全 文 ：第27卷 , 第12期　 　　　　　　　　　　　光 谱 学 与 光 谱 分 析 Vol.27, No.12 , pp2417-2421
2 0 0 7 年 1 2 月　　　　　　　　　　　 　Spectro scopy and Spectr al Analy sis Decembe r , 2007 　
原位显微红外法检测热胁迫对荒漠植物刺叶墙藓质膜透性的影响
许书军1 , 陈蔚红2 , 陈颖雯1 , 何　明3 , 王　艳1＊
1.上海交通大学环境科学与工程学院 , 上海　200240
2.中国科学院上海有机化学研究所 , 上海　200032
3.上海交通大学农业与生物学院 , 上海　201101
摘　要　利用显微红外光谱法研究了不同生境下的刺叶墙藓质膜结构及其热胁迫耐性机理。从酯酰基 、 碳
氢化合物红外吸收区域分析表明 , 刺叶墙藓野生叶片通过加快组织内部碳氢化合物合成速度 , 减少质膜渗
透性 , 减轻高温对质膜胁迫损伤;室内培养的原丝体和新叶不能及时对热胁迫产生影响。
关键词　耐热性;显微红外;质膜透性;荒漠苔藓
中图分类号:O657.3　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0593(2007)12-2417-05
　收稿日期:2006-05-16 , 修订日期:2006-08-26
　基金项目:国家自然科学基金项目(30371002)资助
　作者简介:许书军 , 1978年生 , 上海交通大学环境科学与工程学院博士研究生　　＊通讯联系人　　e-mail:w angyan 66@sjtu.edu.cn
引　言
　　研究荒漠苔藓植物逆境胁迫适应性机理 , 不仅有助于人
工培育苔藓结皮保护生态环境 , 还可以利用苔藓植物抗逆基
因改良农作物。随着全球环境变化 , 我国西北地区气候正面
临从干热到湿热型转变 , 而且年平均温度以 0.2 ℃增加[ 1] 。
沙漠土壤表层间歇性高温对耐干性苔藓植物在沙漠地区分布
产生选择压力。水合组织在热胁迫超过 40 ℃组织遭受破坏 ,
短时间(30 min 以内)暴露于 42 ～ 51 ℃下将造成大部分苔藓
死亡[ 2] 。刺叶墙藓(Tortula desertorum)是古尔班通古特沙漠
分布相对广泛的耐干性苔藓[3] , 复水生长期间白天沙漠地表
最高温度常超过 40 ℃, 且持续 1 h 以上。刺叶墙藓水合组织
能够从热胁迫中恢复且保持继续生长繁殖 , 对短时间高温表
现出极强适应性 , 但其耐热机理不完全清楚 。
高温胁迫水合苔藓组织的研究常采用测定新芽产量 、叶
绿素含量[ 4] 、色素含量比值[ 5] 、 酶活性[ 6] 、 溶质渗漏[ 7] 、 细
胞破坏率[ 8]和性别差异[ 9]等方法 , 而质膜的研究在植物耐热
性领域尤为重要[ 10] 。傅里叶变换显微红外光谱法(Micro-
FT IR)和计算机辅助解析直接提供有关分子结构的多种信
息 , 研究活体生物组织内部化学成分随环境条件变化规律 ,
可以反映整个代谢过程中化合物的变化 , 在研究逆境对生物
膜组成和结构方面比传统的 Nor the rn blo t和Western blo t前
处理更简单和精确度更高[ 11 , 12] 。同时 Micro-FT IR将光束聚
焦于微小区域 , 不仅减少所需样品用量 , 还可以降低样品中
水干扰 , 是测试生物样品 , 特别是小面积生物组织最好的手
段[ 13] 。利用 FT IR 方法研究膜结构在医学上应用比较广
泛[ 14-17] , 而用于植物组织对环境胁迫响应是近几年国内外研
究热点[ 18 , 19] 。本文选择不同叶龄刺叶墙藓叶片和原丝体 , 通
过红外原位测定糖类和酯类化合物含量变化 , 探讨了短时高
温对水合组织膜透性的影响。
1　材料与方法
1.1　样品采集和培养条件
刺叶墙藓原代配子体采自新疆古尔班通古特沙漠同一块
或者相邻的土壤结皮。配子体经过 48 h 直接水合后 , 按照
Stark[ 20]叶龄划分标准 , 将叶片分为幼叶(1 年生)、 绿叶
(2年生)、黄绿叶(6 年生)、 黄叶(10 年生)。然后叶片移置
于 Knop 固体培养基(1.0 g · L-1 Ca(NO3)2 · 4H2O , 0.25 g
· L-1 KH 2PO4 , 0.12 g · L-1 KCl , 0.25 g · L -1 M gSO4 ·
7H2O 及微量 FeCl3 · 6H2O)室内培养。培养条件设置为湿
度 90%, 光照时间为 14 h· d-1 , 光照强度为 85 ～ 120 μmol
photon·m -2 · s -1 , 昼夜温度为 20 ～ 10 ℃。培养 2 个月后得
到大量次生原丝体(Seconda ry protonema)和次生叶(Second-
ary leaf), 由于原丝体是没有分化的组织 , 所以按叶龄将其
排在次生叶前面。
1.2　样品处理和制备
将不同生长时期水合组织放入水浴锅 , 45 ℃热处理 1 h
