全 文 ：新 疆 农 业 大 学 学 报　2009 ,32(4):27 ～ 30
Journal o f Xinj iang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2009)04-0027-04
新疆刺山柑居群的 RAPD多态性研究
石庆华 , 李　杰 , 王希东 , 周桂玲
(新疆农业大学 农业生物技术重点实验室 ,乌鲁木齐　830052)
摘　要:　用 CTAB 法提取了新疆 3 个不同居群刺山柑(Capparis spinosa L.)总 DNA ,使用 RAPD技术对其进行
多态性的研究。从 93 种随机引物中筛选出 3 种扩增较稳定的引物 ,来扩增 3 个不同居群刺山柑总 DNA ,共扩增出
25 条带 ,每种引物扩增出 6 ～ 10 条带;多态性条带共 13 条 , 多态性比例为 52%。利用 DPS 软件所做的统计分析和
聚类分析结果表明 , 3 个群居间相似系数在 0.69～ 0.86之间 , 平均相似系数为 0.76;可聚成 2类:阿克陶和乌鲁木
齐居群刺山柑可聚为 A 类;吐鲁番居群刺山柑可聚为 B 类 ,他们彼此间的遗传变异较小。
关键词:　刺山柑;RAPD;聚类分析;遗传多态性
中图分类号:Q949.748.2　　　　　　文献标识码:A　
RAPD Polymorphism of Capparis spinosa L.
Population from Xinjiang
SHI Qing-hua , LI Jie , WANG Xi-dong , ZHOU Gui-ling
(Key Labo rato ry of Ag ricultural Bio technology , Xinjiang Ag ricultural Universi ty , U rumqi
830052 ,China)
Abstract:　The to tal DNAs w ere ex t racted by CTAB method from three dif fe rent Capparis spinosa L.
Population in Xinjiang and i ts po lymo rphism w as studied based on RAPD method.The three primers ,
which we re more stably ampli fied , were random ly selected f rom 93 primer s.To tal 25 RAPD fragments
were amplified , 13 of w hich w ere polymorphic.Each prime r could generate 6 to 10 DN A fragments.The
percentag e of polymorphic lo ci w as 52%.The results analy zed by DPS version so f tw are show ed that Jac-
card similarity coefficients ranged from 0.69 to 0.86 ,whose mean w as 0.76 , indicating that three the genet-
ic v ariations existed among the three dif ferent Cap paris spinosa L.Population.A dendrogram was estab-
li shed ,based on H ier archical cluster analy sis could divide three dif ferent Cap paris spinosa L .Populat ion
cuhiv ars into 2 g roups , in w hich there w ere smaller g enetic relations.
Key words:　Capparis spinosa L .;RAPD;cluster analy sis;genetic polymorphism
　　刺山柑(Cap paris spinosa L .)为白花菜科山
柑属植物 ,喜生于荒漠和低海拔的石质山坡 ,系蔓生
灌木 ,根粗大 ,皮厚 ,黄白色 ,枝蔓攀援于地面 ,单叶
互生 ,质厚光滑 ,椭圆形 ,叶柄处生有短钩刺 。花单
生叶腋间 ,白色 ,果实呈卵形 ,成熟后内皮赤红 ,种子
饱满 ,深褐色 ,味辛辣 ,其根 、皮 、叶 、果均可入药。刺
山柑在国外主要分布于地中海地带 ,在我国主要分
布于新疆天山南北坡地及西藏等地 ,新疆维医将刺
山柑广泛用于治疗风湿 、肩周炎 、皮炎 、疟疾和利尿
等疾病。地中海国家将刺山柑作为一种传统的草药
用于滋补品 、抗炎 、抗高血压 、降血糖 、治疗痛风 、化
痰 、驱虫 、利尿 、治疗便秘[ 1 , 2] 。
笔者以新疆自然分布的刺山柑为研究对象 ,采
用随机扩增多态性 DNA 方法 , 研究和分析了 3个
不同地区居群的刺山柑遗传多样性 、遗传分化和遗
传距离 ,为新疆野生刺山柑种质资源遗传多样性保
护和利用提供一定的理论参考依据。
收稿日期:2009-04-28
基金项目:国家自然科学基金项目(30660011)
通讯作者:周桂玲 , E-mail:x jzhoug l@yahoo.com.cn
新　疆　农　业　大　学　学　报 2009年　
1　材料和方法
1.1　材 料
刺山柑干燥叶片(采集新鲜的刺山柑叶片在硅
胶中干燥保存),采集样本及凭证标本见表 1。
表 1　不同居群刺山柑叶片
Table 1　The leaves of different Capparis s pinosa L.
