全 文 ：Vol. 34 No. 11
Nov. 2014
第 34 卷 第 11期
2014年 11月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2014-01-12
基金项目：国家自然科学基金项目（31400522）；广西林业科技项目（桂林科字 [2014]第 33号）；广西优良用材林资源培育重点
实验室开放课题基金项目（12A0302）
作者简介：陈博雯（1983-），女，博士研究生，主要从事植物生物技术方面的研究；E-mail：grfi _bwchen@163.com
通讯作者：蒋湘宁（1958-），男，教授，主要从事植物分子生物学方面的研究；E-mail:xiangning_jiang@163.com
桉树是桃金娘科桉属植物的总称，原产地为
澳大利亚，桉树品种多、生长快，其木材工业特
性好，坚韧耐腐，是最常用的制造纸浆的主要原
料 [1-2]。在我国热带、亚热带地区多个省份都种植
有桉树人工林 [3-8]。广西的桉树研究在我国处于领
先地位。20世纪 70年代初期就开始引种，经过
多年的引种试验及杂交选育，得到了多个优良树
种、优良种源及优良家系 [2]，截止 2010年，全区
尾叶桉 GLU4 肉桂酰 -辅酶A还原酶
基因克隆及原核表达
陈博雯 1，2，盖 颖 1，蒋湘宁 1
（1.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083；
2. 广西林科院 广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530002）
摘 要：肉桂酰 -辅酶 A还原酶 (Cinnamoyl Co-A Reductase，CCR)是木质素合成中的关键酶，根据植物中 CCR
保守序列设计引物，以尾叶桉 GLU4嫩茎为材料克隆到其 CCR基因，命名为 EuCCR。该基因 gDNA长 2 918
bp，cDNA长 1 045 bp，CDS区编码 336个氨基酸。EuCCR核酸序列与 GenBank已登录的桉属植物 CCR基因同
源性达到 96%以上，与伞房属、杯果木属植物 CCR的同源性达 85%以上，其编码的氨基酸序列经比对发现具
有完整 FR_SDR_e结构域及 NADP结合位点和底物结合位点，与可可树等植物中 CCR基因编码序列同源性也在
84%以上，确定为 CCR基因。对 EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析，利用MEGA软件对基
因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15系统对 EuCCR进行原核表达，重组质粒成功表达分子量约 36 kD
的目的蛋白。本研究从尾叶桉 GLU4中克隆得到 EuCCR基因并原核表达，为该基因的酶学分析以及利用该基因
转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。
关键词：尾叶桉；肉桂酰 -辅酶 A还原酶；生物信息学分析；原核表达
中图分类号：S792.39 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2014)11-0071-06
Cloning and prokaryotic expression of cinnamoyl Co-A reductase of
Eucalyptus urophylla clone GLU4
CHEN Bo-wen1,2, GAI Ying1, JIANG Xiang-ning1
(1. School of Biology Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Guangxi Key Lab. of Superior
Timber Trees Resource Cultivation, Guangxi Forestry Research Institute, Nanning 530002, Guangxi, China)
Abstract: Cinnamoyl Co-A reductase is a key enzyme in lignin synthesis pathway. A CCR gene was cloned from the immature stem
of Eucalyptus urophylla clone GLU4 and named EuCCR by using specifi c primers based on the highly conserved sequences of plant
CCR. The gDNA and cDNA sequence of EuCCR were 2918 bp and 1045 bp respectively, which CDS encodes 336 amino acid residues.
EuCCR had more than 96% sequence homology with Eucalyptus that had been logged in GenBank, and its homology with Angophora
and Corymbia were over 85%. EuCCR encoding sequence was analyzed, the result shows it has an entire FR_SDR_e domain, a NADP
binding site and a substrate binding site. The homology with Theobroma cacao and others were over 84%. The physicochemical
property, structure of EuCCR and its phylogenetic analysis were analyzed by using bioinformatics tools and MEGA. The SDS-PAGE
analysis showed that EuCCR was transformed into pQE30/M15 system and fusion protein with molecular weighting about 39 kD was
successfully expressed in transformant. The cloning and expression of EuCCR gene provided some effective resources for enzymology
research and further transgenic research.
