全 文 :果 树 学 报 2010,27(6): 918~923
Journal of Fruit Science
新疆野扁桃种质资源遗传多样性的 ISSR分析
吕志江 1,李 疆 2,吾买尔夏提·塔汉 3,曾 斌 2,罗淑萍 1*
(1新疆农业大学农学院,2新疆农业大学林学与园艺学院, 3新疆农业大学草业与资环学院,乌鲁木齐 830052)
摘 要: 采用 ISSR 分子标记技术,对中国新疆分布的野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)5 个居群共 120 个个
体的遗传多样性进行了研究。 9 条引物共检测到 114 个位点,其中 105 个为多态位点。 在物种水平上,野扁桃的多态
位点百分率为 92.1%,Nei’s 基因多样度(h)为 0.280 9,Shannon 信息指数(I)为 0.432 7;在居群水平上,多态位点百分
率平均为 50.7%,Nei’s 基因多样度(h)平均为 0.206 2,Shannon 信息指数(I)平均为 0.299 9。 基于 Nei’s 遗传多样性
分析得出的居群间遗传分化系数 Gst=0.266 0,表明有 26.6%的遗传变异存在于居群之间。 居群间的遗传一致度平均
为 0.896 4,估测的居群间基因流(Nm)为 1.379 4,可以认为 5 个野扁桃居群间基因流畅通,与 Nei’s 多样性指数揭示
的大部分遗传变异存在于居群内是一致的。 根据 Nei’s 遗传距离对不同居群进行 UPGMA 聚类分析显示居群间的遗
传距离与居群的地理距离之间没有显著的相关性。 基于试验分析结果,野扁桃种质资源保护和利用的策略为在优先
保护现有群体的基础上,加强筛选和保存居群内的变异单株。
关键词: 新疆野扁桃; 遗传多样性; 群体遗传结构; ISSR
中图分类号:S662.9 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2010)06-918-06
ISSR analysis for genetic diversity of Amygdalus ledebouriana germplasm
from Xinjiang, China
L譈 Zhi-jiang1, LI Jiang2, Omir shat Tahan3,ZENG Bin2, LUO Shu-ping1*
(1College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi, Xinjiang 830052 China; 2College of Forest Science and Horticulture,
Xinjiang Agricultural University, Urumqi, Xinjiang 830052 China; 3College of Prataculture and Environment Science,Xinjiang Agricultural
University,Urumqi,Xinjiang 830052 China)
Abstract: The genetic diversity of 120 Amygdalus ledebouriana Schlecht. individuals from 5 populations in Xinjiang was in-
vestigated by using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. 114 bands were amplified by 9 informative and reliable
primers, of which 105 were polymorphic loci. At species level, percentage of polymorphic loci (PPL) were 92.1%, Nei’s
gene diversity(h)equaled to 0.280 9, Shannon’s Information index(I)was 0.432 7. At population level, the average value of
PPL was 50.7%, the mean value of h amounted to 0.206 2, the general average of I was 0.299 9. Genetic coefficient of differ-
entiation(Gst) among populations based Nei’s gene diversity equaled to 0.266 0,which showed 26.6% genetic variation exist-
ed among 5 populations. The mean value of Nei’s genetic identity equaled to 0.896 4, estimate of gene flow from Gst(Nm)
was 1.379 4, which could be considered that gene flow was unblocked among 5 populations, and the result was uniform with
that obtained by using Nei’s gene diversity. UPGMA dendrogram based Nei’s genetic distance showed that genetic distance
among populations did not have significant correlation with geographic distance. The conclusion showed that germplasm pro-
tection and exploitation strategies of Amygdalus ledebouriana Schlecht should give priority to available population, especial-
ly, and strengthen the screening and reserve the mutation.
