全 文 ：第 31 卷 第 1 期
2 0 0 0 年 l 月
海 洋 与 湖 沼 V of . 3 1
C ( )EA N O L O G IA E T LI M N O L O G 认 S IN IC A Jan . ,
N O
.
1
2 0 0 0
龙须菜甸旬体类愈伤组织诱导及机制分析 *
樊 扬 李纫芷
(中国科学院海洋研究所 青岛 2 6 6 0 7 1)
提要 采用在人工模拟潮间带生态环境中养殖多年的龙须菜藻体 , 经 70 % 乙醇 、 1% N自C 10
或低光等逆境胁迫后 , 培养新生直立枝 , 研究甸甸体类愈伤组织的诱导及机制 。 结果表明 , 刷
落 2一4 r n l n 长的新生直立枝培养 30 d 后 , 基部出现由丛生丝状体组成的类愈伤组织 。 丝状体
能够固着 、 分化 , 不断分裂形成甸旬体 。 这是除抱子外 , 首次从江篱体细胞获得有固着能力的
再生苗 。 该再生苗弥补了营养枝繁殖中须人工固着的缺点 。 ELI S A 测定内源激素含量结果表
明 : 在不同胁迫下 , 藻体的不同部位内源激素含量发生改变 , 尤其是 A B A 的积累与高等植物
在逆境胁迫中表现相同 , 因而推测类愈伤组织产生及快速分化可能与海藻经逆境胁迫后内源
激素含量变化 、 信息传递有关 。
关键词 龙须菜 类愈伤组织 甸甸体 内源激素 逆境胁迫
学科分类号 5 9 68 . 43
龙须菜属红藻门 、 衫藻 目 、 江篱属 (张峻甫等 , 1 9 7 6) 。 江篱属的海藻是重要大型经济
海藻 , 是提取琼胶的主要原料来源 。 龙须菜由于其分布广 、 生长快 、 产胶量高 、 胶质量好而
被列 为江篱养殖 的首 选 良种 ( s anet l i
e e s e t a l
,
19 5 9 : C iar g i
e e t a l, 19 5 4: iL e r a z
,
198 4)
。 人工养殖江篱因种苗来源 问题始终未获突破性进展 。 随着植物组织培养技术在高
等植物中成功运用 , 利用江篱类愈伤组织诱导成 苗已 成为研究热点 , C h e en y 等 ( 19 86) 、
G川 s e v 等 ( 19 8 7 ) 、 Y an 等 ( 1 9 93) 都作了相关的报道 。 但 以上研究由于诱导率低 、 再生苗生
长缓慢 、 诱导时间长等缺点 , 目前 尚无法在生产上推广应用 。 作者在前期研究中发现 : 以
往被称作 “ 固着器 ” 的龙须菜葡甸体具有很强的抗逆性和再生能力 , 但该部位并不是进行
光合作用的主要部位 (李纫芷 , 19 9 9) 。 本文报道龙须菜葡甸体类愈伤组织诱导及机制分
析的实验结果 , 以期为海藻的组织培养研究提供新思路 。
1 材料与方法
L l 实验材料
龙须菜为在人工模拟潮间带生态环境 的养殖槽内养殖多年藻体 ; 龙须菜成熟的四分
抱子枝 、 囊果枝于 19 9 5 年 9一 1 月采 自青岛湛山湾附近海区 。
L Z 类愈伤组织的诱导
选取人工模拟潮 间带生态环境养殖槽内养殖的健康完整藻体 , 经流动海水冲洗 24 h,
, 山东省 自然科学基金资助项目 , 2 9 14 号 。 樊 扬 , 女 , 出生于 19 7 2年1 1月 , 硕士 , 现在美国 A u s it n大学 , E , m ia l:
伪 n y a n g@ m ial
.
uet
x as .e du
收稿 日期 : 19 9 7一 8一 1 0 , 收修改稿日期 : 19 9 8刃 8一 2 6
30 海 洋 与 湖 沼 31 卷
剔除上部附生可见杂藻 , 消毒海水多次刷洗 , 于室温弱光处静置培养一周 (除特别说明以
外 , 本实验的培养均为 15 . 5℃液体培养 ) 。
L .2 1 化学伤害诱导 取以上干净藻体 , 于 70 % 乙醇浸泡 205 , 经去离子水漂洗 10 而 n,
于 63 O xl 光强培养 ; 或经 1% aN a O 浸泡 巧而 n , 于 同样光强下培养 。 待新生直立枝长至
2一4~ 时
, 从基部与葡甸体相连处刷落培养 。
L .2 2 光诱导 取干净藻体 , 完全切除直立枝部分 , 保留甸甸体 , 于不 同光强下培养 。
新生直立枝处理同上 。
L 3 抱子苗的获得
选用成熟 的四分抱子枝 、 囊果枝 , 经流动海水冲洗 24 h , 消毒海水反复清洗枝条 , 镜检
至无杂藻及附生生物 , 阴干刺激 l h , 滴加培养液 , 于显微镜下用毛细管挑取放散的单个抱
子 , 确保无其它杂藻干扰 , 放人培养瓶培养 , 光强为 630 lx 。
1
.
