全 文 ：研究报告
Research Report
砂藓ATP合酶Ⅱ亚基基因的克隆及表达分析
周伯 沙伟 * 张梅娟 张春蕾 索荔
齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,齐齐哈尔, 161006
*通讯作者, shw1129@263.net
摘 要 ATP合酶是光合作用中光合磷酸化和呼吸作用中氧化磷酸化反应的关键酶，影响着细胞生命活
动所需的 ATP的产生。为研究 ATP合酶在苔藓植物中的生物学功能，本研究克隆得到砂藓 ATP合酶Ⅱ亚
基基因，命名为 RcatpG。生物信息学分析表明，砂藓的 cDNA序列长为 1 220 bp，其中开放阅读框(ORF)为
756 bp，编码 251个氨基酸的多肽序列；预测分子质量为 27.48 kD，等电点为 9.20，含有 ATP-synt_B保守结
构域；推测 RcatpG蛋白为不稳定蛋白，不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发育分析显示，RcatpG蛋白
与小立碗藓 atpG蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR分析显示，RcatpG基因在复水过程和脱水胁迫处
理中均能表达。因此，推测 RcatpG基因在砂藓的复水过程和脱水胁迫处理中起着一定的作用。
关键词 砂藓, ATP合酶,基因克隆,生物信息学分析,实时荧光定量
Cloning and Expression Analysis of ATP SynthaseⅡ Subunit Gene RcatpG
in Racomitrium canescens
Zhou Bo Sha Wei * Zhang Meijuan Zhang Chunlei Suo Li
College of Life Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar, 161006
* Corresponding author, shw1129@263.net
DOI: 10.13417/j.gab.034.001435
Abstract ATP synthase, one of the key enzymes in photosynthesis of photosynthetic phosphorylation and in
respiration of oxidative phosphorylation, is essential for research of molecular basis about the growth of cells in
Racomitrium canescens. This paper aimed to study the role of ATP synthase under drought tolerance of Racomitrium
canescens. We cloned and sequenced RcatpG gene with RT-PCR technique and performed bioinformatic analysis.
The expression levels of RcatpG in both rehydration and dehydration treatment to Racomitrium canescens were
detected by quantitative RT-PCR. The full length of this gene was 1 220 bp, and contained a 756 bp open reading
frame which encoded a protein containing 251 amino acids. Bioinformatic analysis showed that the RcatpG was
predicted as an unstable protein with a function domain ATP-synt_B, with molecular weight of 27.48 kD and
isoelectric point of 9.20. The protein was also predicted that it is not a transmembrane protein and containing no
signal peptides. Phylogenetic analysis indicated that this gene has the closest genetic relationship with the homolog
gene in Physcomitrella patens. The quantitative RT-PCR results suggested that the expression of RcatpG gene
could be induced in both rehydration and dehydration treatment to Racomitrium canescens. It suggested that this
gene might play an important role in both rehydration and dehydration processes.
Keywords Racomitrium canescens, ATP synthase, Gene cloning, Bioinformatic analysis, Quantitative real-time