Key words: Eucalyptus urophylla; Cinnamoyl Co-A reductase; bioinformatics analysis; prokaryotic expression
陈博雯，等：尾叶桉 GLU4肉桂酰 -辅酶 A还原酶基因克隆及原核表达72 第 11期
桉树面积达 2 480万亩，占全区人工商品林面积的
30.5%，居全国第 1位，桉树已经成为短周期原料
林的主要造林树种，在造纸木浆生产中有着极重
要的地位。
木质素是植物细胞壁中的一类苯丙烷类衍生
物，去除木质素是制浆工艺中的重要步骤，直接
关系到整个制浆生产的污染情况和成本高低。利
用转基因技术转化木质素合成途径中的关键酶，
从而降低植物木质素含量，从根本上减少制浆中
都污染成本，是目前的研究热点。肉桂酰 -辅酶 A
还原酶 (Cinnamoyl Co-A Reductase，CCR)催化木
质素单体的生物合成中第一个特定步骤，它将相
应的化合物的 CoA 形式转化为醛的形式。是几种
木质素单体合成途径中的共有酶，对木质素的合
成起重要作用 [9]，是调控木质素合成的首选基因。
尾 叶 桉 GLU4 无 性 系 (Eucalyptus urophylla
clone GLU4)是广西审定的桉树良种，材性适宜造
纸，在广西种植范围广，以此树种作为转基因育
种材料，具有良好的应用前景。本研究以尾叶桉
GLU4无性系为材料，克隆得到 EuCCR 基因，并
对其序列进行生物学分析， 而后对 EuCCR基因进
行原核表达分析，为该基因的酶学分析以及更进
一步利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料为尾叶桉 GLU4无性系 Eucalyptus
urophylla clone GLU4，取自广西林科院生物工程
与技术研究所苗圃。
DNA secure新型植物基因组 DNA提取试剂
盒、RNA prep Pure多糖多酚植物总 RNA提取试
剂盒、质粒提取试剂盒及 DNA纯化、凝胶回收
试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。RNA LA
PCR反转录试剂盒、LA Taq DNA 聚合酶、克隆
载体 pMD-18T购自 TaKaRa公司，限制性内切酶
购 自 Promega 公 司，IPTG、X-Gal、Ampicillin、
kanamycin购自北京索莱宝科技有限公司。E.coli
DH5α、M15菌株及表达载体 PQE30为本实验室
保存。基因扩增引物由北京华大基因生物技术有
限公司合成。
1.2 EuCCR序列 PCR扩增
取移栽培养3～4周的GLU4组培苗茎部组织，
分别按照试剂盒说明书方法提取基因组 DNA和总
RNA，并取总 RNA按照反转录试剂盒方法合成
cDNA，于 -80 ℃保存备用。
在 NCBI检索其他植物中已报道的 CCR基因
序列，blast分析保守区用Vector NTI软件设计引物：
Sense primer CCR-F1: CAATCCCACCATGCC
CGTCG
Anti-sense primer CCR-R1: GTGCGCGCCATG
ATGGATCTAAGATC
分别以 gDNA和 cDNA作为模板，扩增目的
基因的 gDNA片段及 cDNA片段。PCR反应扩增
程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，60 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 3 min（cDNA扩增延伸时间
1 min），28个循环；72 ℃继续延伸 10 min，4 ℃
保存 30 min。
1.3 克隆载体构建
gDNA及 cDNA PCR扩增产物分别经 0.8%琼
脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带凝胶回收后与
pMD-18T载体 16℃连接过夜，转化 E.coli DH5α，
随机挑取 3个阳性克隆用 CCR-F1/CCR-R1引物
PCR验证后，由华大基因生物技术有限公司完成
测序。
1.4 序列生物信息学分析
通过 NCBI搜索引擎中的 Blastn在线工具进行
同源性分析；利用NCBI的ORF Finder寻找阅读框，
完成 DNA序列的翻译 ,并用 Blastp分析蛋白序列
同源性及保守区域、活性位点；利用 Vector NTI
中的 AliginX软件将 gDNA和 cDNA序列测序结
果比对分析外显子和内含子；运用 Expasy网站的