Key words: Amygdalus ledebouriana Schlecht.; Genetic diversity; Population genetic structure; ISSR marker
野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)又叫
野巴旦杏,为落叶灌木,属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚
属植物。野扁桃原产于欧洲东南部和亚洲中西部,在
欧洲已成为化石, 现今只在哈萨克斯坦和我国有天
然分布, 是珍贵的古地中海第三纪中新世的孑遗落
叶林树种,有“植物活化石”之称[1]。
野扁桃是多年生速生、抗旱、耐寒、抗盐碱、抗风
蚀的油料兼药用经济树种, 并且可作为防护林带矮
收稿日期: 2010-03-08 接受日期: 2010-06-30
基金项目: 国家自然科学基金项目(30760205);国家十一五科技支撑项目(2007BAD36B01-3);新疆教育厅高校科研计划重点项目(XJE-
DU2006I26)
作者简介: 吕志江,男,在读硕士生,研究方向为分子生物学。 E-mail: lvzhijiang12235@126.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence. Tel: 15999121861,E-mail: luoshuping2008@163.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2010.06.033
表 1 5 个野扁桃居群信息
Table 1 Information of populations of Amygdalus ledebouriana Schlecht.
居群
Population
采样数
Sample size
海拔
Altitude/m
纬度
Latitude
经度
Longitude
采样地
Location
布尔津
Burqin
哈巴河
Habahe
塔城
Tacheng
托里
Tuoli
裕民
Yumin
24
24
24
24
24
1 224
1 025
1 197
870
1 199
48°11′
48°18′
47°03′
46°09′
45°54′
87°06′
86°34′
83°01′
83°33′
82°30′
阿尔泰山西南部山麓(布尔津县境内)
South-western foothills of Altai mountain(Burqin County)
阿尔泰山西北部孔敦林山麓(哈巴河县境内)
Nouth-western Kong Dun-lin foothills of Altai mountain(Habahe County)
塔尔巴哈台山东部(塔城市境内)
East of Tarbagatay range(Tacheng city)
巴尔鲁克山东部(托里县境内)
East of Baerluke Hill(Tuoli County)
巴尔鲁克山西部(裕民县境内)
West of Baerluke Hill(Yumin County)
生配置树种,是选育扁桃及其近缘和远缘作物抗寒、
抗旱杂交新品种及矮化砧木类型的优良原始材料[2]。
因此,加强对新疆野扁桃资源的搜集、保存与利用具
有重要意义。近年来,随着畜群的扩大和无控制的放
牧,造成了草、灌植被的严重破坏,对野扁桃的生存
带来了很大的威胁。 目前野扁桃因不适应现代生境
的变化,正处于衰退阶段,面积在逐渐缩小。 巴尔鲁
克山的野扁桃分布区, 也曾多次遭受火灾危害。 因
此,加强对新疆野扁桃的保护迫在眉睫[2]。
新疆野扁桃的研究还处于起步阶段, 主要在生
物学特性观测[3]和繁殖生物学特性研究 [4]方面,引种
驯化和保护方面的研究还处于调查阶段, 居群遗传
多样性和遗传变异研究在表型水平进行, 分子水平
只有 SSR 分子标记对新疆野扁桃和扁桃属植物种
质资源亲缘关系进行了分析研究[5]。
ISSR 又称简单重复序列区间,此分子标记技术
具有 DNA 样品用量少,操作简单,无需预先知道基
因组 DNA 序列,结果记录方便,试验成本低,重复性
好,能提供丰富的关于基因组的信息等优点,已广泛
用于遗传多样性分析 [6-7]、绘制 DNA 指纹图谱 [8]、品
种鉴定、进化及分子生态学研究中[9]。
我们拟采用 ISSR 分子标记技术对新疆野生扁