PCR
基金项目：本研究由黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD201408)和国家自然科学基金项目(31070180; 31270254)共同资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 7期，第 1435-1442页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.7, 1435-1442
自然界中，能量是所有生物完成生命活动的必
要条件。ATP作为在生物体内流通的“能量货币”，维
持着生物的新陈代谢活动。绝大多数生物体内的
ATP都是利用 ATP合酶催化合成的，这种能量转化
的方式是生物体内最频繁的发生(倪张林和魏家绵,
2003)，也是研究细胞内能量代谢的途径和物资运输
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
途径的关键(Serrano, 1989; Fedorova et al., 1999)。虽
然 ATP合酶在叶绿体和线粒体中均有分布，但其组
成和结构基本一致(司文洁, 2012)。总体上，ATP合酶
可被分为 3种类型：F-型、质膜 P-型和液泡V-型。
在叶绿体中，F-型ATP合酶为光合作用中光合磷酸
化的关键酶；在线粒体中，它是呼吸作用中氧化磷酸
化反应的关键酶。叶绿体的 F-型ATP合酶由暴露
于膜外的 CF1和镶嵌在膜内的 CF0两部分组成。CF1
是由 α、β、γ、δ和 ε五种亚基组成，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四
种亚基构成 CF0部分(Fromme et al., 1987)。在Ⅰ亚基
和Ⅱ亚基的结构中，亲水性结构所占比例较大，这种
结构可能跨膜伸向叶绿体的间质，并和 CF1部分相
互作用(Otto and Berzborn, 1989)。但是，一些学者认
为Ⅰ亚基和Ⅲ亚基可能与叶绿体 CF1部分结合，而
Ⅱ亚基与叶绿体 CF1结合的可能性极低(Feng and
McCarty, 1990)。还有报道称，Ⅱ亚基具有防止Ⅲ亚基
解离的作用，能将Ⅲ亚基组装成具有输送质子功能的
功能单位(曾小美, 2004)。Ⅱ亚基的保守性较低，其 N
端包含一段疏水性很强的肽段，该片段能够形成跨膜
螺旋区(董慧, 2005)。Dmitriev等(2004)分析 E. coli F0
中 b亚基(对应植物叶绿体的Ⅱ亚基)N端跨膜区域
的 H-NMR图谱时指出，4-22位氨基酸残基构成一
个 α-螺旋结构，b亚基依靠其 α-螺旋结构嵌于膜
上。此外，b亚基的二级结构中，含有许多 α-螺旋，b
亚基单体间可以利用该特性形成二聚体。
随着分子生物学的发展，植物 ATP合酶基因克
隆及其功能的研究受到广泛关注。研究表明，ATP合
酶在植物细胞渗透调节、细胞质内的 pH调节起着重
要作用。陈亚华等(2000)比较了两个耐冷性不同的水
稻幼苗的根系质膜、液泡膜 ATP合酶对低温(8℃)及
高 pH (8.0)胁迫的反应。发现 ATP合酶的活性在低
温及高 pH胁迫下均有所升高。植物 ATP合酶在细
胞的伸长与分化、气孔的开闭、打破休眠等的生理
功能中也发挥重要功能(税雪, 2008)。此外，ATP合
酶能参与植物对低温和干旱胁迫的应答 (姜晓旭,
2014)。还有研究证明，ATP合酶基因与植物耐盐性
和植物防御有关(Suda et al., 2009; Seo et al., 2014)。
但是，在藓类植物中，目前有关 ATP合酶基因功能
的报道很少。
砂藓为紫萼藓科砂藓属植物，生长在高山地区岩
石或砂土山坡上(黎兴江, 2000,科学出版社, pp.58)，
其生长地区多在降雨量较少的干旱或半干旱地区，
为典型的耐旱藓类，具有较强的抗逆性。因此，克隆
砂藓 ATP合酶Ⅱ亚基 atpG基因并对其功能进行研
究具有重要意义。本研究以砂藓为试验材料，克隆了
砂藓转录组中筛选到的 atpG基因序列，对其进行了
生物信息学分析及系统发育分析，并采用实时荧光
定量 PCR分析该基因在砂藓复水和快速干燥过程
的表达特性，为进一步研究该基因的功能和砂藓的
耐旱机制研究提供参考依据。
1结果与分析
1.1 RcatpG基因的克隆与分析
该基因包含的开放阅读框的长度为 756 bp，
编码的蛋白质由 251个氨基酸残基组成(图 1)。以
RcatpG基因完整开放阅读框为模板，利用特异性引
物 RcatpG-F和 RcatpG-R进行 PCR扩增。经 1%琼
脂糖凝胶电泳分析，出现一条大小为 800 bp左右的
特异性条带(图 2A)。双酶切鉴定的结果(图 2B)与
PCR扩增结果一致。经测序结果证实，测序所得的序
列长为 795 bp，与预期片段大小一致。
1.2砂藓 RcatpG基因的生物信息学分析
NCBI中ORF Finder软件分析结果显示该基因
包含一段长度为 756 bp的开放阅读框,编码 1个由
251个氨基酸残基组成的蛋白质(图 1)。Protparam软
件预测该基因编码的蛋白质分子量为约 27.48 kD，
理论等电点为 9.20；不稳定指数为 51.92，可能属于
不稳定型蛋白；总平均亲水性指数为-0.070，预测该
蛋白为亲水性蛋白。使用 Conserved Domains对该蛋
白的结构域进行分析，发现其具有 ATP-synt_B保守
结构域，属于 ApoLp-Ⅲ_like超家族(图 3)。用 TM-
pred软件预测 RcatpG蛋白，结果显示该蛋白无跨膜