后 , 放置在通风橱干燥 48 h , 样品相对含水量控制在0.1 g ·
g -1(干重)以内。干燥后植物组织用金属片压薄 , 厚度 10 ～
15μm , 尽量保证叶片完整。为了比较自然干燥对材料的影
响 , 无干燥处理的叶片用 D2O 浸泡 2 h , 旋转蒸发去表面
D2O 后直接采谱。
1.3　仪器设备与方法
所用仪器为 VARIAN 公司 BIO-RAD FT-185 FT IR Mi-
cr oscope , 内装液氮冷却的窄带 MC T 检测器。将苔藓组织放
置在载物台上 , 以银为反射参比 , 分辨率 4 cm -1 , 150 次扫
描累加。所得光谱是采集谱和现时采集的水汽以及 CO2 谱的
差谱。所有光谱采集面积固定为 150μm×150μm , 每个样品
采集 3 个点 , 重复两个样品 , 结果只显示其中一条代表性光
谱。采用 Bio-Rad自带软件对红外光谱进行傅里叶自解卷积
和二阶导数处理 , 并且进行拟合分峰 , 计算峰面积 , 所有面
积取 6 次测量平均值以减少误差。
2　结果与讨论
2.1　刺叶墙藓红外指纹图谱
图 1为刺叶墙藓原代叶片和次生叶及次生原丝体的红外
吸收光谱。光谱特征表明 , 刺叶墙藓红外光谱在 3 400 cm -1
附近的—OH 和—NH 化学键伸缩振动 , 吸收峰值比较大 ,
说明组织内部含有大量的蛋白质和多糖类。2 928 cm -1附近
为 C— H 伸缩振动带 , 主要是由碳氢化合物引起的。C— H
变角振动吸收位于 1 200 ～ 1 500 cm -1之间 , 往往与其他吸收
峰重叠。蛋白吸收位于 1 658 cm -1(C O , 酰胺 Ⅰ 带)、
1 560 cm -1(N — H , 酰胺Ⅱ带)和 1 260 cm -1(C—N , 酰胺Ⅲ
带)3个区域。1 744 cm-1附近为 COOR特征峰 , 主要表现为
细胞壁胶质和细胞质膜中的酯类化合物。
　　红外指纹图谱归一化处理后计算出的不同叶龄光谱相关
关系(见表 1)表明 , 黄叶与幼叶之间差别最大 , 相关系数只
有 0.84;次生叶和次生原丝体差别最小 , 达到 0.97 , 表明不
同叶龄组织间红外谱图存在显著差异。
　　比较几种不同生长期苔藓组织光谱峰强度可以看出 ,
原丝体红外吸收光谱在中红外区(2 000 ～ 1 000 cm -1)产生较
多吸收峰 , 证明初生组织含有更为丰富的化学组成。原丝体
的酯类(1 744 cm -1)和蛋白酰胺Ⅱ带两个特征峰有最大吸收
强度 , 而叶片谱图中随着叶龄的增加逐渐不明显[ 图 1(a)箭
头所示] , 意味着酯类和蛋白物质在幼龄组织中含量比成熟
组织丰富。特别是在指纹区(1 200～ 700 cm -1), 随着叶龄增
加 , 碳氢化合物种类减少[图 1(b)箭头所示] 。
Fig.1　Absorption(a)and second-derivative(b)FTIR spectra region and in four stages of the desert moss T.desertorum.The ma-
jor chemical constituents in dried protonema are indicated at the top.Number of 1 , 2 , 3 and 4 represent secondary protone-
ma , secondary leaf , juvenile leaf and yellow leaf , respectively. Arrows indicate the dif ference(a)and leaf age increasing
(b)
Table 1　Correlation coefficients of absorption FTIR spectra
in four stages of the desert moss T.desertorum
Yellow
leaf
Juvenile
leaf
Secondary
leaf
Protonem a
Yellow leaf 1
Juveni le leaf 0.837 078 1
Secondary leaf 0.881 922 0.934 652 1
Protonem a 0.930 111 0.928 74 0.973 34 1
2.2　热胁迫对不同复水组织膜透性的影响
在 1 780 ～ 1 720 cm -1可以观察到质膜界面磷脂分子构
象变化的羰基伸缩振动(见图 2)。1 743和 1 728 cm -1分别为
磷酸甘油基上 SN-1 和 SN-2 位点上酯酰键 C O 伸缩振
动[ 11] , SN-1位 C O 靠近疏水环境 , SN-2 位靠近极性区域。
叶片发育阶段对热处理具有不同的响应。次生叶热处理后
1 728 cm -1处峰值大幅度增加 , 表明 SN-2 位 COOH 收缩振
动加剧 , 是由于甘油基骨架取向发生变化引起[ 图 2(a)] 。即
