旋转蒸发仪于 50 ℃
下浓缩至小体积后，分别加入 3倍体积不同极性
的有机溶剂(甲醇、乙酸乙脂、氯仿、石油醚、苯、正
丁醇、甲醇 ∶氯仿)，充分振荡后静置过夜，得溶剂
相和残留沉淀物（水相）。合并各萃取液于 50 ℃
下旋转蒸发至干，沉淀物挥去残留的溶剂，用蒸
馏水恢复至原体积，取各部分进行生物测定，每
处理重复 3次。
1.2.6 毒素粗提液的制备 参照黄丽丹等 [12]的方
法进行。
1.2.7 温度对粗毒素活性的影响 参照黄丽丹等[12]
的方法并做一定改动。将毒素粗提液置于室温
0，50 ，100 ℃恒温水浴锅中和 121 ℃、0.1 MP下处
理 30 min后，将各处理的毒素粗提液进行生物测
定，每处理重复 3次。
1.2.8 pH值对粗毒素活性的影响 采用 1 mol·L-1
的 HC1和 NaOH分别调节毒素粗提液的 pH 值
（5.90）至 3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，以
未接菌的相应 pH值的培养液作对照进行生物测
定，每处理重复 3次。
1.2.9 活性碳对毒素粗提液中活性成分的吸附
量取 100 mL的毒素粗提液,加入 3 g活性炭,用玻
棒搅拌使其充分吸附,过滤后得滤液A；将吸附后
的活性碳用 100 mL蒸馏水洗脱并过滤,得滤液 B
(蒸馏水洗脱液)；再将已洗脱过的活性碳用甲醇
洗脱后过滤得甲醇洗脱液, 然后将甲醇洗脱液于
40 ℃下经旋转蒸发除去甲醇,用蒸馏水恢复至
100 mL得滤液 C。将滤液 A、B、C进行生物测定,
每处理重复 3次。
2 结果与分析
2.1 毒素原液及其蛋白与非蛋白部分的活性
毒素原液中蛋白及非蛋白部分的生测结果见
表 1。表 1显示，SS003的毒素原液中蛋白质等大
分子物质部分对锈孢子没有伤害作用，而非蛋白
注：1.对照为未接菌体的培养液；2.“+++”为对锈孢子伤害作用效果极为明显，90%以上的孢子变白死亡；“++”为
对锈孢子伤害作用效果相当明显，大部分孢子(50%~90%)变白死亡；“+” 为对锈孢子伤害作用效果比较明显，少数孢子
(20%~50%)变白死亡；“-”为对锈孢子伤害作用效果不明显，几乎没有孢子变白死亡。
生测液
毒素原液
蛋白部分
非蛋白部分
CK
生测时间/h
12
+ - -
- - -
- + -
- - -
24
++ ++ -
- - -
- ++ +
- - -
36
+++ ++ ++
- - -
+ ++ ++
- - -
48
+++ +++ +++
- - -
+++ +++ +++
- - -
部分基本保留了毒素原液的生物活性。
2.2 毒素在不同极性有机溶剂中的分配
SS003的毒素粗提物经甲醇、乙酸乙酯、氯
仿、石油醚、苯、正丁醇等不同极性的有机溶剂萃
取后进行生物测定，结果显示，SS003所产毒素成
分不溶于乙酸乙酯、氯仿、石油醚、苯、正丁醇等
有机溶剂，仅部分溶于甲醇氯仿的混合溶剂中，
而甲醇则能够将毒素成分从水溶液中充分提取
出来（表 2）。因此，SS003所产的毒素是一类极性
较大的物质。
··12
第2期 李永艳等：茶藨生柱锈重寄生木霉粗毒素的基本性质
表 3 毒素原液不同提取部分的生测结果
表 2 毒素在不同极性有机溶剂中的分配及生测结果
2.3 毒素原液中不同提取组分的生物活性
毒素原液经甲醇提取后，毒素粗提液（甲醇提
取液）有明显的生物活性，而蒸出液和甲醇提取
残留物水溶液对锈孢子基本无毒性（表 3），该结
果与用乙醇沉淀后非蛋白部分表现出的生物活
性结果一致，表明用甲醇进行提取，毒素原液中
绝大多数毒素物质可以被提取出来。
2.4 温度对粗毒素活性的影响
热稳定性是毒素物质的基本性质之一。
SS003的毒素粗提液在不同温度处理下毒素生物
有机溶剂
甲醇
乙酸乙酯
氯仿
石油醚
苯
正丁醇
甲醇∶ 氯仿