螺旋区，蛋白全部区域位于细胞膜表面。采用 Sig-
nalP 4.1软件预测发现砂藓 RcatpG蛋白不存在信号
肽，为非分泌蛋白。利用 InterPro在线软件对 RcatpG
蛋白进行功能位点预测，发现整条肽链(除保守结构
域)无特殊的功能结构域和功能位点。利用 PORTER
对 RcatpG蛋白二级结构预测，发现在 RcatpG蛋白的
二级结构中，延伸链和无规则卷曲分别占 1.59%和
19.12%；α-螺旋所占的比例最高，达到79.28%。使用
SWISS-MODEL软件预测 RcatpG的三级结构(图 4)。
1.3 RcatpG蛋白的同源序列分析及系统发育分析
利用 NCBI中 Blast程序，根据砂藓 RcatpG基
因编码的氨基酸序列查找其它植物同源序列，
RcatpG蛋白与小立碗藓、江南卷柏、辐射松、火炬松、
北美云杉、玉米、川桑、可可、菠菜、蒺藜苜蓿、玉山筷
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砂藓 ATP合酶Ⅱ亚基基因的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of ATP SynthaseⅡ Subunit Gene RcatpG in Racomitrium canescens
子芥、拟南芥和莱茵衣藻的 atpG蛋白一致性较高，
其中与小立碗藓的一致性最高，可达 93%，与其它植
物的一致性均在 48%以上，这说明在长期的进化中，
atpG 基因的结构也在进化，但是保守性较差，与
Dunn的观点一致(Dunn, 1992; Dunn et al., 2000)。
为进一步研究植物 atpG蛋白的进化关系，利用
MEGA 5.0软件将不同植物的 atpG蛋白构建系统进
化树。这 13种植物(除莱茵衣藻)都属于有胚植物，利
用莱茵衣藻作为外群构建系统发育树，由结果可知
(图 5)，RcatpG蛋白与小立碗藓 atpG蛋白的亲缘关
图 1 RcatpG cDNA序列及其预测的氨基酸序列
Figure 1 cDNA sequence and predicted amino acid sequence of RcatpG gene
图 2 RcatpG基因 ORF扩增(A)和酶切结果(B)
注: M: DL 2000 Marker
Figure 2 PCR products of ORF (A) and enzyme digestion (B) of
RcatpG gene
Note: M: DL 2000 Marker
图 3 RcATPG蛋白保守结构域
Figure 3 Conserved domains of RcATPG protein
图 4 RcatpG蛋白的三级结构
Figure 4 Tertiary structure prediction of RcatpG protein by
SWISS-MODEL
系最近，与玉山筷子芥 atpG和拟南芥 atpG蛋白的
亲缘关系最远。
1.4 RcatpG基因在复水处理和脱水胁迫处理中的表达
利用实时荧光定量 PCR 对不同复水时间和不
同快速干燥时间下 RcatpG基因表达情况进行分析，
结果显示：在复水处理过程中 (图 6A)，各时间点
RcatpG基因的表达量均高于对照，在复水 1~3 d内
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表达量逐渐升高，复水 1 d时相对表达量为对照的
1.14倍；复水 2 d时相对表达量为对照的 2.40倍；复
水 3 d的相对表达量最高，为对照的 3.56倍；复水 3 d
后的相对表达量逐渐下降，复水 4 d时相对表达量为
对照的 3.05 倍；复水 5 d 时相对表达量为对照的
1.88倍。在脱水处理过程中(图 6B)，RcatpG基因的
表达量呈先升后降趋势，但与对照相比表达量都有
所上调，快速干燥 10 min 时表达量为对照的 1.49
倍；快速干燥 20 min时表达量为对照的 1.65倍；快
速干燥 30 min时表达量达到最大值，约为对照的
3.26倍；快速干燥 1 h后表达量开始逐渐下降，从处
理 8 h开始基因的表达量趋于稳定。
2讨论
ATP几乎是所有生命新陈代谢的“能量货币”，维
持着生物的新陈代谢活动。几乎所有的生命活动所需
的能量都是靠 ATP合酶催化形成的。本研究通过
PCR技术克隆得到 ATP合酶Ⅱ亚基基因 RcatpG，生
物信息学分析显示，该基因含有 ATP-synt_B保守结
图 5 RcatpG的系统发育分析
Figure 5 Phylogenetic tree of RcatpG
图 6砂藓复水过程(A)和脱水胁迫处理中(B) RcatpG基因的表达分析
注: CK:正常生长的材料;干旱:自然晾干 2年的材料
Figure 6 Expression analysis of RcatpG gene under rehydration (A) and dehydration (B)
Note: CK: The fresh material; Drought: On behalf of the material under dehydration condition being saved two years
构域，属于 ATP合酶超家族成员；同源序列分析显
示该基因与小立碗藓 ATP合酶Ⅱ亚基蛋白一致性
较高，达 93%，因此初步认为该基因为 ATP合酶Ⅱ
亚基基因。
目前，已有很多有关 ATP合酶基因克隆的报道。
朱荣焕等(1987)成功克隆龙葵叶绿体 ATP合酶 α亚
单位基因。崔杰等(2006)成功克隆得到甜菜 ATP合酶