4 酶联免疫法 (E L IS A )测激素
人工模拟潮间带生态环境下培养的龙须菜藻枝 , 甸甸体 , 光诱导中 Zo lx 光强以下培
养 30 d 的葡旬体和新生直立枝 , 乙醇淡水处理后培养 1d0 的葡旬体各 1 9 , 加人 3m 1 80 % 甲
醇 , 分 3 次研磨提取 、 离心 ( 10 o o o r /m i n , 4 oC , 1 0而 n ) 。 上清液经 s e p一p ak C l s 柱 (w aet r 公
司 )纯化 、 脱色 。 在 40 ℃水浴条件下 , 注人 凡吹干 。 再用 3m l 10 % 甲醇溶解 , 取 .0 6m l 用
于 iP A s 和 GA I / 3测定 ; 另取 0
.
6m l加人重氮甲烷进行甲基化反应后 , 用于 A B A 和 IA A 的测
定 。 iPA s 、 GA
, / 3、 A B A 及
IA
的测定 由南京农业大学提供试剂盒完成 , EL sI A 测读仪检
测 。
2 结果与讨论
.2 1 类愈伤组织的诱导和分化
经化学方法处理后的龙须菜藻体培养 I Od 左右 , 直立枝全部衰退 , 仅保留甸旬体部分
仍为红色 , 一个月后萌发新直立枝 。 培养新直立枝 2一 3 周后 , 基部边界模糊 , 有的细胞膨
大突出 , 不断分裂形成类愈伤组织 (图版 I : 1 、 2) 。 该组织 由单列细胞的丝状体丛生组成 ,
丝状体尖端细胞色素体色泽较深 , 遇可附着基质就能固着 、 分化 , 不断分裂形成扇形 的组
织结构 (图版 I : 3) 。 扇形 的组织继续横 向、 纵向伸展 , 直至与另一些扇形的组织相遇 , 部分
愈合 , 最终形成 圆盘形的葡甸体 (图版 I : 4) 。 当圆盘形 的甸甸体直径达 4~ 时
, 开始萌发
直立枝形成完整的再生苗 。
于 20 lx 光强下培养 的藻体再生直立小枝基部也 出现了与化学诱导相一致的结果 。
即萌发由丝状体组成的类愈伤组织 , 丝状体固着后分化 、 分裂形成葡甸体 。
`本实验所用方法与以往的江篱类愈伤组织诱导相 比 , 具有操作简便 、 无须外加激素和
多糖等物质 、 类愈伤组织诱导率高 、 分化后生长迅速等特点 , 尤其是获得 的再生苗能够固
着 , 在生产上有较大实用性 。 由于海藻的生活环境和组织结构与高等植物相差甚远 , 在进
化史上又具有原始性和遗传上多样性等特征 , 也决定 了海藻类愈伤组织培养与高等植物
相 比应有其独特的一面 。
.2 2 与抱子苗 、 营养枝繁殖比较
由图版 I : 5可以看出 : 类愈伤组织分化的葡旬体生长速度远远超过在同样条件下生长
的抱子苗的甸甸体。 这是本实验获得再生苗的一个最为显著的特征 。 在 630 lx 光强下 , 从
1 期 樊 扬等 : 龙须菜甸甸体类愈伤组织诱导及机制分析 31
丝状体开始到直径达 4~ 的盘状体仅需两个月时间
, 而生长两个月的抱子苗的盘状体还
不到 l r n m 。 而且 , 类愈伤组织再生苗生长快 、 代谢旺盛 , 决定了它具有抱子苗无法相 比的
抗杂藻能力 。 冰冻切 片结果表 明 : 类愈伤组织再生苗与抱子苗在直立枝细胞结构上没有
太大差别 , 但在葡甸体结构上相差较大 。 源 自抱子的葡甸体较厚 , 由多层细胞组成一个紧
密的整体 , 而类愈伤组织分化的甸甸体由 1一 2 层细胞组成 , 扇形组织之间并未完全愈合 ,
葡甸体上有空隙 , 盖上玻片 , 用手轻压 , 两个扇形之间就会分开 , 边界细胞突凹不平 。 这一
结构差别决定了抱子苗脱落时是完全脱落 , 脱落后不能再 固着 , 这也是抱子采苗一直未用