ProtParam完成蛋白序列的氨基酸组成、等电点及
亲疏水性分析；应用丹麦科技大学 (DTU)提供的
TMHMM和 SignalP工具分析序列中的跨膜区和信
号肽；利用ExPaSy中的 psipred分析序列二级结构；
应用 SWISS-MODEL软件对基因氨基酸序列进行
同源三级结构建模并分析；应用MEGA 5.0工具的
ClustalW分析 EuCCR与其他物种中 CCR基因序
列，并采用 Neighbor-Jioning算法构建进化树
1.5 表达载体构建
根据克隆到 pMD-18T载体上的 CCR cDNA
序列，采用 Vector NTI软件设计引物（带有酶切
位点）
Sense primer CCR-F2(BamH Ⅰ ): GGGGGA
73第 34卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
TCCATGCCCGTCGACGCCCTC
Ant i - s ense p r imer CCR-R2(Hind Ⅲ ) :
GGGAAGCTTTCATCCCTGAATACGCAC
PCR扩增 CCR cDNA的 CDS序列，扩增产物
回收后 BamHⅠ /HindⅢ双酶切，同时将 PQE30
质粒 BamHⅠ /HindⅢ双酶切。 37℃酶切 4 h后
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测、回收目的基因片段及
线性 PQE30质粒，用 T4 DNA连接酶 16℃连接过
夜，转化 E.coli DH5α。挑选阳性克隆用 CCR-F2/
CCR-R2引物 PCR验证，并用 BamHⅠ /HindⅢ
双酶切验证。
1.6 原核表达及 SDS-PAGE检测
将验证后的重组质粒转化至 E.coli M15，
Ampicillin、kanamycin双抗性筛选阳性克隆，接
种于 10mL 含 Ampicillin、kanamycin的 LB 液体
培养基，37℃ 200 r/min过夜培养，按 1%接种
量转接至 100 mL LB培养基中 (含 Ampicillin，
kanamycin)，振荡培养 3～ 5 h 至 OD600为 0.4～
0.6，加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，同时设立
不加入 IPTG的处理作为对照。继续振荡培养 4 h，
离心收集菌体，用 1 mL PBS 缓冲溶液悬浮后，超
声波破胞， 离心取 8 μL上清液加入 2 μL 5×上样
缓冲溶液， 混匀后沸水浴 5 min，离心取 5 μL上
清 SDS-PAGE检测。 蛋白条带用考马斯亮兰 R250
染色。
2 结果与分析
2.1 GLU4中 CCR基因克隆
通过 PCR成功的扩增获得长度分别为 3 000
bp、1 000 bp左右的目的片段（见图 1a），与推
测的 CCR基因的 gDNA片段以及 cDNA片段长
度相符，条带清晰无非特异性杂带。目的片段连
接至 pMD-18T载体后挑选阳性克隆用 CCR-F1/
CCR-R1引物进行 PCR 验证，分别得到长度为
3 000 bp和 1 000 bp左右的片段（见图 1b），说
明目的片段已经成功克隆到 pMD-18T载体上，
重组质粒分别命名为 pT-CCR-gDNA和 pT-CCR
-cDNA，各取 3个克隆测序。测序结果显示克隆
得到的 CCR gDNA序列长度 2 918 bp，cDNA序
列长度 1 045 bp。利用 NCBI在线 blast分析，序
列与冈尼桉 (X79566.1)，蓝桉 (AB591264.1)，柳
叶桉 (AF297877.1)，圆果桉 (FJ834288.1)中 CCR
基 因 一 致 性 分 别 为 98%、99%、98%、96%，
与 GenBank 已登录的伞房属、杯果木属植物
的 CCR基因一致性也达到 90%(DQ309047.2)，
89%(EF612728.1)，85%(DQ309061.1)，且序列中
包含有完整 CDS，初步说明克隆所得片段为的
CCR基因，命名为 EuCCR。
(a) EuCCR gDNA片段 PCR扩增；(b) EuCCR cDNA片段 PCR扩增；(c) pT-CCR-gDNA质粒 PCR验证；(d) pT-CCR-cDNA质粒 PCR验证；M为
GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder； 1 为 EuCCR gDNA片段 PCR扩增产物；2为 EuCCR cDNA片段 PCR扩增产物；3、4、5为 pT-CCR-gDNA阳
