全 文 ：濒危植物大花杓兰种子离体培养条件初探
朴仁哲1，王艳丽2，赵洪颜1 (1．延边大学农学院，吉林延吉 133002;2．汪清县农业局，吉林汪清 133200)
摘要 ［目的］该研究旨在探讨野生大花杓兰种子人工大量繁殖的培养条件。［方法］以大花杓兰半成熟种子为试验材料，对其在无菌
条件下的萌发进行了研究。［结果］结果表明，0． 5%的 NaClO预处理种子 160 min，pH 5． 8 及添加 0． 5 mg /L 6-BA和马铃薯浸提物的
Harvais培养基是大花杓兰种子无菌萌发的最佳培养条件。［结论］该研究为大花杓兰种子的组培繁殖提供依据。
关键词 大花杓兰;种子;离体培养
中图分类号 S567． 23 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)30 －18428 －02
Preliminary Exploration on In Vitro Seed Culture Conditions of Cypripedium macranthos Sw
PIAO Ren-zhe et al (College of Agriculture，Yanbian University，Yanji Jinlin 133002)
Abstract ［Objective］ This study aimed to investigate the culture conditions for artificial mass propagation of wild Cypripedium macranthos
seeds． ［Method］Semi-mature seeds of Cypripedium macranthos were used as test materials for study the germination under sterile conditions．
［Result］The results showed that the optimal culture conditions for sterile germination of Cypripedium macranthos seeds were pretreatment with 0．
5% of NaClO for 160 min，pH 5． 8 and using Harvais medium containing 0． 5 mg /L of 6-BA and potato extracts． ［Conclusion］This research had
provided basis for tissue culture and propagation of Cypripedium macranthos seeds．
Key words Cypripedium macranthos Sw．;Seeds;In vitro culture
基金项目 延边大学州校合作项目(延大科合字［2005］第 02 号)。
作者简介 朴仁哲(1964 － ) ，男，朝鲜族，吉林延边人，教授，从事药用
植物栽培学与植物逆境生理研究，E-mail:piaorz@ yahoo．
com． cn。
收稿日期 2011-09-27
大花杓兰为兰科杓兰属(Cypripedium L．)多年生草本植
物。野生的大花杓兰融观赏、绿化、药用为一体，是一类具有
很高经济价值的植物［1］，主要分布在我国东北、内蒙古、河北
和山西等地，以及朝鲜、日本和欧洲等。由于长期的滥采乱挖
严重破坏了大花杓兰的种群，现今野生大花杓兰的数量正在明
显下降，并且已被列入国家二级保护名录［2］。因此，保护这些
珍贵的野生大花杓兰种质资源势在必行。种子人工大量无菌
繁殖是保护野生杓兰资源的重要手段之一［3 －4］。现有的报道
仅对野生大花杓兰的资源调查、生物学特性和种胚进行了研
究［5 －8］，王艳丽等［9］曾对大花杓兰组织培养和快速繁殖进行了
报道。为此，笔者以大花杓兰半成熟(人工辅助授粉 13周后)
种子为试验材料，对其在无菌条件下的萌发进行研究，旨在探
讨野生大花杓兰种子人工大量繁殖的培养条件。
1 材料与方法
1． 1 种子来源 选取长白山区移栽 2 年的野生大花杓兰
(Cypripedium macranthos Sw．) ，在人工辅助授粉 13 周后，采
集黄绿色未开裂的蒴果。
1． 2 种子处理方法 首先在超净工作台内将蒴果用 75%的
酒精处理 30 s，无菌水冲洗 3 ～ 5 次，然后将种子用 0． 5%的
NaClO溶液浸泡 10 min(种子预处理实验除外) ，无菌水冲洗