居　群 生境 海拔(m) 凭证标本
阿克陶铅锌矿 荒漠 2950 周桂玲 07-54
吐鲁番治沙站 荒漠 -76 王磊 07-145
乌鲁木齐雅玛里克山 荒漠 800 李杰 07-210
　　PCR试剂盒(购自 TIANGEN 公司),CTA B提
取液 ,1%β-巯基乙醇 ,氯仿-异戊醇(24∶1),无水乙
醇 ,1×TA E 缓冲液 , 70%乙醇 , 20 μg/mL TE 缓
冲液 。
1.2　方 法
1.2.1　不同地区居群的刺山柑总 DNA提取
采用 CTAB 法提取总 DNA ,并加以改进 。取
0.02 g 干燥叶片于液氮中研磨成细粉状 ,将细粉转
入1.5 mL 离心管中 ,加入 65 ℃已预热的 CTAB 提
取液 400μL 及 1%β-巯基乙醇 5 μL 摇匀 , 65 ℃恒
温水浴锅中水浴 1 h ,离心取上清液 ,加入等体积的
氯仿-异戊醇(24∶1),12 000 r/min离心 10 m in ,重
复一次此步骤 , 取上清液加 2 倍体积的无水乙醇 ,
于-20 ℃静置 20 min ,沉淀 DNA ,70%乙醇将沉淀
清洗后自然干燥 , TE(20 μg/mL RN ase)溶解保存 。
1.2.2　模板 DNA 检测
模板 DNA 检测:用琼脂糖凝胶电泳法 ,电泳结
果在 Bio-Rad凝胶成像系统紫外观察检测 。用紫外
分光光度计测定提取的 DNA 在 A260/ A280 的比值 ,
确定是否符合试验的要求 。
1.2.3　RAPD-PCR扩增反应体系[ 3]
PCR反应总体积为 25 μL。其中含 10×Buf fer
缓冲液 2.5 μL ,dNTP 2.0 μL ,模板 DNA 1.0 μL ,
随机引物 2.0μL ,2.5 U/μLTaq 酶 0.4 μL ,ddH 2O
17.1 μL ,待反应液混匀后 ,再覆盖 10 μL 液体石蜡
以防混合液蒸发 。PCR扩增仪为 BIOS-PAD型。
1.2.4　PCR反应程序
94 ℃预变性 4 min ,94 ℃变性1 min ,38 ℃退火
30 s ,72 ℃延伸 1 min ,30个循环 , 72 ℃延伸 5 min ,
4 ℃ ∞。
1.2.5　RAPD-PCR引物筛选
利用新疆农业大学植物分子生物学重点实验室
提供的 93条随机引物进行筛选 ,筛选出了 3个条带
清晰 、重复性好 、具有多态性特征的引物进行
RA PD-PCR扩增 ,3个随机引物及序列见表 2 。
表 2　用于 RAPD分析的随机引物及序列
Table 2　Random primers and sequences used for PAPD analysis
引物序号 碱基序列 条带数
71 ACGGGAGCAA 6
88 CTGGGCACGA 10
93 GTCAGAGTCC 9
1.2.6　琼脂糖凝胶电泳
在 1.2.3 RAPD-PCR扩增反应体系条件下扩
增产物在 1.8%(W/V)的琼脂糖凝胶上进行电泳分
离(5 V/cm)。用 250 bp DNA Ladder 作 Marker ,
电泳结束后 ,用溴化乙锭(EB)染色 20 min ,取出后
放入 Bio-Rad凝胶成像系统进行图像采集 。
1.2.7　记录结果
根据凝胶成像系统采集的试验结果 , 将每条
DNA 迁移率相同的条带作为同源条带处理 ,有带的
记录为 1 ,无带记录为 0 ,进行统计处理 。
2　结果与分析
2.1　刺山柑总 DNA 的检测[ 4]
取 3个不同地区居群的刺山柑 DNA 各 10μL ,
琼脂糖凝胶电泳检测结果(图 1)。
图 1　C TAB 法提取刺山柑总 DNA 的电泳结果
Fig.1　Electrophoresis result of the extracted Ca pparis spi-
nosa L.DNA by CTAB method on 1.8% agarose
图 1结果显示用 CTAB法提取的 DNA 电泳条
带清晰 ,无明显降解 ,纯度高 ,可应用于 PCR扩增 。
紫外分光光度计测定结果显示 , 3 个不同地区
居群的刺山柑总 DNA 在紫外分光光度计 A260/A280
下的检测结果说明OD 260/ OD 280均在1.85以上 ,可
用于 PCR扩增 。
2.2　RAPD-PCR扩增反应结果分析[ 5]
刺山柑总 DNA RAPD-PCR扩增结果见图 2 、
图 3 、图 4。从 93条引物中筛选出的 3对引物(表 4)
对不同地区居群的刺山柑总 DNA 进行 RAPD-PCR
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　第 4 期 石庆华 ,等:新疆刺山柑居群的 RAPD多态性研究
进行扩增 ,扩增产物统计结果见表 3。
表 3　RAPD 扩增产物结果
Table 3　Statistical results of amplified product by RAPD
引物 序列 等位变异数
多态性
条带数
多态性信息
量 P IC(%)
