全 文 ：1999-07-16收到 , 2000-04-03接受。
973项目(G1999011704),国家自然科学基金(39670067),国家教委
博士点专项科研基金(970123),生物大分子国家重点实验室资助项目。
＊通讯作者 ,E-mail:chenja@public.bta.net.cn。
盐和干旱胁迫对燕子掌(Crassula agenten Thunb.)叶片液泡膜 H+-
ATPase活性的影响
夏朝晖1　李晓薇2　余和芬1 , 3　陈　珈1＊
(中国农业大学1农业部植物生理生化重点开放实验室 , 2基础学院 , 北京 100094;3中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室 ,
北京 100101)
摘要:专性 CAM 植物燕子掌离体叶片的盐胁迫处理
和失水干旱处理后 , 液泡膜 H+-ATP 酶对低浓度
(200、400 mmol/ L)的盐胁迫(NaCl胁迫 48 h)不敏感 ,
而当盐浓度达到 600 mmol/ L 时 , ATP 水解活性和 H+
转运活性较对照上升 55%～ 65%, 而干旱胁迫(48 h ,
失水 12%)使酶活上升约 30%, 但是上述各种胁迫均
不影响 ATP 水解与 H+转运的耦联比率 , 仍旧维持在
12。用Western blo t证实在逆境下 ,H+-ATP酶的 3 种
主要亚基 A、B 、c在膜上的蛋白含量均有所增加 , 且以
调节亚基(B)的变化最为显著。
关键词:H+-ATP 酶 ,逆境胁迫 , 耦联比率 ,液泡膜 , 燕
子掌 , CAM(景天酸代谢)
学科分类号:Q73
　　细胞的逆境应答涉及一个交叉互联的网络系
统 ,包括逆境信号的传递和各相关功能蛋白的运
作。液泡膜H+-ATP 酶(V 型)在逆境应答中的功
能早已为人们所关注 。许多实验表明盐或干旱胁
迫能诱导 C3 、C4 植物的 V 型 H+-ATP 酶的含量 、
活性和结构发生变化 ,尤其以兼性 C3/CAM 植物
冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)最
为典型(Sze 等 1999), V 型 H+-ATP 酶是植物对
逆境应答的敏感位点 。而 CAM 途径的产生是植
物在长期进化过程中对环境的一种适应 , 它使
CAM 植物在极端干旱和强光照的环境中能良好生
长。而苹果酸通过液泡膜的转运和在液泡中的积
累是 CAM 途径得以实现的关键 ,因为苹果酸是
CAM 途径的另一关键酶———磷酸烯醇式丙酮酸羧
化酶(PEP-C)的别构抑制剂(K i=1 mmol/L)。所
以生成于胞质的苹果酸必须运至液泡贮存 ,通过区
域化来保证胞质内的苹果酸浓度低于 PEP-C 的
K i值 ,并使胞质 pH 值保持稳定 ,否则 CAM 途径
是无法实现的(夏朝晖和陈珈 1998)。而苹果酸通
过液泡膜的运输是由其上的 H+-ATP 酶提供原初
动力的(Lǜttge 1993)。所以液泡膜上的 H+-ATP
酶在 CAM 途径的运行和调节中应该具有重要的
作用 。但是至今对 CAM 植物 V 型 H+-ATP 酶的
研究报告较少 ,尤其是对其在逆境下的适应调节机
理更少涉及 。本文以专性 CAM 植物燕子掌叶片
为材料 ,在液泡膜水平上研究干旱和盐胁迫下其 V
型 H+-ATP 酶的活性和蛋白含量的变化 。
1　材料与方法
1.1　材料及胁迫处理
实验材料取自温室自然光照下生长的燕子掌
(Crassula agenten Thunb.)离体叶片。盐胁迫处
理:叶基部浸于含 NaCl 200 、400 、600 mmol/L 的营
养液 48 h;干旱胁迫处理:离体叶片 25℃放置 48
h ,失水 12%;对照:叶基部浸于不含 NaCl的营养
液中 。
1.2　液泡膜的制备
叶片匀浆过滤 ,滤液经 8 000 ～ 70 000×g 差
速离心 ,获得微粒体制剂(Mic),Mic进一步经蔗糖
不连续密度梯度(8%～ 25%)离心 ,获得液泡膜制
剂(TP)(Ratajczak 等 1994),初级匀浆液中 PVP
含量为 5%(W/ V)。
1.3　膜微囊制剂的纯度鉴定
按照朱美君等(1997)的方法进行 。
1.4　ATP酶水解活性的测定
按朱美君等(1997)的方法进行。
1.5　质子运输活性的测定
以吖啶橙(AO)为质子探针 , 1 ml反应体系含:
220 mmol/L 的蔗糖 、37 mmol/L 的 Hepes-Tris(pH
8.0)、50 mmol/L 的 KCl、0.5 mmol/L 的 NaN3 、0.