3 ～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，播于培养基表面。
培养基试验中的改良型 Harvais培养基(简称 cHa)［3］，是在
Harvais培养基［10］的基础上去除 NH4NO3，添加 2． 0 mg /L甘
氨酸、100 mg /L谷氨酰胺和 500 mg /L络蛋白水解物。除培
养基试验外，其他试验所用培养基均为 Harvais 培养基。除
激素试验外，各试验培养基中均添加 6-BA 1． 0 mg /L。除 pH
试验外，各试验中培养基的 pH均为 5． 8，每一试验梯度处理
培养基 40 ml，分装在 3 个培养瓶中，每瓶约播种子 50 颗，3
次重复，黑暗中(23 ± 2)℃培养。每隔 4 周统计一次种子萌
发率。萌发率 =种子萌发数 /播种数 × 100%，种子萌发以原
球茎突破种皮为标准。
1． 3 数据处理方法 采用 DPS软件进行数据处理。
2 结果与分析
2． 1 种子预处理对大花杓兰种子萌发的影响 由图 1 可看
出，大花杓兰的种子在各个处理时间都有萌发现象，种子的
萌发率随 0． 5%的 NaClO处理时间的增加处于波动状态，但
能明显看出处理 160 min 萌发率最高，可见 0． 5%的 NaClO
处理时间对大花杓兰种子的萌发率有一定影响。原因是由
于 NaClO是一种氧化性和腐蚀性都很强的化学物质，可使种
皮透水透气，从而促进种子萌发［3，10］。
图 1 种子预处理时间对大花杓兰种子萌发的影响
Fig． 1 Effects of pretreatments on seed germination of Cypripe-
dium macranthos Sw．
表 1 培养基种类对大花杓兰种子萌发的影响
Table1 Effects of medium types on seed germination of Cypripedium
macranthos Sw．
培养基种类
Medium
types
萌发数量
Number of
germination
生物重量
Biological
weight∥mg
萌发率
Germination
rate∥%
Ha 34． 19 a 337． 81a 68． 00
VWD 20． 01 b 205． 04 ab 38． 67
cHa 11． 73 bc 158． 40 abc 23． 33
MS 4． 49 cd 65． 08 bc 8． 67
花宝一号 0． 00 d 0． 00 c 0． 00
注:不同小写字母表示差异显著(P≤0． 05)。
Note:Different lowercase letters indicated significant differences(P≤0． 05)．
2． 2 不同培养基对大花杓兰种子萌发的影响 由表 1 可看
出，不同培养基种类对萌发数量和生物重量之间的影响存在
责任编辑 范晓慧 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(30):18428 － 18429，18445
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.30.219
显著差异，大花杓兰种子的萌发数量最多、生物重量最大和
图 2 培养 180 d后培养基种类对大花杓兰增殖的影响
Fig． 2 Effects of medium types on multiplication of Cypripedium
macranthos Sw． after 180 d
图 3 各种添加物对大花杓兰种子萌发的影响
Fig． 3 Effects of various additives on seed germination of Cypri-
pedium macranthos Sw．
萌发率最高的培养基是 Harvais培养基，其他从高到低顺序
依次为 VWD［11］、CHa和MS培养基［12］;花宝一号培养基未见
萌发现象。说明大花杓兰种子萌发的最适宜培养基是 Har-
vais培养基。大花杓兰种子于不同种类培养基播种 180 d后
的增殖现象同样证明了上述结论(图 2)。
2． 3 添加物对大花杓兰种子萌发的影响 由图 3 可知，培
养基中添加马铃薯和苹果浸提物后对大花杓兰种子的萌发
有促进作用，其中添加马铃薯浸提物的培养基促进种子萌发
效果明显，苹果次之，添加香蕉浸提物、酪蛋白以及无添加物
的培养基对种子萌发都没有影响。总体而言，大花杓兰种子
的萌发成功与否，与不同的添加物有着密切的关系。
图 4 不同 pH对大花杓兰种子萌发的影响