桃居群进行研究, 探讨其居群遗传多样性水平和遗
传结构, 旨在从分子水平上对野扁桃种质资源进行
评价,为进一步丰富新疆野生果树的起源演化理论,
科学保护和合理开发利用野扁桃种质资源、 改良栽
培种及选育抗逆新品种提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 植物材料
材料采集于新疆维吾尔自治区境内共 5 个居群
120 个样本。 在每个天然分布群体内按不同海拔高
度(每 100~200 m)设置样点,在每个天然分布群体
内随机选取 24 个树龄相近的单株树进行野外调查
和采样,株间距离至少 50 m。 分别采集幼叶,硅胶干
燥后室温下保存。记录各居群的海拔、经纬度(表1)。
1.2 基因组 DNA的提取
新疆野扁桃基因组 DNA 的提取采用 CTAB
法 [10],并在原始方法的基础上加以改进。采用洗脱液
(0.35 mol·L-1葡萄糖,0.1 mol·L-1 Tris,0.005 mol·L-1
EDTA,2% PVP40)对样品进行处理,离心弃上清后
再加入 3% CTAB 裂解缓冲液进行细胞裂解。提取的
DNA 稀释到 30 mg·L-1备用。
1.3 ISSR引物筛选与 PCR扩增
试验所用的 100 个 ISSR 引物参照加拿大哥伦
比亚大学 UBC 公司公布的第 9 套引物序列,由上海
生工生物技术服务有限公司合成。 参照罗淑萍等[11]
的方法设计试验体系。
在 25 μL ISSR 反应体系中包含有 1 μL 模板
DNA (30 ng),1 μL 引物 (10 μmol·L-1),0.3 μL Taq
DNA聚合酶(2.5 U·μL-1),0.4μL dNTPs(10mmol·L-1),
2.5 μL 10×Buffer(15 mmol·L-1 MgCl2),其余部分由
ddH2O补足。
PCR 反应在 TProfessional 热循环仪(Biometra)
上进行, 扩增程序为: 94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性
45 s,X ℃(引物的不同, 退火温度不同) 复性 45 s,
72 ℃延伸 90 s, 循环 40 次;72 ℃延伸 7 min,4 ℃保
存。 扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测,EB 染色
后,凝胶成像系统(BIO-RAD)紫外成像观察,并记
录结果。
1.4 数据统计分析
对 ISSR扩增图谱中的条带进行谱带统计,有带
的记为“1”,无带记为“0”,并输入计算机,构成 0/1
数据矩阵。 应用 POPGENE 软件在假定种群处于
Hardy-Weinberg 平衡状态下,对全部居群和各单个
居群分别进行遗传参数分析。 根据 Nei’s遗传距离,
6 期 吕志江等: 新疆野扁桃种质资源遗传多样性的 ISSR 分析 919
果 树 学 报 27 卷
图 1 引物 866 对布尔津居群的扩增结果
1~24. 为布尔津居群的 24 个个体,M. D2000
Fig. 1 Amplified result of BRJ population by ISSR primer 866
1 to 24. Indicate 24 samples of BRJ population
表 2 9 条 ISSR 引物序列及其扩增结果
Table 2 Sequences of 9 ISSR primers and amplification results
引物代号
Primer code
引物序列
Primer sequence
扩增总位点数
Total number of amplified sites
多态位点数
Number of polymorphic sites
多态位点百分率
Percentage of polymorphic sites/%
828
845
855
856
857
864
866
881
889
总计 Total
TGTGTGTGTGTGTGTGA
CTCTCTCTCTCTCTCTRG
ACACACACACACACACYT
ACACACACACACACACYA
ACACACACACACACACYG
ATGATGATGATGATGATG
CTCCTCCTCCTCCTCCTC
GGGTGGGGTGGGGTG
DBDACACACACACACAC
11
11
14
11
12
10
12
18
15
114
11