靠近极性区的 C O 增多 , 脂质极性区构象发生变化 , 引起
膜间空隙增大 , 溶质渗透量将会增加。幼叶 SN-1 位点上 CO-
OR热处理后收缩振动加强[ 图 2(b)箭头所示] , 表明细胞膜
内脂质含量增加 , 可以减少细胞空隙 , 对细胞膜起到保护作
用;黄色叶片 SN-1 区域基本没有变化[ 图 2(c)] 。因此 , SN-2
位点 C O 吸收峰值(1 728 cm -1)可作为细胞膜破损程度
2418 光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 27 卷
表征。处理前后比值变化越大 , 说明细胞破损程度越高 , 细
胞膜渗透性越大。用 D 2O 取代组织内部水分测量结果显示 ,
刺叶墙藓各龄叶片酯类吸收峰自然干燥前后差异不显著。说
明高温是引起膜透性改变的主要原因。
Fig.2　Absorpt ion FTIR spectra in the 1 800 to 1 500 cm-1
region of secondary leaf(a), juvenile leaf(b), yellow
leaf(c). Letters a and b represent before and after
thermostress treatment, respectively. Arrows indicate
the change of intensity in ester band at 1 728 cm-1(a)
and 1 743 cm-1(b)after treatment
　　从 45 ℃热处理前后特征峰(1 728 cm -1)的比值(见图 3)
可以看出 , 处理后次生叶细胞膜损伤程度最高 , 膜渗透性处
理前后变化最大;黄绿叶质膜变化最小。特征峰比值与叶龄
显著相关(r=0.89), 即随着叶龄增加 , 热胁迫对刺叶墙藓细
胞膜破坏程度降低。证明在沙漠环境当中 , 长期在干燥/水
合/干燥循环过程中 , 苔藓叶片对干燥和高温同时产生较强
的适应性。而实验室培养所得新芽缺乏野外锻炼 , 从而对高
温比较敏感。从方法上看 , 利用这一结论可以推广至各种逆
境(包括冷 、 渗透 、干燥胁迫)和有毒化学物质对生物膜透性
的影响。
2.3　热胁迫对糖类化合物影响
从刺叶墙藓红外光谱二阶导数图(见图 4)可以看出 , 在
1 200～ 700 cm -1之间存在有 1 158 , 1 106 , 1 066 , 1 026 ,
950 , 913 , 874 cm-1等吸收峰。按照 Yang[ 12] 的方法选择
1 106 cm -1区域为糖类特征峰 , 次生叶在热胁迫后糖类含量
几乎没有变化 , 幼叶则明显增加 , 说明热胁迫过程中幼叶能
够迅速合成大量糖类物质。糖类物质可以与磷脂端氢键结
合 , 稳定细胞骨架[ 21] , 降低质膜结晶转变温度(Tm)[ 22] 。转
变为结晶态后化合物反应速度下降 , 细胞活性降低 , 从而缓
解高温对质膜压力[ 23] 。
2419第 12 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析
　　利用(1 106±6)cm -1峰强度比值作为糖含量变化程度
(见图 5), 比值越大 , 说明糖分增加量越大 , 细胞糖类保护作
Fig.5　Ratio of intensity at characteristic peak in different
aging leaves before and af ter thermostress. The arrow
indicates tissues aging according growth time. Error
bar represents standard deviation(n=6)
用越强 , 从而质膜结构越稳定。原丝体和次生叶热处理后糖
类没有增加 , 相反减少 , 说明其在高温条件下不能及时产生
更多糖类化合物稳定细胞结构 , 增加了碳氢化合物渗漏。四
种叶龄野生叶片糖类热处理后都有所增加 , 而且与生长时间
显著相关(r=0.87)。
3　结　论
　　(1)荒漠苔藓不同叶龄组织红外吸收光谱存在显著差异 ,
次生叶片和黄叶差别最大。
(2)碳氢化合物种类随组织生长时间增加而不断减少。
(3)热胁迫后叶龄间膜透性变化和叶龄显著负相关。
(4)热胁迫后野生叶片糖类增加幅度与叶龄呈正比;室
内培养的原丝体和次生叶片不能启动糖类合成过程。
致谢:感谢上海师范大学曹同教授在物种鉴定和中国科学院
新疆生态与地理研究所张元明研究员样品采集方面给与的帮
助。感谢上海交通大学分析测试中心给与的大力支持。
　
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2420 光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 27 卷
