全 文 ：濒危植物巴东木莲 RAPD扩增反应体系的建立
汤子春1 , 2 ,李雪萍1 ,3 ,陈发菊1 , 2 ,乐超银1 ,2 ,姚　伟1 ,2 ,
梁宏伟1 ,2 ,戴建武1 , 2 ,陈　凡1 ,2 ,何正权1 , 2
(1.三峡大学生物技术研究中心 ,湖北 宜昌 443002;2.三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点
实验室 ,湖北 宜昌 443002;3.北京林业大学生物科学与技术学院 ,北京 100083)
摘要:以巴东木莲叶片为材料 , 通过对反应体系中 Mg2+、dNTP 、Taq 酶 、模板 、引物浓度等影响因素的优化 , 确定了一套适
于巴东木莲 RAPD 分析的稳定反应体系 , 即 25 μl的总反应体系中:模板 DNA 100 ng , Mg2+2.1 mM , 引物 0.7 μM , dNTP
0.20 mM , Taq DNA 聚合酶 3 U。
关键词:巴东木莲;RAPD;优化;扩增反应;濒危植物
中图分类号:S792.990.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2006)01-0020-04
Optimization for RAPD Reaction of Mangliet ia patungensis Hu
TANG Zi-chun1 , 2 , LI Xue-ping1 , 3 , CHEN Fa-ju1 , 2 , YUE Chao-yin1 , 2 , YAO Wei1 , 2 ,
LIANG Hong-wei1 , 2 ,DAI Jian-wu1 , 2 ,CHEN Fan1 , 2 ,HE Zheng-quan1 , 2
(1.Biotechnology Research Center , China Three Gorges University , Yichang 443002 , China;
2.Key Lab for Natural Product Research and Utilization , China Three Gorges University , Yichang 443002 , China;
3.School of Biological Science and Biotechnology , Beijing Forestry University , Beijing 100083 , China)
Abstract:RAPD technology was first employed to study the rare and endangered plant Manglietia patungensis Hu in this paper.
An efficient and stable RAPD reaction system for the plant w as established through the optimization of the reaction factors:the con-
centration of Mg2+ , dNTP , Taq DNA polymerase, template and the primers.The results showed that the optimized RAPD reaction
conditions w ere 100 ng template DNA , 2.1 mM Mg2+, 0.7μM primer , 0.20 mM dNTP and 3 unit Taq DNA polymerase in a
to tal of 25μl reaction mixture.
Key words:Mangliettia patungnesis Hu;RAPD;optimization;reaction;dangerous plant
　　巴东木莲(Mangl ietia patungensis Hu)是木兰科木莲属植物 ,为我国特有珍稀濒危物种 、国家二级重
点保护植物。该物种现仅见于湖北 、湖南 、重庆和四川的局部地区 ,且分布范围狭窄 ,极为零散 。垂直分布
多见于海拔 600 ～ 1 000 m 的密林中。其树形美观 ,四季常绿 ,是良好的园林绿化树种 ,树皮为中药厚朴的
代用品。因森林破坏严重 ,在多数布点上其个体数量不超过 10株 ,少者仅存 1株 ,而且幼苗 、幼树极少 ,已
处于濒危灭绝的境地[ 1 ,2] 。尽管我国植物学工作者对巴东木莲的繁殖技术[ 3 ,4]以及其等位酶的遗传多样
性[ 5]等进行了一些研究 ,但总体看来 ,有关巴东木莲的研究报道较少 ,资料欠缺。
随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA , RAPD)技术是 1990年由 Williams和
Wesh等在 PCR基础上发明的一项 DNA分子标记技术。因其具有简便快捷 、灵敏度高 、通用性好 ,且无需
预先了解物种基因组的相关分子生物学信息等特点 ,近年来被广泛应用于动植物遗传多样性研究[ 6 ,7] 。
鉴于此 ,我们拟采用 RAPD技术对巴东县境内巴东木莲这一木莲属分布最北的种类进行遗传多样性及遗