10
14
11
10
10
12
16
11
105
100
90.9
100
100
83.3
100
100
88.9
73.3
92.1
Note: R=A/G;Y=C/T;D=A/G/T;B=C/G/T
利用 MEGA3.1 软件对居群进行 UPGMA 聚类分析。
2 结果与分析
2.1 ISSR 引物在新疆野扁桃各居群之间的扩增多
态性
从 100 条 ISSR 引物中共筛选出 9 条重复性好
且多态性丰富的引物, 对新疆野扁桃 5 个居群 120
个个体进行 PCR 扩增。图 1显示了引物 866对布尔
津居群的扩增情况。 9 条引物共扩增出 114 条清晰
可重复的条带,其中 105条具有多态性,多态位点百
分率为 92.1%。每个引物扩增的条带数为 10~18条,
平均扩增条带数为 12.6条,条带分子量大小在 200~
2 000 bp(表 2)。 以上数据初步表明新疆野扁桃居群
在 DNA 分子水平遗传多样性丰富。
2.2 物种和居群水平遗传多样性
在物种水平上, 新疆野扁桃多态位点百分率为
92.1%、观察等位基因数(Na)为 1.921 1、有效等位基因
数(Ne)为 1.456 7、Nei’s 基因多样度(h)为 0.280 9、
Shannon 信息指数(I)为 0.432 7;在居群水平上,各
居群的多态位点百分率差异不是太大 , 平均为
50.7%, 其中布尔津居群为 66.67%, 居 5 个居群之
首,最低的是托里居群为 45.61%,各居群观察等位
基因数(Na)平均为 1.507 0、有效等位基因数(Ne)平
均为 1.368 8、Nei’s 基因多样度(h)平均为 0.206 2、
Shannon 信息指数(I)平均为 0.299 9 。以上数据都表
现出居群间遗传多样性同样的一个趋势: BRJ>YM>
TCH>HBH>TL(表 3)。
2.3 群体遗传分化和基因流
用 POPGENE 软件计算出的遗传变异分析结果
(表 4)表明,新疆野扁桃总的居群基因多样度(Ht)
为 0.280 9±0.024 3, 居群内部基因多样度 (Hs)为
0.206 2±0.018 3,Nei’s 遗传分化系数 Gst=0.266 0,
表明有 26.6%的遗传变异存在于居群之间,73.4%的
遗传变异存在于居群之内, 即居群之内的遗传变异
大于居群之间。因此,新疆野扁桃的遗传变异主要存
在于居群内,居群内部的遗传分化程度大于居群间。
新疆野扁桃居群基因流(Nm)为 1.379 4,可以
认为 5个野扁桃居群间基因流畅通, 与 Nei 多样性
指数揭示的大部分遗传变异存在于居群内是一致
的。 基因流介于 1~4,就可以发挥其均质化的作用,
2 000
bp
1 000
750
500
250
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M
920
6 期 吕志江等: 新疆野扁桃种质资源遗传多样性的 ISSR 分析
图 2 基于 9 条 ISSR 引物数据的 5 个居群间 Nei’s 遗传距
离的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 Dendrogram of UPGMA method cluster analysis
based on Nei′s genetic distance of ISSR data generated by
the 9 primers
表 5 新疆野扁桃 5 个居群间 Nei’s[14]遗传一致度(对角线上
方)和遗传距离(对角线下方)
Table 5 Nei’s genetic identity(above diagonal)and genetic
distance(below diagonal)
among Amygdalus ledebouriana Schlecht.populations
居群
Population
布尔津
Burqin
哈巴河
Habahe
塔城
Tacheng
托里
Tuoli
裕民
Yumin
布尔津
Burqin
哈巴河
Habahe
塔城
Tacheng
托里
Tuoli
裕民
Yumin
****
0.092 0
0.134 9
0.125 1
0.136 6
0.912 1
****
0.117 4
0.124 3
0.081 9
0.873 8
0.889 2
****
0.137 6
0.129 6
0.882 4
0.883 1