Effects of Thermostress on the Plasma Membrane Permeability of Desert
Moss Tortula desertorum Examined by In-Situ Micro-FTIR Analysis
XU Shu-jun1 , CH EN Wei-hong2 , CH EN Ying-wen1 , HE Ming3 , WANG Yan1＊
1.Schoo l o f Enviroment Science and Enginee ring , Shanghai Jiaotong Univer sity , Shanghai　200240 , China
2.Shanghai Institute o f O rganic Chemistry , Chinese Academy o f Sciences , Shanghai　200032 , China
3.Schoo ls of Ag riculture and Biolo gy , Shanghai Jiao tong Univ ersity , Shanghai　201101 , China
Abstract　A technique based on Fourier tr ansfo rm infrar ed micr oscope (FT-IRM)w as developed to detect the co rre sponding
changes in chemical composition asso ciated w ith thermostress among aging tissues of the desert moss Tortula desertorum.The
results indicated that wild leaves could accele rate the rate of ca rbohydrate synthesis and decrease the permeability of plasma mem-
brane during heating at 45 ℃ for 1 h.Those bio log ical responses can alleviate the damage of heat stress , so called thermoto ler-
ance.And the ability has a po sitiv e rela tion to the leaf age among va rious w ild leaves.Howeve r , the secondary pro tonema and
leaves , cultiva ted in artificial incuba to r , w ere unable to adapt the change of temperature immediately and the permeability of cel-
lular membranes wa s increased.
Keywords　Thermo tolerance;Mic ro-FT IR;Protoplasm membrane pe rmeability;Dese rt moss
(Received May 16 , 2006;accepted Aug.26 , 2006)　　
＊Co rr esponding author
《光谱学与光谱分析》 对来稿英文摘要的要求
　　来稿英文摘要不符合下列要求者 , 本刊要求作者重写 , 这可能要推迟论文发表的时间。
1.请用符合语法的英文 , 要求言简意明 、 确切地论述文章的主要内容 , 突出创新之处 。
2.应拥有与论文同等量的主要信息 , 包括四个要素 , 即研究目的 、 方法 、结果 、结论。其中后两个要
素最重要。有时一个句子即可包含前两个要素 , 例如 “用某种改进的 ICP-AES测量了鱼池水样的痕量铅” 。
但有些情况下 , 英文摘要可包括研究工作的主要对象和范围 , 以及具有情报价值的其他重要信息。在结果
部分最好有定量数据 , 如检测限 、 相对标准偏差等;结论部分最好指出方法或结果的优点和意义 。
3.句型力求简单 , 尽量采用被动式 , 通常应有 2000个印刷字符 , 300个英文单词为宜 , 不能太短;也
不要太长 。用计算机单面隔行打印 。
4.摘要不应有引言中出现的内容 , 换言之 , 摘要中必须写进的内容应尽量避免在引言中出现。摘要也
不要对论文内容作解释和评论 , 不得简单重复题名中已有的信息;不用非公知公用的符号和术语;不用引
文 , 除非该论文证实或否定了他人已发表的论文 。缩略语 、 略称 、 代号 , 除相邻专业的读者也能清楚地理
解外 , 在首次出现时必须加以说明 , 例如用括号写出全称 。
2421第 12 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析