性克隆质粒 PCR验证产物；6、7、8为 pT-CCR -cDNA阳性克隆质粒 PCR验证产物
图 1 EuCCR基因的克隆
Fig.1 Cloning of EuCCR gene
利用 NCBI 的 ORF Finder 将 EuCCR 基因编
码区翻译氨基酸序列，编码 336个氨基酸，应用
NCBI的 blastp比对分析氨基酸序列，结果显示序
列中包含完整的 FR_SDR_e保守结构域以及NADP
结合位点和底物结合位点 (见图 2b)，FR_SDR_e
属于是 NADP依赖还原酶家族蛋白特有的保守结
构域，在植物黄酮类等次级代谢途径中的异构酶、
还原酶和裂解酶中都含有此结构域，与 CCR酶学
陈博雯，等：尾叶桉 GLU4肉桂酰 -辅酶 A还原酶基因克隆及原核表达74 第 11期
功能相符。氨基酸序列比对表明，EuCCR编码序
列与蓝桉 (AAT74879.1)、柳叶桉 (AAG16242.1)、
冈尼桉 (CAA56103.1)CCR 基因编码序列一致
性 为 99%， 与 异 心 叶 桉 (AAT74875.1)、 圆 果
桉 (ACZ59063.1)、可可树 (EOY26038.1)、橡胶
树 (ADU64758.1)、碧桃 (EMJ16703.1)、毛白杨
(ACE95172.1)、毛果杨 (CAC07424.1)中 CCR基因
编码序列一致性分别为 98%、96%、85%、85%、
84%、84%，进一步证实克隆到的基因序列确实为
CCR基因。
(a) EuCCR外显子与内含子分析 (b)EuCCR编码氨基酸序列保守结构域分析
图 2 EuCCR序列分析
Fig.2 Analysis of EuCCR sequence
使用 Vector NTI中的 AliginX软件将 EuCCR
的 gDNA和 cDNA序列比对，显示基因含有 5个
外显子，4个内含子 (见图 2a)，其中第 4个外显
子和第 4个内含子为基因中最长的外显子和内含
子，这与 Poke文献报道一致 [10]。
2.2 EuCCR序列分析
2.2.1 理化性质及结构预测
利 用 ExPaSy 中 的 Protparam 工 具 分 析
EuCCR编码蛋白序列，结果表明该蛋白由 336个
氨基酸残基组成，分子式为 C1624H2592N434O489S13；
相对分子量为 36.44 kD；理论 pI值为 5.87，为
酸性蛋白；总平均亲水性为 -0.078，不稳定系
数为 30.95，小于 40，推断蛋白质为稳定性蛋
白；从氨基酸组成分析，带负电荷的氨基酸残基
(Asp+Glu)共 41个，带正电荷的氨基酸残基 (Arg
+ Lys)共 36个；综合分析表明该蛋白质是一个带
负电荷的酸性蛋白质。
应用丹麦科技大学 (DTU)提供的 TMHMM在
线分析跨膜区，未发现跨膜结构，SignalP在线分
析结果显示，EuCCR编码蛋白不包含信号肽序列，
说明该蛋白不属于膜蛋白或分泌蛋白，应该是定
位于细胞质基质中，这与该基因的功能定位相符。
利用ExPaSy中的 psipred分析序列二级结构，
显示该蛋白具有 11个 α-螺旋和 11个 β-折叠结构
（见图 3a），运用 SWISS-MODEL对 EuCCR进
行同源三级结构建模。构建范围从第 10个氨基酸
到第 326个氨基酸（见图 3b），其建模参考模板
为葡萄的二氢黄酮醇 -4-还原酶蛋白，该蛋白也
属于 NADP依赖还原酶家族 [11]。目标蛋白与参考
蛋白的序列比对同源性为 76.28%；模型评估Ｅ值
为 0.00e-1，说明此次同源建模可靠性极高，推测
EuCCR具有 NADP依赖的还原酶功能，这与 CCR
的酶学功能符合。
2.2.2 系统进化树分析
在 NCBI 蛋白质数据库检索已登录的 CCR
蛋白质序列，共检索到 920条植物CCR蛋白序列，
选择各科属植物中的 26条序列与 EuCCR进行序
列比对分析。应用 MEGA 5.0 工具的 ClustalW
分析 EuCCR与其他物种 CCR编码蛋白序列同源
性，并采用 Neighbor-Jioning算法构建进化树（见
图 4）。
系统进化分析显示， EuCCR与蓝桉、圆果桉、
柳叶桉等桉属植物中 CCR聚为一类，之后与杯果
木属、伞房属植物 CCR聚为一类，进化分析结果
与分类学相一致。EuCCR与杨属、松属 CCR亲缘
性较远，但同源性也达到 83%和 78%，说明 CCR
在各物种的进化中仍是较为保守的基因，这可能
与 CCR基因在植物生长中的组成型功能有关。
2.3 EuCCR原核表达
采 用 引 物 CCR-F2/CCR-R2， 以 pT-CCR-
