全 文 ：山东中医杂志 2016 年 3 月第 35 卷第 3 期
肿瘤的发生和发展依赖于新生血管生成，当肿
瘤生长到一定体积时需要新生血管为其输送营养并
运走代谢废物，哈佛大学医学院的 Folkman 等因此
提出了“饿死肿瘤学说”，即通过一种有效的血管生
成抑制剂切断肿瘤的营养供给，从而起到抑制肿瘤
生长和转移的作用［1-2］。 因此，以肿瘤新生血管为靶
点，开发高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物正成为
国内外学者研究的热点。
茶藨子木层孔菌（Phellinus ribis），为针层孔菌
属真菌，在中国、韩国等国家作为传统药物用于抗肿
瘤［3-4］，疗效确切。 前期研究发现，从茶藨子木层孔菌
中分离获得的多糖 PRP 的硫酸酯（PRP-S）具有抗肿
瘤和抗血管生成的作用［5-6］。 为进一步确定其血管生
成抑制活性，本研究采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模
型测定了不同取代度 PRP-S 对血管生成的影响，以
探讨 PRP-S体内抗肿瘤的作用机制。
1 实验材料
1.1 实验动物 白壳种蛋，每枚重 50～60 g，SPF
级，购于山东省农科院家禽研究所。
1.2 试药与仪器 PRP-S（PRP-S10、PRP-S16、PRP-
S22，硫酸根取代度分别为 1.0，1.6，2.2），参考文献方
法自制 ［6］；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），美国
Pepro Tech Asia公司；氢化可的松，北京索莱宝科技
有限公司；CO2恒温培养箱，HERAEUS，德国；SMZ-T2
连续变倍体视显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司
司；Canon PowerShot A640 数码相机，Canon。
2 方法
2.1 鸡胚孵育 孵化箱以 75%乙醇液擦拭消毒。选
择重量相近、表面无污染、无皱纹裂痕，产出时间在
一周以内的新鲜白皮种蛋，用浸润有新洁尔灭（十
·实验研究·
茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用
许家珍 1，刘 伟 2，刘玉红 1
（1.山东中医药大学，山东 济南 250355； 2.华东理工大学，上海 200030）
［摘要］ 目的：研究茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯（PRP-S）对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。 方法：建立鸡胚绒毛尿囊膜模型，观
察不同硫酸根取代度的 PRP-S 对血管生成的作用。 结果：不同硫酸根取代度的 PRP-S 对鸡胚尿囊膜血管的生成均有抑制作用，
与阴性组比较有显著性差异。 硫酸化程度越高，其血管生成抑制活性越强。 结论：PRP-S 能够抑制鸡胚尿囊膜血管的生成。
［关键词］ 茶藨子木层孔菌多糖；硫酸酯；鸡胚尿囊膜；血管生成抑制
［中图分类号］ R285.5 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 0257-358X（2016）03-0241-03
Inhibitory Effect of Phellinus ribis Polysaccharide Sulfates on Angiogenesis in
Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
XU Jiazhen1，LIU Wei2，LIU Yuhong1
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355；2.East China University of Science
and Technology，Shanghai 200030，China）
Abstract Objective：To investigate the effect of Phellinus ribis polysaccharide sulfates（PRP-S） on the angio-
genesis in chick embryo chorioallantoic membrane. Methods：Chick embryo chorioallantoic membrane （CAM）
model was established. The effect of PRP-S with different degrees of sulfation on angiogenesis of CAM was
observed. Results：PRP-S with different degrees of sulfation all showed inbibitory effects on angiogenesis of
CAM，compared with the negative control. The higher degree of sulfation，the stronger inhibitory effect on an-
giogenesis. Conclusion：PRP-S could inhibit angiogenesis of CAM.
Key words Phellinus ribis polysaccharide；sulfates；chicken chorioallantoic membrane；angiogenesis inhibition.