0.871 4
****
0.117 0
0.872 4
0.921 4
0.878 5
0.889 6
****
表 4 新疆野扁桃遗传变异 Nei’s 分析
Table 4 Nei’s analysis of heredity and variation in Amygdalus ledebouriana
项目
Items
总基因多样度
Total gene diversity
(Ht)
居群内基因多样度
Gene diversity in Population
(Hs)
遗传分化系数
Index of genetic differentiation
(Gst)
基因流
Gene flow
(Nm)
平均(Mean)
标准差(St.Dev)
0.280 9
0.024 3
0.206 2
0.018 3
0.266 0 1.379 4
表 3 新疆野扁桃居群的遗传多样性统计
Table 3 The statistics of genetic variation within population of Amygdalus ledebouriana
居群
Population
观察等位基因数
Observed number
of alleles (Na)
有效等位基因数
Effective number
of alleles (Ne)
Nei’s 基因多样度
Nei’s gene diversity
(h)
信息指数
Shannons Information
index(I)
多态位点百分率
Percentage of
polymorphic sites (P)/%
布尔津 Burqin
哈巴河 Habahe
塔城 Tacheng
托里 Tuoli
裕民 Yumin
平均 Mean
物种水平
At species level
1.666 7
1.464 9
1.464 9
1.456 1
1.482 5
1.507 0
1.921 1
1.429 4
1.344 6
1.377 1
1.331 2
1.361 7
1.368 8
1.456 7
0.247 0
0.193 1
0.205 1
0.185 6
0.200 2
0.206 2
0.280 9
0.366 4
0.280 4
0.293 4
0.269 8
0.289 9
0.299 9
0.432 7
66.67
46.49
46.49
45.61
48.25
50.7
92.1
防止遗传漂变引起的各居群间的分化。
2.4 居群间的遗传一致度(I)和遗传距离(D)
根据 Nei[12]的方法利用 POPGENE1.31 软件计
算出了新疆野扁桃 5 个居群两两居群之间的 Nei’s
遗传一致度(I)在 0.871 4~0.921 4,平均为 0.896 4,
表明居群间存在一定的遗传变异;遗传距离(D)在
0.081 9~0.137 6,平均为 0.109 8,表明居群间的相
似程度较高(表 5)。 哈巴河(HBH)和裕民(YM)2 个
居群的遗传一致度最大(0.921 4),遗传距离最小
(0.081 9);塔城(TCH)和托里(TL) 2 个居群的遗传
一致度最小(0.871 4),遗传距离最大(0.137 6)。
2.5 居群间遗传关系的聚类分析
利用 MEGA3.1 软件, 根据 Nei’s 遗传距离,采
用 UPGMA 聚类法对 5 个群体进行聚类分析(图2)。
5 个居群分为 3 大类,布尔津、哈巴河聚成一类,托
里、塔城聚成一类,裕民单独一类。 Mantel 矩阵相关
性检测显示, 遗传聚类和地理距离的相关系数 r=
0.405 0,未达显著水平(P=0.286 0>0.05),表明野扁
桃遗传距离和地理距离之间不存在显著相关性,遗
传变异的分布没有明显的地理趋势, 自然居群遗传
分化不符合 wright[13]的地理距离分化模式。
3 讨 论
3.1 新疆野扁桃居群遗传结构
群体遗传结构受种的特性,例如交配系统、遗传
漂变和基因流等因素的影响, 而遗传分化系数和基
因流是评价群体遗传结构的重要指标。 异交虫媒植
物只有 19.7%的遗传变异存在于居群间, 绝大部分
(80.3%)存在于居群内[15]。 曾斌等[4]获得的 SSR数据
显示 , 新疆野扁桃群体间遗传变异占总变异的
34.97%。本研究群体间遗传变异占总变异的 26.6%,
0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00
TCH
TL
YM
BRJ
HBH