传结构分析 。本文对巴东木莲基因组 DNA 提取方法及其 RAPD扩增条件进行了优化 ,以期建立适于巴
东木莲的简单 、高效 、稳定的 RAPD反应体系 ,为进一步开展珍稀濒危植物巴东木莲遗传多样性研究 ,以
及在此基础上制定其保存保育措施提供可靠的技术支持。
　收稿日期:2005-08-10
　基金项目:三峡大学重大科研项目(611202)资助
　作者简介:汤子春(1981-),男 ,湖北黄梅人,三峡大学硕士研究生,主要从事珍稀濒危及药用植物研究。
　通讯作者:何正权 , Email:zhq he@163.com
第 33 卷 第 1 期
2 0 0 6 年 3 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.33　No.1
Mar., 2 0 0 6
DOI :10.13428/j.cnki.f jlk.2006.01.005
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
实验材料巴东木莲均采自湖北省巴东县境内 。取当年萌发的幼嫩叶片共 7 株 ,于冰壶中冷藏带回实
验室 , -70℃保存备用。本实验所用引物购自上海博亚生物有限公司 ,PCR反应试剂均购自上海生工有
限公司。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA的提取　基因组 DNA的提取参照邹喻苹[ 8]的方法 ,稍作改进 ,具体步骤:①用蒸馏
水把材料冲洗干净 ,用灭菌吸水纸吸去其表面的水分;②取 0.2 ～ 0.3 g 剪碎加入研钵中 ,加液氮迅速研磨
至粉状 ,加入 1 ml 65℃预热的CTAB提取液;③分装至 1.5 ml离心管中 ,65℃水浴60 min;④加入0.5 ml
氯仿/异戊醇(24∶1 ,V/V),混匀 ,6 000 g 离心 10 min ,取上清液;⑤重复第(4)步 ,即用氯仿/异戊醇再抽提
1次;⑥取上清液 ,加入 2/3体积预冷的异丙醇 ,混匀 ,10 000 g 离心 10 min ,弃上清 ,70%乙醇洗涤沉淀;
⑦干燥后 40 μl TE缓冲液溶解沉淀 ,并加入 2 μl 10 mg·ml-1的 RNA se 室温放置 30 min ,4℃保存备用。
1.2.2　基因组 DNA的检测　将提取的 DNA样品用 TE缓冲液适当稀释 ,经HITACHI U-2800型紫外
可见分光光度计检测 ,波长 260 nm 处测定光吸收 ,根据 260 nm 的光吸收值计算 DNA产率;0.8%琼脂糖
凝胶电泳 ,EB染色后 ,用自动凝胶成像系统(BIO-RAD)观察拍照 。
1.2.3　PCR扩增　PCR扩增的基本条件是:总体积为 25 μl ,反应系统内含 2.5 μl PCR Buf fer , 0.2 mM
dNTP ,2.8 mM M gCl2 , 0.3 μM 引物 , 2.5 U Taq DNA 聚合酶 ,100 ng DNA模板。扩增程序为:94℃预变
性 5 min ,然后执行 40个循环 ,每个循环中 94℃变性 1 min ,36℃退火 1 min , 72℃延伸 2 min ,最后 72℃延
伸 10 min。反应在 M J PTC-220基因扩增仪上进行。扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳 ,电压为
2.5 V/cm ,溴化乙锭染色后 ,自动凝胶成像系统观察拍照 。
图 1　基因组 DNA 电泳图
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA 的提取与分析
所提取的 DNA样品的色泽为白色或近白色 ,紫外可见分
光光度计(HITACHI U-2800)检测 260 nm 、280 nm 波长处
的光吸收比值 OD260/OD280为 1.78 ,计算可知 DNA 产率为
0.322 ug·μl-1 ,DNA琼脂糖电泳图谱如图 1所示 。由图 1可
以看出巴东木莲基因组 DNA 电泳得到的条带比较整齐 、清
晰 ,基本无降解 ,完整性好 。
2.2　PCR扩增条件的优化
图 2　模板含量对 RAPD扩增的影响
　M 为 100 bp Marker;1 为阴性对照;2 ～ 8 分别对应模
板含量为 40 ng、60 ng 、80 ng、100 ng、120 ng 、140 ng、
160 ng
2.2.1　模板 DNA 浓度　模板 DNA 量的变化对 RAPD
条带的数量和强弱影响较大 。据文献报道 ,扩增的材料
不同对模板的最适浓度要求不同:例如唐绍等(1998)报
道金花茶约 1 ng·μl-1的最适模板浓度为宜 ,而苏应娟
(1998)在罗汉松 RAPD分析中要求 50 ～ 80 ng·μl-1的最
适模板浓度 ,袁长春等(1999)报道茶类植物 RAPD 的最
适模板浓度为 4 ～ 6 ng·μl-1[ 9] 。在本研究中 , 当模板
DNA为 4 ng·μl-1时 ,扩增出的条带丰富且清晰 ,浓度过
高或过低则扩增条带减少或颜色较浅 。因此 ,在巴东木
莲的 RAPD扩增反应中 ,模板浓度以 4 ng·μl-1左右为宜
(如图 2)。