（1∶ 4）
甲醇∶ 氯仿
（2∶ 3）
甲醇∶ 氯仿
（3∶ 2）
甲醇∶ 氯仿
（4∶ 1）
生测液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
提取液
残留物水溶液
生测时间/h
12
+ - +
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
24
++ + ++
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
+ - -
- - -
36
+++ ++ ++
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- + -
- - -
- - -
- + -
- - -
+ - -
- - -
48
+++ +++ +++
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- + -
- - -
- - +
- + -
- - -
+ - +
- - -
提取组分
毒素粗提液
甲醇提取残留物水溶液
蒸出液
生测时间/h
12
- - -
- - -
- - -
24
+ + +
- - -
- - -
36
++ ++ + ++
- - -
- - -
48
++ + ++ + ++ +
- - -
- - -
活性均无明显变化，具有很高的热稳定性（表 4）。
2.5 pH值对粗毒素活性的影响
SS003所产毒素类物质在 pH3.00~9.00范围内
具有一定的酸碱稳定性。不同 pH值处理的毒素
粗提液对锈孢子均有伤害作用，且伤害程度无明
显差异。而作为相应 pH值的对照在试验的范围
内对生测锈孢子均无伤害作用（表 5），表明 SS003
对锈孢子的伤害作用是由所产毒素物质造成而
不是由培养液的酸碱度引起的。
2.6 活性碳对毒素粗提液中活性成分的吸附
采用活性碳处理 SS003毒素粗提液，结果表
明，毒素粗提液中的活性成分可被活性碳有效吸
附,吸附后的活性成分不能被蒸馏水洗脱,但能为
甲醇所洗脱。
3 讨 论
（1）毒素原液经无水乙醇处理去掉蛋白、多
··13
第17卷天津农业科学
表 6 活性碳对毒素粗提液中活性成分的吸附情况
表 4 温度对毒素粗提液活性的影响
糖及核酸等大分子物质后，非蛋白部分基本保留
了毒素原液的活性，说明该菌产生的毒素是一类
非蛋白质物质。从真菌复杂的代谢物中将毒素
提取出来是一项比较困难的工作。用甲醇提取,
经生测试验结果表明,甲醇能够将 SS003菌株所产
毒素充分提取,而蛋白质、核酸、多糖等大分子物
质都不易溶于甲醇,易与毒素分开。且活性碳吸
附试验证明被吸附的毒素物质不能被蒸馏水洗
脱但可为甲醇高效洗脱，进一步证实该菌产生的
毒素是一类极性较大的物质。
(2)真菌毒素的稳定性是评价其利用价值的关
键因素之一。从温度、pH对粗毒素活性的影响来
看，重寄生木霉 SS003菌株产生的毒素是很稳定
的。由于在自然条件下，重寄生菌的作用效果要
受到环境条件等多因素的影响，防治效果不稳
定。因此利用重寄生菌所产毒素进行生物防治
应具有较高的开发利用价值。
参考文献：
[1] Hiratsuka Y. Forest tree diseases of the prairie provineces[M].
Edmonton：Can For Serv Noth For Cent , 1987:43-49.
[2] 邵力平,姜志贵,张连有.红松疱锈病病原的鉴定[J].林业
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[4] 马建鹏,杨宏波,徐士忠,等.华山松疱锈病防治指标研
究[J].西南林学院学报,1999,19(4):219-223.