cDNA作为模板，PCR扩增 EuCCR的完整 CDS
序列，双酶切连接 pQE30构建重组表达载体，采
用 CCR-F2/CCR-R2引物进行 PCR验证，电泳结
果如图 5a，3个阳性克隆均扩增得到 1 045 bp长
度的片段。将 PCR验证的 3个阳性克隆提取质粒
进行酶切验证，电泳结果如图 5b， 3个阳性克隆
均酶切得到了 3 600 bp左右的载体片段和 1 045 bp
的插入外源片段，说明 EuCCR原核表达重组载体
75第 34卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
(a)EuCCR蛋白质二级结构分析；(b)EuCCR蛋白质三级级结构同源建模
图 3 EuCCR蛋白质结构分析
Fig.3 Protein structure analysis of EuCCR
图 4 EuCCR系统树进化分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of EuCCR
陈博雯，等：尾叶桉 GLU4肉桂酰 -辅酶 A还原酶基因克隆及原核表达76 第 11期
构建成功，命名为 pQE30-EuCCR。
将 pQE30-EuCCR 转 入 表 达 宿 主 M15 中
IPTG诱导原核表达，SDS-PAGE结果如图 6。根
据 EuCCR氨基酸序列预测蛋白质分子量为 36.44
kD，诱导表达后，阳性转化株中出现大小约 36
kD 的蛋白条带，与预期相吻合，未加 IPTG的对
照则没有相应的条带，说明重组质粒经 1.0 mmol/L
IPTG 诱导 3 h 后成功表达目的蛋白。
3 结论与讨论
CCR是木质素合成途径中的关键酶，被认为
是潜在的碳向木质素分配的控制关节点，是调控植
物木质素合成的理想靶标 [12]。通过转基因技术负
调节烟草中 CCR，发现转基因植株中木质素含量
明显降低同时一些非正常的酚类物质增加 [13-14]。部
分反义转化 CCR的转基因植株中，S 与 G 木质
素含量均降低的同时，伴随生长停滞，叶型卷缩，
花期延长，导管变形，木质部有颜色变化等异常
表型，但将 CCR 和 CAD 负调节的单转基因植
物杂交，可以得到木质素含量降低且表型正常的
后代，说明两个基因可能协同作用降低木质素含
量 [15]，也说明木质素含量明显降低的植物至少在
自然条件下可以进行正常的发育。
Poke等 [10]对 23个桉树树种的 CCR基因遗传
进化关系进行研究，测序得到大约44%的CCR基因，
序列只限于内含子 4和部分外显子 4和 5，并未得
到CCR的完整CDS。根据 Poke等提交的序列分析，
其部分外显子序列与本研究中得到 EuCCR具有很
高的一致性，更进一步确定了 EuCCR的可靠性。
本研究利用 RT-PCR技术从尾叶桉 GLU4幼
苗茎部组织中克隆到肉桂酰辅酶 A还原酶基因，
利用多种生物信息学工具通过同源比对、保守序
列及功能位点分析、同源建模、系统进化树构建
等方法对 EuCCR进行序列分析，确定其为尾叶桉
GLU4无性系中的 CCR基因，为下一步构建反义
或 RNAI载体转化植株奠定基础。在本研究中，
通过亚克隆构建原核表达载体对 EuCCR进行原核
表达，得到分子量与预期一致的 CCR蛋白，也为
下一步 EuCCR的酶学活性分析提供了材料。
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(a) pQE30-EuCCR质粒 PCR验证；(b) pQE30-EuCCR质粒酶切验证
M1为 GeneRuler ™ 100 bp Plus DNA Ladder；
1、2、3为 pQE30-EuCCR阳性克隆质粒 PCR验证产物；
4、5、6为 pQE30-EuCCR阳性克隆质粒酶切验证产物；
图 5 pQE30-EuCCR构建
Fig.5 Vector construction of pQE30-EuCCR
M为预染蛋白质MarkerⅢ；1为未加 IPTG诱导结果；
2为 IPTG诱导 3 h结果
图 6 EuCCR基因原核表达 SDS-PAGE结果
Fig.6 Prokaryotic expression SDS-PAGE of EuCCR （下转第 97页）
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[本文编校：吴 毅 ]
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[本文编校：吴 毅 ]
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