5 mmol/L 的 NaM oO4 、0.2 mmol/L的 Na3VO4 、3
mmol/L 的 A TP 、10 μmol/L 的 AO ,加入含 20 μg
膜蛋白的膜微囊制剂后温育 5 min ,以 3 mmol/L
的 MgSO4 的加入启动反应。(1)用荧光猝灭法测
定膜微囊内外的 ΔpH :激发波长 419 nm ,发射波长
527 nm 。(2)用光吸收值的变化测定膜微囊内外
的 ΔpH :在 Shimadzu UV-190 分光光度计上测定
495 nm处反应体系的消光值变化 。
433植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(5):433 ～ 436
1.6　ATP 水解与质子转运的耦联比率(m)的测定
按照Schmidt和Briskin(1993)的方法进行。以 m
=k1δs/ R 求算 ,其中 k 1为校正系数 , δs为稳态时H+
的转运量 , R 为稳态下ATP 的水解活性。该测定体
系下 AO的毫克分子消光系数为 25.1。
1.7　膜蛋白的增溶 、收集及电泳样品的制备
膜蛋白的增溶方法参见 Hurkman 和 Tanaka
(1986)。膜囊泡悬浮于4%SDS缓冲液中 ,80℃放置5
min , 然后加入 4 ～ 5倍体积的冷丙酮(-20℃下预
冷), -20℃放置 20 min后 ,4℃, 15 000×g 离心 15
min ,沉淀用冷丙酮反复洗3 ～ 4次后 ,收集沉淀 ,充分
干燥后溶于适量的SDS-电泳样品缓冲液中 , -20℃贮
存备用。
1.8　Western blot
SDS-PAGE采用 Laemmli(1970)系统 ,分离胶12.
5%, 200 V , 45 min。Western bolt 采用 Towbin 等
(1979)方法 ,65 V , 3 h。一抗分别为:燕麦根液泡膜
H+-ATP 酶的A 、B 、c亚基的抗血清 ,工作浓度分别为
1∶200 、1∶300、1∶1 000。二抗分别为:碱性磷酸脂酶(AP)
偶联的小鼠抗兔的 IgG(A、B亚基)和羊抗小鼠的 IgG
(c亚基),工作浓度均为1∶30 000。
1.9　蛋白含量的测定
按照 Low ry等(1951)的方法进行 ,以BSA为标准
蛋白。
2　实验结果
2.1　液泡膜制剂的纯度
表1为微粒体(Mic)和纯化的液泡膜制剂(TP)
中 ,各种内膜标志酶活性及叶绿素的含量。纯化的液
泡膜制剂中其标志酶硝酸盐敏感的 ATP 酶的比活是
微粒体的5倍。而其它内膜组分的标志酶比活及叶
绿素含量极低(以叶绿素 a和b的含量为标准 ,在微粒
体中为 17.4±1.2μg/mg protein ,而在液泡膜制剂上
检测不到)。表明制备得到了较高纯度的液泡膜囊
泡。
表 1　燕子掌叶片液泡膜制剂各种标志酶的比活＊
Table 1　Marker-enzyme activities of membrane probes of leaf cell of Crassula agenten
Marker enzyme Location
Specific activity(nmol Pi min-1 mg-1 protein)
Microsome Tonoplast
VO3-4 -sensitive ATPase Plasma membrane 18.2±2.5 nd＊＊　
NO-3-sensitive ATPase Tonoplast 51.9±3.7 258.2±12.9
NaN3-sensitive ATPase Inner mitochondrial membrane 42.8±3.4 　8.6± 0.7
Latent UDPase Golgi membrane 28.9±2.9 　7.9± 0.5
NADPH-Cy tc reductase Endoplasmic reticulum 8.5±0.8 　6.9± 0.4
＊Values in the table is means of 3 independent experiments ±S.D.＊＊nd means not detected.