于大面积养殖的诸多原 因之一 ; 而类愈伤组织再生苗由于仅部分脱落 , 余留部分还能继续
生长 , 脱落部分的边界细胞还具有固着能力 , 能够再次固着生长 。 抱子采苗受季节和环境
因子的控制 , 而葡甸体在室 内控制的培养条件下可以长年持续地提供新生直立枝 , 为实现
龙须菜种苗供给工业化生产提供了可能 。
与营养枝繁殖相 比 , 类愈伤组织再生苗的一个显著特点就是能够固着 。 目前 ,江篱人
工养殖最为常用的方法是将营养枝束于绳 、 网等物体上进行养殖 , 费时 、 耗劳力 , 而且保种
需大量营养枝 , 很不经济 ( S an elt ice s , 19 8 9 ) 。 因此 , 养殖 时直立枝若象抱子苗那样 自行附
着 , 收获时仅留甸旬体部分 ,将大大提高实际产量 。
因而 , 类愈伤组织再生苗 由于具有生长快 、 抗杂藻能力强 、 能够 固着 、 不完全脱落等特
征 , 将会是一个非常好的解决江篱种苗来源的待开发途径 。 利用此方法育苗 ,在红藻 门的
娱蛤藻中已有小规模养殖试验成功的报道 (h m a 。 t al , 1995 ) 。
.2 3 类愈伤组织的形成和分化的机制分析
对高等植物的研究结果表明 : 植物对逆境的适应是受遗传性和激素两种因素制约 。 一
般认为 , 植物激素使抗逆基因活化表达 , 从而导致代谢途径发生变化 (潘瑞炽等 , 19 95 ) 。 在
本实验中 , 龙须菜藻体经外界逆境胁迫 , 如化学伤害 、 光抑制等 , 都获得了相同的结果 : 类愈
伤组织的产生 。 作者认为该结果是龙须菜对外界胁迫的一个自身代谢反应 , 可能与内源激
素改变有关 。 利用 E LI S A 检测内源激素含量结果 (表 l) 发现 : 龙须菜藻体不同部位激素含
量不 同 , 相 同部位胁迫处理前后激素含量的确发生改变 。 尤其是葡甸体内 A B A 含量经逆
境胁迫后大幅度增加 , 这结果与 H sr ch 等 ( 19 89) 、 金苹等 ( 19 9 5) 用 EL IS A 检测藻内源 A B A
水平与胁迫条件以及抗逆性 关系的结果一致 。 在高等植物 中 , 大量研究表明 : 植物体内
A B A 含量在不 同逆境条件下都会急剧上升 , A B A 的积累与抗逆性的增强存在显著的正相
关 (李宗霆等 , 19 9 6) 。 A B A 在海藻抗逆性 中可能有着与高等植物相似的作用功能 。
表 1 E L I SA 检测结果
T ab
.
1 1l l e d e et n刀 I n e d 化 s u lst o f E LI S A
项 目 i PA s (p ll l o l / g ) C A ; 23( p m o l / g ) I A A ( Pm of / g ) A B A ( fm o l / g)
正常藻体直立枝
正常藻体甸旬组织
ZO0 lx 光强下再生直立枝
ZO0 lx 光强下培养 30 d甸甸体
乙醇淡水处理后培养 10 d甸甸体
0刀2 1 0 . 8 1 9 1 . 1 5 5
0乃4 8 1 . 3 5 4 1 . 5 34 7 . 7 8 9
0
.
0 3 7 1
.
1 9 9 0
.
4 39
0
.
3 19 0 0
.
8 7 1 0
.
2 8 6
0
.
0 2 3 8 0
.
4 9 7 0 6 3 8
6 1
.
5 2 0
3 6 3 8 9
注 : “一” 表示未测
海 洋 与 湖 沼 3 1卷
日之军娜
1 0 9 1 34 3 15 5 26
光强 / l x
1 59 4
图 1 枝条长度与光强的关系
R g
.