β亚基基因，并对其序列进行了生物信息学分析。关
尔鑫等(2011)成功构建了小麦 pCAMBIA-atpC 植物
超量表达载体。曹蕾等(2012)成功克隆了刺五加 ATP
合酶 β亚基基因，为后续研究该基因在刺五加中发
挥的作用奠定了基础。张云鹏等(2013)以小麦中一
个 ATP合酶基因为种子序列，运用电子克隆的方法
获得甘蔗中的 ATP合酶基因。
由于 ATP合酶具有重要的生物化学地位，近年
来的研究表明，ATP合酶基因在植物抵抗逆境胁迫
中发挥一定的作用。郭振飞在低温条件下对耐冷性
不同的水稻中 ATP合酶的含量和活性进行了研究，
发现冷处理下耐冷品种 ATP合酶活性无明显的变
化，而冷敏感品种的 ATP合酶活性则显著降低；低
温条件下两个品种的内源 ATP含量都显著升高，冷
敏感品种的升高幅度大于耐冷品种(Wang and Guo,
2005)。毛兴学等(2003)将水稻幼苗在低温下(8℃)处
理不同时间，Northern杂交分析显示，其 atpH基因转
录水平在受冷后逐渐被抑制，低温处理 1 d时呈明显
下降趋势，2 d后则完全被抑制。Suda等(2009)从衣
藻中克隆得到 1条与 ATP合酶Ⅱ亚基 atpG同源的
基因，将其转入大肠杆菌后，发现其细胞内 ATP含
量增多，耐受性增强。随后，Suda等(2009)分别将淡
水藻类 atpG基因和海洋藻类 atpG基因转入大肠杆
菌，对 atpG基因的耐盐性功能进行了研究，发现转
海洋藻类 atpG基因的大肠杆菌的耐盐性较高，这说
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明 atpG 基因参与逆境胁迫响应。Sanchez-Bel 等
(2012)发现番茄在遇冷时，其 ATP合酶蛋白表达下
调。Hoshiyasu等(2013)在西瓜中发现了 2种 ATP合
酶 ε亚基，它们由同一个基因编码，区别在于 N端是
否含有 1个乙酰基；当西瓜受到干旱胁迫时，N端不
含有乙酰基的 ε亚基表达量下降，而 N端含有乙酰
基的 ε亚基表达量无明显变化。Seo等(2014)证明了
当烟草受莲子草花叶病毒 TGB1L88感染时，β-ATP
合酶能够对其响应参与植物防御。姜晓旭等(2014)从
蒙古沙冬青幼苗中克隆得到 AmAtpD基因，实验发现
该基因在低温和干旱胁迫下表达量明显升高，说明
AmAtpD基因可受低温和干旱胁迫诱导表达。Spence
等(2014)对芒草进行低温胁迫后发现，其 atpA基因的
表达上调，与玉米中的表达模式不同。本研究中，实
时荧光定量 PCR的结果显示，随着复水时间的增长
RcatpG基因的表达量呈先升再降的趋势，在脱水处
理过程中，脱水胁迫 30 min时表达量达到最大值，脱
水 8 h 以后其表达量逐渐趋于平稳。由此可见，
RcatpG基因在不同时间的复水过程和脱水胁迫处理
中均可以表达且有明显的变化，这说明 RcatpG基因
可能参与植物干旱胁迫的应答。
3材料与方法
3.1材料
实验所用材料为采自黑龙江省五大连池风景区
的砂藓。
材料处理：参照沙伟等(2010)对东亚砂藓旱后复
水的生理指标研究，将自然晾干的材料分别复水 1 d、
2 d、3 d、4 d、5 d，直到恢复正常生长，并以正常生长
的材料作为对照(CK)。然后对正常生长的材料进行
硅胶快速快速干燥处理，快速干燥时间分别为 10min、
20 min、30 min、1 h、4 h、8 h、1 d、2 d，同时使用自然
晾干 2年的材料。取材经液氮冷冻后于-80℃冰箱
保存备用。
3.2方法
3.2.1总 RNA提取及 cDNA第一链合成
参考宋晓宏(2011)提取总 RNA的方法。材料用
量为 0.4 g，研磨时加适量 PVP。参照 Promega公司的
M-MLV逆转录酶说明书合成 cDNA第一链，放入
-20℃冰箱保存，用于 RcatpG基因克隆和实时荧光
定量 PCR分析。
3.2.2 RcatpG基因克隆
根据本实验室砂藓转录组序列库中所鉴定出的
一条 atpG序列，利用 Primer Premier 5.0软件在其开
放阅读框的 5末端非编码区和 3末端非编码区设计
了 1对特异性引物，并根据 RcatpG序列特征添加酶
切位点和保护碱基(表 1)。利用引物 RcatpG-F 和
RcatpG-R进行 ORF全长扩增。PCR反应条件：94℃
预变性 5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 45 s，72℃延
伸 1 min，共设置 30个循环，72℃延伸 10 min (张春
蕾等, 2015)。所得 PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检
测，胶回收目的片段，再与 pMD18-T载体(购自大连
宝生物)进行连接，转化后挑取阳性克隆进行酶切鉴
定。酶切鉴定成功的菌液送北京华大基因公司测序。
3.2.3 RcatpG基因的生物信息学分析
Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)分析
RcatpG基因编码的蛋白质基本理化性质；其保守结
构域使用 Conserved Domains 分析(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/cdd)；利用 TMpred (http://www.ch.embne
t.org/software/TMPRED_form.html)预测可能存在的
跨膜区域；用 SignalP 4.1预测信号肽(http://www.cbs.