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[6] 杨松 .云南省华山松疱锈病发生与林分条件关系及防
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[7] 李永和,谢开立,曹葵光.华山松主要病虫害综合治理研
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温度/℃
0
常温
50
100
121
生测时间/h
12
+ + -
- + -
- + -
+ + -
++ ++ +
24
+++ ++ +
- ++ +
+ + +
++ + +
+++ ++ ++
36
+++ +++ ++
+++ +++ +++
+++ +++ ++
+++ ++ +
+++ +++ +++
48
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
表 5 pH值对毒素粗提液活性的影响
pH值
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
原液
12 h
+ + -
- - +
- ++ +
+ + -
- + +
+ + -
+ + -
+ + -
毒素粗提液
24 h
+++
+
++
+++
+
++
++
++
+++
++
+++
++
++
++
++
+
+++
++
++
+
++
++
+
+
36 h
+++ +++ +++
++ +++ +++
++ +++ +++
+++ +++ +++
++ +++ +++
++ +++ +++
++ +++ +++
+++ +++ ++
48 h
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
对照
12 h
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
24 h
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
36 h
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
48 h
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
洗脱滤液
A
B
C
生测时间/h
12
- - -
- - -
- - +
24
- - -
- - -
+ - +
36
- - -
- - -
+++ ++ +++
48
- - -
- - -
+++ +++ +++
··14
小麦成熟胚离体培养研究
孙 宁 1，赵新海 2，陈小强 1，张 磊 1
（1. 天津农学院 农学系，天津 300384；2. 天津农学院 计算机科学与信息工程系，天津 300384）
摘 要：以美国小麦品种Overley成熟胚作为外植体进行离体培养，研究外源激素对小麦成熟胚诱导愈伤组织、分化出苗以及
试管苗增殖的影响。试验结果表明，在MS培养基中添加2,4-D 3 mg·L-1愈伤组织诱导频率较高，成愈率为84.0%；在添加有
KT 2~3 mg·L-1的MS分化培养基中愈伤组织分化率较高，可达85%以上；将试管苗转接至添加0.2 mg·L-1的NAA和0.5~2.0 mg·L-1
的6-BA的培养基中，试管苗有一定的分化增殖，但最高分化率仅为33.3%，增殖系数2.05。
关键词：小麦；成熟胚；离体培养；植株再生
中图分类号：S512.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.02.005
Study on Mature Wheat Embryos Culture in Vitro
SUN Ning1, ZHAO Xin-hai2, CHEN Xiao-qiang1, ZHANG Lei1
（1.Department of Agronomy, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384,China；2. Department of Computer Science and Information Engineering，
Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）
Abstract：Mature wheat embryos of Overley were used as explants for culture in vitro. The result showed that the optimum medium for
callus induction was MS+2,4-D（3.0 mg·L-1）, the rate of callus formation was 84.0%. The medium for callus differentiation was MS+KT
（2~3 mg·L-1）, the differentiation of callus was more than 85% . The wheat plantlets had low differentiation rate and multiplication
coefficient in MS+NAA（0.2 mg·L-1）+6-BA（0.5~2.0 mg·L-1）, which were 33.3% and 2.05.
Key words: wheat; mature embryo; in vitro culture; plant regeneration
植物生理与生物技术
收稿日期：2010-11-01；修订日期：2011-01-15
基金项目：天津市科技成果转化及产业化推进计划项目（08ZHNZNC03400）；天津农学院科学研究发展基金计划项目
作者简介：孙宁（1979-），女，河北承德人，实验师，硕士，主要从事植物细胞工程研究工作。
通讯作者简介：张磊（1952-），男，天津人，教授，主要从事遗传学和植物细胞工程学研究。
天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences 2011，17（2）：15-17
目前，随着生物技术的发展，利用生物技术方
法改良小麦品种资源越来越受到重视。幼胚被
许多研究者认为是用于小麦离体培养最有效的
转化受体，被广泛用于体细胞无性系变异与基因
遗传转化的研究，但幼胚的培养会受到季节、时
间等限制，且难以重复试验 [1-2]；而小麦成熟胚具
有良好的再生能力，具有种子保存期长、易获得、
取材方便、操作简单、试验周期短、成愈率高、愈
伤组织成长快、一次成苗率高等优点，有助于解
决以上的问题。
有关小麦成熟胚培养研究的报道中，愈伤组
织的诱导及分化频率的问题仍在探讨，进一步改
善成熟胚供体小麦种子的生理状态，优化多种培
养条件，提高胚性愈伤组织的形成能力，仍然是
目前小麦成熟胚培养面临的主要问题。因此，研
究成熟胚组织培养的影响因素，并优化培养条件
是提高小麦成熟胚离体培养效率的关键。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试材为当年产美国堪萨斯州立大学引进的
冬小麦品种 Overley，选取籽粒饱满、大小均匀一
致的种子，取其胚作为培养材料。
[9] 周利.3株木霉的鉴定和生物学特性及对华山松疱病的
防治研究[D].昆明:西南林学院,2004.
[10]杨艳红,陈玉惠,朱云峰,等.西南地区茶藨生柱锈重寄生
菌的分离与鉴定[J].浙江林学院学报,2005, 22 (4) : 414 - 419.
[11] 杨艳红.华山松疱锈菌重寄生菌的筛选及其作用机理
初步研究[D].昆明:西南林学院,2004.
[12] 黄丽丹,陈玉惠,李永和.茶藨生柱锈重寄生菌粗毒素
的基本性质[J].西南林学院学报,2008,28(5):49-51.