71 ACGGGAGCAA 6 5 83.3
88 CTGGGCACGA 10 1 10.0
93 GTCAGAGTCC 9 7 77.8
　　RAPD扩增多态性分析[ 6] , 3 对引物共扩增出
25条带 ,其中不同地区居群间共有条带数为 12 ,多
态性条带数为 13 ,多态性比例 52%。每对引物扩增
出的条带数为 6 ～ 10 ,平均为 8.3条。引物(71)共
出现 6条带 ,其中多肽性条带 5条;引物(88)共出现
10条带 ,其中多态性条带 1条;引物(93)共出现 9
条带 ,其中多态性条带 7条 。
M.Marke r;1.乌鲁木齐居群;2.阿克陶居群;3.吐鲁番居群
图 2　引物(71)扩增结果 图 3　引物(88)扩增结果 图 4　引物(93)扩增结果
Fig.2　Amplified result of primer(71) Fig.3　Amplified result of primer(88) Fig.4　Amplified result of primer(93)
2.3　聚类分析
根据 3个引物扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳出
现的条带数 ,使用 DPS 软件的聚类方法进行分析 ,
建立不同地区居群间的聚类图[ 7] (图 5)。运用 Jac-
card方法计算样品间的相似系数并进行遗传相似性
的统计分析 ,乌鲁木齐居群与阿克陶居群和吐鲁番
居群的遗传相似系数分别为 0.86 与 0.69 ,阿克陶
居群与吐鲁番居群的相似系数为 0.73。
图 5　3 个不同居群刺山柑的 RAPD聚类树状图
Fig.5 　Oenarogram of 3 dif ferent Capparis spinosa L.by
RAPD
2.4　不同地区居群的鉴定[ 8]
根据 1.2.7试验结果记录 ,对 3个不同地区居
群刺山柑进行鉴定。从 3 个引物扩增结果可以看
到 ,引物(71)扩增出的条带就可以区别 3个不同地
区居群刺山柑(图 2),乌鲁木齐居群的刺山柑有 5
条多态性的条带;南疆阿克陶地区居群的刺山柑只
有一条多态性的条带;吐鲁番地区居群的刺山柑没
有出现多态性的条带 。其他两个引物扩增出 DNA
条带的试验结果多态性能差异不显著 ,因此对不同
地区居群的刺山柑区分无参考价值。
3　讨 论
3.1　不同地区居群的刺山柑的 DNA 的提取
本实验采用 CTAB 法提取总 DNA , 并加以改
进。DNA 电泳结果显示一条带 ,且条带清晰 ,无明
显的降解 ,纯度高 。经紫外检测符合要求 ,能够用于
RA PD分子标记 。在进行选择 DNA 提取方法时要
考虑到样品的来源 、产地和样品本身的结构特点 ,只
有这样才能在试验中得到一定纯度的基因组 DNA ,
否则将无法进行分子标记研究。
3.2　RAPD分子标记技术
RAPD(Random Amplified Polymo rphic DNA ,
随机扩增多态性 DNA)分子标记自 1990 年问世以
来 ,以其简便 、快速 、经济的优点被广泛应用于遗传
多样性和保护生物学中 ,在检测 、确定物种或种群内
的基因结构组成 、变异及其种间的遗传和进化关系
方面 ,显示出了巨大的潜力[ 11] 。本试验选用 RAPD
标记技术对不同地区居群的刺山柑进行遗传多样性
分析 。从试验结果可以得到:3 种不同居群的刺山
柑由于来源不同 , 海拔高度分别为 2 950 , -76 ,
800 m ;地理分布为南疆阿克陶地区 、吐鲁番地区和
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新　疆　农　业　大　学　学　报 2009年　
乌鲁木齐地区 ,受环境因素和自然条件的影响 3 种
不同居群的刺山柑从形态特征上没有出现较为明显
的变化。但是 ,其在基因水平上则表现出了一定的
特征。用 3个引物进行 RAPD 分子标记 , DNA 条
带出现了多态性 。扩增出的 DNA 谱带共计 25条 ,
其中多态性标记占 13条 ,多态性指数达 52%,表现
出了较高的多态性 。从聚类树状图中可以看出 ,平
均相似系数为 0.76 ,3种不同居群的刺山柑 ,南疆阿
克陶居群和乌鲁木齐居群聚为 A 群 ,吐鲁番居群聚
为 B群。遗传相似系数分析 3个不同居群刺山柑
相似系数在 0.69 ～ 0.86 。实验结果说明 RAPD 分
子标记技术能够从遗传多样性方面鉴定不同居群的
刺山柑。
4　小 结
本研究用 RAPD分子标记技术对不同居群的
刺山柑基因组 DNA 进行了多态性扩增 ,扩增结果
进行聚类分析和遗传相似系数分析 ,能够区分 3种
不同地区居群的刺山柑 ,为野生刺山柑自然群落的
保护和开发利用提供了一定的参考依据。其次所选
3种不同地区居群的刺山柑聚类分析结果为什么不
是按照南疆地区居群和北疆地区居群则有待于进一
步的研究 。
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