Fig． 4 Effects of different pH on seed germination of Cypripedi-
um macranthos Sw．
图 5 不同 pH值对大花杓兰增殖的影响
Fig． 5 Effects of different pH value on multiplication of Cypripedium macranthos Sw．
图 6 不同激素处理对大花杓兰种子萌发的影响
Fig． 6 Effects of different phytohormone on seed germination of
Cypripedium macranthos Sw．
2． 4 pH对大花杓兰种子萌发的影响 大花杓兰的种子在
各个 pH处理都有萌发现象，pH5． 8 处理的种子萌发效果十
分明显，种子的萌发率最高，pH5． 5 处理的种子萌发率也有
明显的上升趋势，pH4． 9、pH5． 2、pH6． 1、pH6． 4、pH6． 7、
pH7． 0等处理种子也都有萌发现象，但效果并不明显(图 4)。
从原球茎后期生长可看出(图 5) ，pH5． 8 处理明显好于其他
处理，pH5． 5和 pH6． 1 处理中的生长也比较健壮，所以在大
花杓兰的种子组培繁殖过程中建议采用的 pH为 5． 5 ～5． 8。
2． 5 激素种类和浓度对大花杓兰种子萌发的影响 由图 6
可看出，添加6-BA和 KT的培养基对大花杓兰种子萌发效果
有明显的促进作用，6-BA和 KT处理浓度为 0． 5 mg /L的促
(下转第 18445页)
9248139 卷 30 期 朴仁哲等 濒危植物大花杓兰种子离体培养条件初探
NAA处理的山葡萄总花色苷含量均与对照达到 0． 01水平上
的显著差异(LSD0． 01 = 3)。6-BA 对山葡萄总花色苷积累有
极显著促进作用，有利于山葡萄果实着色;NAA对山葡萄总
花色苷积累有极显著抑制作用，不利于山葡萄果实着色。
2． 4 NAA 和 6-BA 对山葡萄花青素-3-葡萄糖苷含量的影
响 由图4可见，样品中保留时间7． 216、7． 220、7． 230 min与
标准品花青素-3-葡萄糖苷的保留时间 7． 200 min比较接近，
可以断定对应的峰为花青素-3-葡萄糖苷。
由图 5可见，转色后随着花青素-3-葡萄糖苷逐渐积累，
处理与对照果皮中花青素-3-葡萄糖苷含量均呈上升趋势。
6-BA处理的花青素-3-葡萄糖苷含量明显高于对照，说明
6-BA可提高山葡萄果皮中花青素-3-葡萄糖苷含量，有利于山
葡萄着色;NAA 处理的花青素-3-葡萄糖苷含量明显低于对
照，说明 NAA可抑制山葡萄果皮中花青素-3-葡萄糖苷含量
的积累。不利于山葡萄着色。
图 5 NAA和 6-BA对山葡萄花青素-3-葡萄糖苷含量的影响
Fig． 5 Effects of NAA and 6-BA on anthocyanin-3-glucoside
content
3 结论与讨论
在转色期喷施 6-BA，不仅可以促进山葡萄可溶性固形
物的积累，而且还可以促进山葡萄果实有机酸降解，而喷施
NAA会抑制山葡萄果实有机酸降解和可溶性固形物的积累。
虽然影响花色苷生成的环境因素很多，但在相同条件下，喷
施 6-BA可以促进花色苷积累，喷施 NAA 却会抑制花色苷
积累。
试验只对 6-BA和 NAA应用于“双红”山葡萄进行了初
步探究，在试验过程中，由于试验条件的限制和人为处理的
影响，使得试验结果与前人的研究成果有一定的偏差［10 －13］。
可能是由于外源激素处理的时间不同、气候差异、葡萄品种
不同、处理时果穗大小和着生方向不一致以及试验操作带来
的误差等多方面原因造成的。
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2004．
(上接第 18429页)
进效果明显好于其他处理浓度，6-BA处理优于 KT处理。这
说明处理浓度为 0． 5 mg /L的 6-BA 最适合大花杓兰种子无
菌萌发。
3 结论
笔者以大花杓兰资源丰富的种子为研究对象，利用离体
培养方法，进行大花杓兰人工大量繁殖，从而达到保护大花
杓兰种质资源的目的。结果表明 0． 5%的 NaClO 溶液处理
160 min种子的萌发率最高，最适宜培养基是 Harvais 培养
基，种子组培繁殖过程中适宜 pH为5． 5 ～5． 8，添加处理浓度
为 0． 5 mg /L的 6-BA最适合大花杓兰种子无菌萌发。
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