921
果 树 学 报 27 卷
与前人的结果不同。已有研究表明,在其他种上也出
现了不同的分子标记计算的群体间遗传分化系数不
一致的现象[16-17],这可能是由于不同的分子标记扩增
基因组的不同部位。 但是本试验和前人的研究结果
都显示,新疆野扁桃遗传变异主要存在于群体内。
研究获得的 ISSR数据显示,新疆野扁桃群体间
存在适当的基因交流(Nm=1.379 4)。 基因流是基因
在群体内或群体间的流动, 它与群体遗传分化成负
相关[18]。 基因流对于植物群体移动和进化非常重要,
对种子植物来说, 群体间的基因流主要是由花粉或
种子携带外来基因产生的[19]。 理论上,种群间的基因
流 Nm<1.0, 各种群会发生强烈分化;Nm 介于 1.0~
4.0 时,基因流就可以发挥其均质化的作用,防止遗
传漂变引起的各种群间的分化;Nm>4.0, 则种群是
一个随机的单位[20]。 用 Nei’s多样性指数估计的 Nm
值为 1.379 4,高于 1.0,但小于 4.0,表明新疆野扁桃
天然居群间没有明显的同化趋势, 也没有明显的异
化趋势。
研究对 5 个野扁桃居群进行 D 值计算发现 5
个野扁桃居群遗传距离在 0.081 9~0.137 6, 表明 5
个野扁桃居群间相似程度较高。
物种或居群的遗传结构是基因与基因型在时空
上的分布式样,种内遗传多样性越丰富,物种对环境
变化适应能力越强,进化潜力就越大。 因此,最大限
度地维持种内遗传多样性水平, 是持续利用遗传种
质资源的前提和基础[21]。
3.2 新疆野扁桃居群遗传多样性和保护
遗传多样性是植物长期进化的结果, 同时代表
了植物的进化潜力。因而为了物种生存,植物在较为
恶劣的生境条件下进化并积累了较多的遗传变异。
本研究结果表明, 野扁桃居群总的多态位点比率为
92.1%,具有较高的遗传多样性。
保护物种,最主要的是保护其遗传多样性。物种
遗传多样性的丰富程度决定了物种对环境的适应能
力和进化潜力。 野扁桃具有相对较高的遗传多样性
显示遗传多样性大小不是导致野扁桃资源急剧下降
的直接原因。野外调查发现,野扁桃居群及居群所处
的生境都遭到了不同程度的破坏, 野扁桃被砍伐现
象比较严重。巴尔鲁克山的野扁桃分布区,曾多次遭
受火灾危害, 最近一次火灾发生于 2000 年 8 月 7
日。塔城裕民县野扁桃自然保护区,遭到了由邻国哈
萨克斯坦窜入我国境内大火的猛烈袭击。400 hm2的
野生扁桃林几乎损失殆尽,火及之处,多成灰烬,有
些植株炭化后仍在原地僵立[2]。 可见,野生居群生境
的破坏、 过度砍伐和火灾是导致此资源下降的主要
原因。
遗传多样性资源的保护一般分为就地保护和迁
地保护, 对于因野外栖息地彻底丧失而导致的极度
濒危或野外己灭绝物种, 迁地保护是主要的甚至是
唯一的保护措施。对于天然种群面积较大,多样性程
度高而种群间分化小的物种,适合原地保护,保存
原生境,这样不仅成本低,而且利于基因多样性的保
存[22]。 新疆野扁桃因其遗传分化主要存在于居群内,
故应在就地保护过程中, 通过监测遗传多样性水平
来评价其保护的有效性。根据本研究的结论,应优先
考虑保护布尔津和裕民居群。
新疆野扁桃居群基因流畅通, 但在一些位点上
己发生一些大的分化。 不能因基因流丰富而忽视对
野扁桃天然林的保护, 对其基因流动的状况要做动
态观测,及时准确掌握基因流动的真实情况,针对性
地制定出保护措施。 基因流可以阻止种群内遗传变
异的减少,防止种群产生分化,在物种的保护和管理
中有着广泛的应用前景, 在实际工作中应该引起足
够的重视。
4 结 论
利用 ISSR 标记技术对新疆野扁桃居群的遗传
多样性水平及居群遗传结构进行了分析, 可以得出
以下几个结论: 1)从 100 个 ISSR 引物中筛选出了 9
个多态性好的引物, 共检测到 105 个多态位点,占
92.1%。 2)野扁桃具有较丰富的遗传变异,在物种水
平上,Nei’s 基因多样度(h)为 0.280 9,Shannon 信息
指数(I)为 0.4327;在居群水平上,多态位点百分率
平均为 50.7%,Nei’s 基因多样度 (h) 平均为 0.206
2,Shannon信息指数(I)平均为 0.299 9。 3)各居群间
产生了一定程度的遗传分化(Gst=0.266 0),大部分
遗传变异存在于居群内。 4)居群间的遗传距离与地
理距离相关性不显著。
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