［收稿日期］ 2015-07-29
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（编号：81402833）；山东省
重点研发计划项目（编号：2015GSF119005）
［作者简介］ 许家珍（1990- ），女，山东临沂人，2014 年级硕士研
究生，研究方向：天然药物化学成分与化学分析。
［通信作者］ 刘玉红，女，副教授，研究方向：天然药物化学成分
与化学分析，E-mail：liuyuhongwu@126.com。
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DOI:10.16295/j.cnki.0257-358x.2016.03.024
山东中医杂志 2016 年 3 月第 35 卷第 3 期
二烷基二甲基苄基溴化铵）的脱脂棉擦拭鸡蛋表面，
擦干后置于恒温培养箱中培养，鸡蛋气室向上，每天
转蛋 2 次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各 45°为
宜。 温度 37℃，培养箱内放入水盘以保持 60%～70%
相对空气湿度，并保持一定的通风换气条件。
2.2 CAM 模型建立 选择生长良好的孵育 7 d 的
鸡胚，用 75%乙醇液消毒后晾干。 用牙科钻或砂轮
在蛋壳表面划刻出凹痕，用尖针在种蛋气室表面扎
一小孔，在凹痕处滴少量生理盐水，用吸耳球对准气
室表面的小孔轻轻吸气，此时可看到凹陷处的生理
盐水下陷，即该处 CAM下陷，形成假气室（区别于蛋
自身的气室）。 用灭菌胶布封闭假气室以及在鸡胚
自身气室上扎的小孔，制备假气室后，放入培养箱中
稳定 48 h。
2.3 供试液的配制 将 PRP-S10、PRP-S16和 PRP-
S22 分别用生理盐水（NS）配制成 0.05 mg/mL 的溶
液。 氢化可的松先以适量的无水乙醇溶解，再用 NS
稀释成浓度为 6.0 mg/mL的溶液。将浓度为 1 mg/mL
的 bFGF加 NS稀释 100倍，配制成浓度为 10 μg/mL。
以上供试液均用 0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。
2.4 分组与给药 开窗成功的鸡胚随机分成 6 组，
以 NS作为空白对照，氢化可的松作为阳性对照，bFGF
作为阴性对照，实验组为 PRP-S10、PRP-S16和 PRP-
S22 组。 加药剂量如下，空白对照组：NS 120 μL；
阴性对照组：NS 100 μL+bFGF 20 μL；PRP-S10 组：
PRP-S10 100 μL+bFGF 20 μL；PRP-S16组：PRP-S16
100μL+bFGF 20μL；PRP-S22组：PRP-S22 100μL+
bFGF 20 μL；阳性对照组：氢化可的松 100 μL+bFGF
20 μL。 将假气室上的胶布揭开，上方开 1 cm2左右
的口，用微量进样器按上述剂量将供试液加到 1 cm2
大小的吸收性明胶海绵上，将明胶海绵用镊子直接
加到鸡胚尿囊膜上，注意小心放置，加药后用无菌胶
布封口，标记后放入温度（37±1）℃的培养箱，保持
60%～70%的相对空气湿度，继续培养 48 h。
2.5 指标检测和方法 培养结束后，揭开无菌透明
胶带，用小手术镊把假气室周围的蛋壳剥除，暴露出
加药区尿囊膜，滴入适量固定液（甲醇 - 丙酮 1∶1）对
尿囊膜上的血管做固定处理 15 min，观察并对尿囊
膜组织表面血管用数码相机微距拍照，根据图片中
血管颜色与尿囊膜组织颜色的区别，采用 IPP（Im-
age-Pro Plus6.0）图像分析软件，采集图像上的不同
色彩点数来计算尿囊膜组织表面血管面积与蛋壳开
窗处对应的 CAM面积，计算出血管面积百分率［7］。
血管面积百分率 =尿囊膜组织表面血管面积/
蛋壳开窗处对应的 CAM面积×100%
2.6 统计学处理 采用 SPSS 17.0 统计软件分析，
计量数据用 x±s 表示，各组之间的参数比较采用
One-Way ANOVA检验，取 α=0.05为检验水准。
3 结果
PRP-S 对 CAM 血管生成的影响作用见图 1，可
以清晰地看出空白对照组 CAM血管网络清晰，呈叶
脉状分布，主血管周围有许多小血管生成，血管分支
较多，血管生长良好；阴性对照组血管生长旺盛，主
血管更加粗壮，分支明显增多，血管密度很大；PRP-
S10 组大血管明显变细，血管数量及其分布明显减
少，PRP-S16组小血管分布不明显，大血管稀疏，PRP-
S22 组血管分支较少，血管变细，血管密度降低。 说
明三种不同硫酸化程度的 PRP-S 均能够明显抑制
bFGF诱导的 CAM血管生成。
采用 IPP 图像软件进行分析，计算开窗面积中
血管面积百分率，结果见表 1。 可以看出，与阴性对
照组相比，PRP-S10、PRP-S16和 PRP-S22 对 CAM 血
管生成均表现出一定的抑制作用，差异有统计学意
义，其血管抑制活性强弱顺序如下：PRP-S22>PRP-
S16>PRP-S10。
4 讨论
肿瘤的发生、发展是一个复杂的多因素调节的
过程，其中肿瘤血管生成是肿瘤生长的必要条件。 现
代研究表明，血管生成抑制剂通过选择性地抑制肿
瘤新生血管形成，能有效地抑制肿瘤生长与转移，具
有抗肿瘤谱广、不易耐药等优点，因此，开展以抑制
肿瘤新生血管发生为基础的抗肿瘤新药研究具有非
常重要的意义［8］。
研究血管生成的模型，主要有动物角膜囊（眼前
房）、动物颊囊和 CAM 3种。 其中 CAM具有实验材
表 1 PRP-S 对 CAM 的血管抑制作用（x±s，n=8）
%
组别 血管面积百分率
空白对照 42.93±0.14
阴性对照 44.07±0.16
PRP-S10 24.54±0.09*
PRP-S16 22.87±0.12*
PRP-S22 17.44±0.23*
阳性对照 20.00±0.13*
与阴性对照组比较 *P<0.05
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料易得、操作简便、实验周期短、可靠性高等优点而
被广泛应用［9］。 本实验采用 CAM模型测定了 PRP-S
对血管生成的影响，结果表明，不同硫酸根取代度的
PRP-S 对血管生长均具有明显的抑制活性，硫酸化
程度越高，对 CAM 血管生长抑制作用越强，揭示了
PRP-S 通过抑制血管生成作用抗肿瘤的机制。 关于
PRP-S 抑制血管生成作用更深入的机制，正在进一
步的研究中。
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PRP-S10 PRP-S16 PRP-S22
图 1 PRP-S 对 CAM 血管生成的影响
空白对照 阴性对照 阳性对照
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