2.2　不同胁迫条件下H+-ATP酶的 ATP水解活性
图 1的数据表明 V 型 H+-A TP 酶对低浓度的
盐胁迫不敏感 ,但当浓度升至 600 mmol/L 时 ,酶
活大幅上升 ,较对照提高了 60%。而对失水 12.
4%的干旱胁迫而言 ,酶活上升了 30%,说明胁迫
可引起燕子掌 V 型H+-ATP 酶的活性上升 。
2.3　不同胁迫条件下H+-ATP酶的质子运输活性
图 2是各种胁迫条件下 H+-ATP 酶的质子运
输活性 。干旱和 600 mmol/L 的 NaCl胁迫均使质
子运输活性大幅上升 ,尤以 600 mmol/L 的 NaCl
胁迫更为显著。
2.4　胁迫处理下 H+-ATP酶的耦联比率
按 1.6中的方法计算各相应处理的耦联比率 ,
结果总汇于表 2。各处理下的耦联比率均接近
2.0 ,没有显著改变。
图 1　不同胁迫条件下燕子掌叶片液泡膜 H+-ATP 酶的
ATP 水解比活
Fig.1　Specific activity of ATPase in the tonoplasts of leaf cell
of Crassula agenten under different stress
1.Contro l for salt stress , 2.NaCl 200 mmol/ L , 3.NaCl 400
mmo l/ L , 4.NaCl 600 mmol/ L , 5.Control for drought stress ,
6.Drought.
434 　　　　植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　26卷
图 2　燕子掌叶片液泡膜 H+-ATP 酶在不同胁迫处理后的
质子转运活性
Fig.2 　Proton pumping activity of tonoplast H+-ATPase
f rom leaf cells of Crassula agenten under different stress
1.Control , 2.After drought stress , 3.After NaCl(600 mmol/ L)
stress.
表 2　燕子掌叶片液泡膜 H+-ATP 酶在不同胁迫处理后耦
联比率的计算
Table 2 　Estimation of H+/ substrate stoichiome try for the
tonoplast H+-ATPase of leaf cell of Crassula agenten after
different stress
Parameter Control Drought
NaCl
(600 mmol/ L)
δs(μmol H+/ mg protein) 0.57 0.67 0.76
k 1(min-1) 0.25 0.25 0.25
ATP hydrolysis 4.32 4.60 5.48
(μmol h-1mg-1protein)
H
+/ATP stoichiometry 1.97 2.17 2.08
2.5　H+-ATP酶的 3种主要亚基的Western blot
鉴定
各种 V 型 H+-ATP 酶均含有 3种主要的亚
基 ,分别为负责催化 ATP 水解的 A 亚基 ,调节活
性的 B亚基和执行质子通道功能的小 c亚基 。在
严格计算了 SDS-PAGE 中样品总蛋白量(35 μg 膜
蛋白)的情况下 ,Western blot(图 3)结果显示 ,胁迫
后这三种亚基在膜上的蛋白含量均有所增加 ,其中
调节亚基(B)的变化最为显著 ,说明该亚基对胁迫更
为敏感。
3　讨论
在CAM 途径中 ,苹果酸是一种 CO2的贮存形
图 3　燕子掌叶片液泡膜 H+-ATP 酶的 3 种主要亚基的
Western blot鉴定
Fig.3　 I dentification of three subunits o f tonoplast H+-AT-
Pase from leaf cell o f Crassula agenten by Western blot
1.Control , 2.NaCl 200 mmol/ L , 3.NaCl 400 mmol/ L , 4.
NaCl 600 mmol/ L , 5.Drought.