注: = :保护碱基; :酶切位点
Note: = : Protective base; : Restriction enzyme cutting site
用途
Purpose
ORF扩增
Amplification of ORF
实时荧光定量 PCR
qRT-PCR
引物名称
Primer name
RcatpG-F
RcatpG-R
RcatpG-qF
RcatpG-qR
18S-F
18S-R
序列(5-3)
Sequence (5-3)
GCGTCGACTATTGTGGAGGAATGGCGG
CGGAATTCCTACACACTACGGCGCGATA
AGAAGGAGCCCAAGGGTAAG
GCTTGAACCAGATGTTGTCG
TTGACGGAAGGGCACCA
ACCACCACCCATAGAATCAAGAA
表 1 RcatpG基因克隆和实时荧光定量 PCR所用引物
Table 1 Primers for cloning of RcatpG gene and qRT-PCR analysis
砂藓 ATP合酶Ⅱ亚基基因的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of ATP SynthaseⅡ Subunit Gene RcatpG in Racomitrium canescens 1439
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
dtu.dk/services/SignalP/)；用 InterPro预测蛋白功能位
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)；用 PORTER 预测二
级结构(http://distill.ucd.ie/porter/)。预测蛋白质的三
级结构使用 SWISS-MODEL软件(http://swissmodel.
expasy.org/)。
利用 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 查找
与 RcatpG 同源的氨基酸序列，经 MEGA5.0 软件
(N-J法)构建系统进化树(沙伟等, 2013)。
3.2.4 RcatpG基因在砂藓复水过程和脱水胁迫处理
中的表达分析
根据砂藓 RcatpG基因序列，设计实时荧光定量
PCR引物，引物为 RcatpG-qF和 RcatpG-qR，选取砂
藓 18S rRNA基因作为内参基因，内参引物为 18S-F
和 18S-R (表 1)。
反应体系参照 SsoFast EvaGreen Supermix 荧光
定量试剂盒说明书。反应体系为：模板 100 ng，上下
游引物各 200 nmol/L，SsoFast EvaGreen Supermix
(2×) 10μL，ddH2O补至 20μL。反应程序为：95℃ 20 s，
95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 30 s，35个循环，每个样品
重复 3次(李继刚等, 2014)。采用 2-△△Ct法计算基因
的相对表达量。
作者贡献
周伯主要负责实验操作，数据分析及论文撰写；张
梅娟主要负责实验样品的采集及基因表达部分的实验
设计；RNA的提取由周伯、索荔和张春蕾共同完成；通
讯作者沙伟主要负责实验设计与指导以及论文修改。
致谢
本研究由黑龙江省自然科学基金重点项目
(ZD201408)和国家自然科学基金项目 (31070180;
31270254)共同资助。
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Tree Genetics and Molecular Breeding (TGMB)
Tree Genetics and Molecular Breeding (ISSN 1927-5781) is an international, open
access, peer reviewed journal, committed to serve for tree genetics and molecular
breeding, particularly publishing innovative research findings in the basic and applied
fields of tree molecular genetics and novel techniques for crop/
fruit/forest/ ornamental/horticultural trees improvement, as well as applications of
molecular enhanced products. TGMB publishes all the latest and outstanding research
articles, letters and reviews in all aspects of tree genetics and molecular breeding,
include studies in tree genetics and molecular breeding, include studies in
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biochemistry, transgene, genetic rule analysis, QTL analysis, vitro propagation;
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