1 T h e re la ti on
s hi P be tw
e e n th a lli le n g th
an d li gh t i
n te n s ity
在低光 ( < ZO0 lx )条件下 , 培养 3 0 d 的
甸甸体中 iPA s 含量增加了 6 . 5倍 , 而 IA A 降
低 .5 4 倍 。 高等植物中一般认为 : 细胞激动
素 ( C K )主要合成部位是根尖及成长中的果
实 、 种子 ; IA A 合成 以嫩叶茎端为 主 。 作者
认为在龙须菜 中可能也有相似的情形 : 甸甸
体合成 C K , 直立枝合成 I A A 。 由图 1可知 ,
龙须菜直立枝生长与光强有很大关系 。 在
20 0 lx 光强以下 , 光明显抑制直立枝的生长 ,
直立枝代谢缓慢 , 也就减慢 了藻枝顶端物质
(如 I A A )合成和运输 , 新生枝基部源 自葡甸
体的信息 (如 iP A S ) 占优势 , 从而长出的类愈伤组织分化形成葡旬体 。 光强适宜时 , 直立枝
生长代谢旺盛 , 加速顶端物质合成和运输 , 新生枝基部就不会分化成葡甸体而是萌发枝
条 。 早在 70 年代 ,人们就已发现 : 光在海藻类愈伤组织诱导中具有很特殊的作用 (张坤诚 ,
19 7 9 )
。
C h ian g ( 19 3) 在低光下培养娱蛤藻 的固着器也获得与本实验相似的结果 。 但光对
海藻的作用机制至今尚无有关方面的研究报道 。
前期的研究结果表 明 : 甸甸体为多年生 , 具有很强的抗逆能力 (李纫芷 , 1 9 9 9) 。 在 自
然界 , 龙须菜的甸甸部分为沙覆盖 , 也就创造了低光条件 。 因此 , 作者认为野生龙须菜种
群扩增除抱子繁殖外 , 可能还存在这种无性繁殖方式 。 由于直立枝体积 、 质量较抱子大 ,
不会被海浪分散太广 , 就能有效地维持 当地高种群密度 , 增加种间竞争力 。 C urz 等 ( 19 96)
在红藻门凹顶藻属的山 ur en ic o p o iet an i中已发现 由直立枝经丝状体生成甸甸体的无性繁
殖方式 , 相信龙须菜为沙覆盖部分的研究也应有所成果 。
实验中发现 : 经化学伤害后培养一段时间获得的新生小枝 , 刷落时长度若超过 s r n们n ,
几乎不再生长类愈伤组织 , 而是直接生枝 。 分析处理后培养 10 d 的甸甸体内源激素发现
IA A
、
iPA
s
、
GA
I / 3都有不 同程度的下降 。 作者认为 : 在没有直立枝提供营养情况下 , 葡旬体
只有依赖 自身的光合作用维持代谢 , 组织 内 C K 不断积累 , 新生枝基部细胞内来 自葡甸体
的 “信息 ” 占优势 , 短期 内能分裂形成类愈伤组织 ; 当直立枝长到相 当长度后 , 逐渐取代葡
甸体成为光合作用主体 , 枝端合成物质向下运输 , 基部细胞也就丧失了生长分化甸甸体的
功能 。 B耐ley 等 ( 19 0) 在海藻 gA a r hd iel la su bu la at 中发现 : 高浓度的 c K 常常抑制藻枝
的萌发 , 这一结果从另一方面支持了本文的观点 。
3 结语
本研究发现 , 诱导龙须菜的新生直立枝产生类愈伤组织并分化形成葡旬体必须具备
如下条件 : 第一 , 藻体要经过一个逆境胁迫 阶段 , 促使内部代谢改变 ;第二 , 新生枝 的基部
细胞原先必须与葡旬体相连 , 这样该细胞既具有下部葡甸体的特性 , 又有上部直立枝提供
营养 , 才能快速固着生长 ;第三 ,新生直立枝的长度不能过长 , 以 2一 4 r n 们n 为宜 。 由于类愈
伤组织分化的葡旬体具有生长迅速 、 抗杂藻能力强 、 不易脱落 、 脱落后能再固着 、 保种容易
等特点 , 为解决龙须菜养殖的苗源间题提供了一条新 的待开发途径 。 至于类愈伤组织诱
导分化机制 , 可能与藻体经逆境胁迫后 内源激素变化有关 。 由于海藻激素的研究较高等
1 期 樊 扬等 : 龙须菜甸甸体类愈伤组织诱导及机制分析 3
植物起步晚 , 有关激素的功能尚未有定论 (vE an s et al , 19 9 1 ) , 因此 , 对于这一机制有待进
一步论证研究 。 本研究运用理化方法处理藻体 , 利用海藻对逆境胁迫的反应 , 诱导新生直
立枝基部与甸甸体相连处细胞生长类愈伤组织并迅速分化成苗 , 再用酶联免疫 (E u S )A
的方法对其机制进行分析 。 这是除从抱子获得葡甸体外 , 国际上首次从江篱体细胞获得
有固着能力再生苗的报道 。 本文采用与以往海藻类愈伤组织诱导完全不同的方法 , 为海
藻的组织培养研究提供了新思路 。
参 考 文 献
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34 海 洋 与 湖 沼 3 1卷
I N D U C T I O N O F C A L L U S尸L IK E T IS SU E F R O M C R E E PI N G T I S S U E
O F G rR才乙陇月尺王月 尤五加叼八理F O吸A 口S (R H O D O P H Y T A )
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A b s tr a e t G r a e ila r ia le ma
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A f te r het al g
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K e y w o r d s G r a e i al r ia le am
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.
4 3