·21·第 1 期 汤子春 , 等:濒危植物巴东木莲 RAPD扩增反应体系的建立
图 3　引物浓度对 RAPD扩增的影响
　M 为 100 bp Marker;1 为阴性对照;2～ 8 分别对应引
物浓度为 0.3 μM 、0.4 μM 、0.5 μM 、0.6 μM 、0.7
μM 、0.8μM 、0.9 μM
2.2.2　引物浓度　引物浓度偏高会引起错配和非特异
性扩增 ,且可增加引物之间形成二聚体的机率 ,这两者
又竞争使用 Taq 酶 、dNTPs ,这些均会使得扩增效率下
降。本实验中将引物浓度设置在 0.3 ～ 0.9 μM 之间 ,浓
度呈梯度变化 ,不同引物浓度扩增结果见图 3。当引物
浓度为 0.3 μM 、0.4μM 时 ,有扩增条带产生 ,但条带较
少 ,只有 2条;当引物浓度为 0.5 μM ,有 4条带产生 ,但
条带模糊;在引物浓度为 0.7μM 时 ,条带多且清晰。故
选用 0.7μM 为引物的最适浓度 。
2.2.3　dNTP 的浓度　dNTP 浓度的变化对 RAPD 扩
增条带的数量和强弱影响较大 , dNTP 作为 PCR反应的
原料参与新链 DNA的合成过程 ,对循环数 、产物扩增的
量均有较大的影响 ,浓度过低 ,偶然性大 ,无扩增产物或
图 4　dNTP 浓度对 RAPD 扩增的影响
　M 为 100 bp Marker;1 为阴性对照;2 ～ 12 分别对
应 dNTP的浓度为 0.10 mM 、0.12 mM 、0.14 mM 、
0.16 mM 、0.18 mM 、0.20 mM 、0.22 mM 、0.24
mM 、0.26 mM 、0.28 mM 、0.30 mM
扩增产物不稳;浓度过高则会导致聚合酶错误掺入 ,影响
扩增的特异性和精确性。本实验中发现 ,当 dNTP 的浓度
在0.10 ～ 0.18 mM 时 , RAPD反应有扩增产物 ,但不稳
定 ,条带不清晰;当 dNTP 的浓度为0.20 mM ,扩增效果最
佳 ,有 3条清晰条带 ,而浓度升至 0.30 mM 时 ,虽有扩增
产物 ,但条带清晰度不及浓度为 0.20 mM(见图 4)。故选
取 0.20 mM 为巴东木莲 RAPD分析中 dNTP 的最适反应
浓度 。
2.2.4　Mg2+浓度　Mg 2+是PCR反应的一个重要影响因
子 ,它不仅影响扩增的真实性及产物的特异性 ,而且可能
影响酶活性 、引物的退火温度 、引物二聚体的形成等诸多
方面 。确定镁离子最佳浓度至关重要。镁离子浓度过低 ,
Taq酶有所失活 , 过高则会使引物的错配频率增加[ 10] 。
本实验不同 Mg2+浓度 RAPD-PCR扩增后的结果如图 5
图 5　Mg 2+浓度对 RAPD扩增的影响
　M 为 100 bp Marker;1 为阴性对照;2 ～ 9 分别
对应 Mg2+浓度为 1.2 mM 、1.5 mM 、1.8 mM 、
2.1 mM 、2.4 mM 、2.7 mM 、3.0 mM 、3.3 mM
所示 。从图 5可以看出 ,当 Mg2+浓度为 2.1 mM 时 ,扩增
条带多且清晰。
2.2.5　Taq DNA 聚合酶用量　Taq DNA聚合酶在 PCR中
的用量受到反应体积 、酶的活性 、酶的耐热性等因素的制约 ,
在条件合适时 ,每 25μl体系中一般使用 1 ～ 5 U 的 Taq DNA
聚合酶[ 11～ 14] 。我们分别试验了在每 25 μl 体系中使用 2.0
U 、2.5 U 、3.0 U 、3.5 U 、4.0 U Taq 酶对 RAPD反应的影响 ,
见图 6 。由图 6可见 ,当 Taq酶用量为 2.0 U 、3.5 U 、3.0 U 、
3.5 U和 4.0 U 时 ,均有条带扩增出 ,但在用量为 3.0 U 时 ,
扩出的 DNA带型和强度都较好 ,故选 3.0 U为 Taq DNA聚
合酶的用量。
3　结语
研究表明 , dNTPs 、Mg 2+ 、引物 、模板 DNA 及 Taq DNA
聚合酶等都会对 RAPD扩增产生较大影响 ,从而影响 RAPD分析的准确性 。而 RAPD扩增谱带的准确性
和稳定性是利用 RAPD技术进行遗传多样性分析的前提条件。所以为了获得准确性和稳定性较好的
·22· 福 建 林 业 科 技 第 33 卷
图 6　Taq DNA聚合酶对 RAPD扩增的影响
　M为 100 bp Marker;1 为阴性对照;2～ 6 分别对应
Taq DNA 聚合酶用量为 2.0 U 、2.5 U、3.0 U、
3.5 U、4.0 U
RAPD结果 ,在进行某一物种的 RAPD 分析之前 ,筛选适
宜的 RAPD扩增条件是十分必要的。本研究确立了适于
珍稀濒危植物巴东木莲 RAPD反应条件 ,即 25 μl反应体
系中含模板 DNA 100 ng , 2.1 mM Mg2+ , 0.7 μM 引物 ,
0.20 mM dN TPs , 3 U Taq DNA 聚合酶。以此条件用 3
个引物对 7 个不同巴东木莲植株 DNA 进行了 RAPD扩
增 ,结果可靠 ,带型稳定。
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·23·第 1 期 汤子春 , 等:濒危植物巴东木莲 RAPD扩增反应体系的建立