式和渗透调节剂。作为贮存形式 ,它可以使植物得
以将吸收和同化大气中的 CO2 在时间上分开 ,从
而提高水分利用率;作为渗透调节剂 ,可以使植株
在逆境下能够保持极限生理需求的渗透势。而液
泡膜上的 H+-ATP 酶为苹果酸通过液泡膜的转运
提供了原初动力(Lǜttge 1993)。我们的实验结果
表明在盐和干旱失水的胁迫下 ,叶片液泡膜上的
H
+-ATP 酶的水解活性与质子转运活性均有明显
提高 ,而引起该专性 CAM 植物液泡膜 H+-ATP 酶
活性提高的盐胁迫程度(600 mmol/L 的 NaCl)远
较一般专性 C3 、C4 植物的为高(100 ～ 200 mmol/L
的 NaCl)(Sze 等 1999)。说明 CAM 植物之所以具
备较高的对盐和干旱的耐受能力 ,与其液泡膜上的
H
+-ATP酶在感知环境变化 、积极应答和调节代
谢 、适应环境的过程中所起的关键作用密不可分 。
H
+-ATP 酶活性提高的可能途径只有两个:一
是ATP 水解与 H+转运耦联比率的减小 ,另一途
径是液泡膜上该酶含量的提高 。而我们的实验结
果表明 ,在各种处理条件下 ,该酶的耦联比率基本
上维持在 1∶2 ,没有显著改变 ,说明该酶对逆境的适
4355期　 　　　　夏朝晖等:盐和干旱胁迫对燕子掌(Crassula agenten Thunb.)叶片液泡膜H+-ATPase活性的影响
应并不是通过改变耦联比率来实现的。而半定量
的Western blot鉴定则表明在胁迫后 ,该酶主要亚
基在液泡膜上的含量均有较为明显的增加 。也就
是说 ,酶活的提高是通过膜上酶量的增加而实现
的。而且结果显示调节亚基(B)对胁迫更为敏感 ,
其蛋白含量在 400 mmol/ L 的 NaCl胁迫后即出现
明显增加 ,而此时 A 、c 亚基的蛋白量还基本维持
在原水平 。说明对多亚基的酶蛋白而言 ,在对环境
变化作出反应时 ,其各个组成亚基在蛋白水平上的
变化是不同步的 ,它们应该具有更为复杂的调控机制。
Lǜttge (1993)在以兼性 C3/CAM 植物冰叶日
中花(生长条件良好时行 C3途径 ,逆境诱导下转行
CAM 途径)为材料的研究中 ,曾分析了逆境胁迫下
液泡膜本身膜蛋白和膜脂含量的变化情况 ,发现胁
迫诱导 CAM 途径后 ,膜蛋白含量大量增加 ,但膜
脂含量却基本维持不变 ,整个膜的流动性下降 ,液
泡的贮存能力增强 ,从而能够在液泡中积累更多的
苹果酸 。这在逆境下对植物的正常生理代谢活动
是必需而且关键的。本实验和前人的报告都表明
了盐和干旱胁迫可引起液泡膜 H+-ATP 酶酶量的
增加 。这不仅可以提高跨膜的质子梯度 ,促进苹果
酸的转运 ,还可以帮助维持膜整体的稳定性。本文
的研究结果为从膜水平上揭示 V 型 H+-ATP 酶参
与植物抗逆性调节过程提供了直接的证据。
致谢:美国 University of Mary land 的 Heven Sze教授慷慨惠
赠抗血清。
参 考 文 献
Hurkman WJ , Tanaka CK (1986).Solubilization of plant
membrane protein for analysis by two-dimensional gel
electrophoresis.Plant Physiol , 81:802 ～ 806
Laemmli UK (1970).Cleavage of structural pro tein during
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XC(王学臣)(1997).Identification of plasma mem-
brane of maize roo ts prepared by tw o-phase partition.
Chin Biochem J(生物化学杂志), 6:686 ～ 690(in Chi-
nese)
Effects of Salt and Drought Stress on H+-ATPase in the Tonoplast of
Leaf Cell of Crassula agenten Thunb.
XIA Zhao-Hui1　LI Xiao-Wei2　YU He-Fen1 , 3　CHEN Jia1
(1Key Laborator y o f P lant Physiology and Biochemist ry , Minist ry of Agriculture , 2Collegeo f Basic S cience and Tech nology , Ch ina Agricu ltural
Un iversity , Beijing 100094;3Nat ional Laboratory of Macromolecules , Insti tute of Biophysics , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101)
Abstract:Salt stress(NaCl 600 mmol/L)and
drought stresses could increase the activities of
the H+-ATPase in the tonoplast of leaf cell of
Crassula agenten Thunb.By about 60% and
30%(Fig.1), respectively , but the H+/ sub-
strate stoichiometry w as unchanged(Table 2).
Immunodetection w ith the antibodies
raised against A , B and c subunits of V- H+-
ATPase from oat roots revealed that all the
three subunits increased in protein quantities
under the tw o kinds of st ress(Fig.3).
Key words:H+-ATPase , stress , stoichiometry , tonoplasts ,
Crassula agenten Thunb., CAM
436 Acta Phytophysiologica Sinica 　2000 , 26(5):433～ 436