全 文 ：东亚砂藓 Cu /Zn SOD基因的克隆及序列分析
于 冰，沙 伟* ，刘 卓 (齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江省齐齐哈尔 161006)
摘要 ［目的］对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的 Cu/Zn SOD基因进行克隆，并对其序列进行分析。［方法］利用 RT-PCR技术获
得东亚砂藓 Cu/Zn SOD基因的 cDNA，同时对该序列进行生物信息学分析。［结果］东亚砂藓 Cu/Zn SOD基因 cDNA长 565 bp，包含一
个长为 465 bp的 ORF，编码 154个氨基酸残基，预测的该蛋白的分子量为 15． 5 kD，理论等电点为 5． 77，负电荷残基(Asp + Glu)总数为
18个，正电荷残基(Arg + Lys)总数为 12个，不稳定系数是 13． 36;其编码的氨基酸序列包含了 5个蛋白保守区，均为铜锌超氧化物歧化
酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓 Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达 99%和 82%。［结论］该研究
为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓 Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。
关键词 东亚砂藓;Cu/Zn SOD基因;克隆;序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)23 －11587 －04
Cloning and Sequence Analysis of Cu/Zn SOD from Rhacomitrunm japonicum
YU Bing et al (College of Life Science and Agriculture Forestry，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjiang 161006)
Abstract ［Objective］The aim was to clone and analyze the sequence of Cu /Zn SOD cDNA from Rhacomitrunm japonicum． ［Method］The cD-
NA of Rhacomitrunm japonicum Cu/Zn SOD was cloned by RT － PCR and then its sequence was analyzed by bioinformatics method． ［Result］
The cDNA sequence of Rhacomitrunm japonicum Cu/Zn SOD was 565 bp，containing a 465 bp ORF，encoding 154 amino acids，which prediction
molecular weight and theoretical isoelectric point of was 15． 5 kD and 5． 77;the protein had 18 negative charge residues (Asp and Glu)and 12
positive charge residues (Arg and Lys)，unstable coefficient was 13． 36;the sequence of amino acids encoded by Cu /Zn SOD gene contains five
protein conserved regions and all of them belonged to Cu /Zn superoxide dismutase superfamily;the Blastn comparison analysis showed that the
homology between Rhacomitrunm japonicum and Grimmia pilifera，Physcomitrella patens was 99% and 82% ． ［Conclusion］This study provided
theory basis and foundation for the further research of drought resistance of Grimmiaceae plants and function of moss Cu /Zn-SOD in the abiotic
stresses resistance．
Key words Rhacomitrunm japonicum;Cu/Zn SOD gene;Cloning;Sequence analysis
基金项目 国家自然科学基金项目(31070180)。
作者简介 于冰(1985 － ) ，女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，研究方
向:植物遗传学，E-mail:yubingyc@ 163． com。* 通讯作者，
教授，博士生导师，从事植物学、植物遗传学方面的研究，E-
mail:shw1129@ 263． net。
收稿日期 2012-04-12
1938 年，keilin 从牛血中分离出一种含 Cu 的血铜蛋
白［1］。1969年 Mccwrd 及 Fridovich 发现血铜蛋白、肝铜蛋
白、脑铜蛋白均有(O2 －)歧化活性，因此将该酶命名为超氧
化物歧化酶(superoxide dismutase，简称 SOD)。此后，对超氧
化物歧化酶的研究逐步深入［2］。超氧化物歧化酶是一种广
泛存在于动植和微生物中的金属酶，是生物体内一种重要的
自由基清除剂，也是植物抗氧化系统中第一个参与活性氧清
除反应的酶，在抗氧化酶类中处于核心地位［3］。根据结合金
属离子的不同，超氧化物歧化酶可以分为 Cu /zn-SOD、Mn-
SOD、Fe-SOD 3种类型，其中 Cu /Zn-SOD主要位于真核生物
的细胞质和叶，Mn-SOD 主要存在于线粒体中，Fe-SOD 一般
位于叶绿体中。Mn-SOD 与 Fe-SOD 有较高的同源性，Cu /
Zn-SOD与 Mn-SOD、Fe-SOD 之间无同源性［4］。SOD 的反应
机理是:与酶相连的金属交替的氧化或还原，催化快速歧化
反应，可迅速使有毒害的自由基(O2 －·)转化为过氧化氢和
分子氧［5］。经研究发现，在植物中，不同条件、不同物种、不
同的发育时期及不同器官发生胁迫后，SOD活性表现有升有
降。但 SOD的活性无论显示为降低或升高，在抗逆性强的
品种中其活性表现的均要比抗逆性弱的品种高，这表明在植
物体中是否可维持较高的 SOD活性与在逆境条件中植物的
抗逆性强弱有一定的关系［6］。
苔藓植物对逆性的环境有着非常强的适应性。大多数
苔藓植物既不会受到虫害，也不会被动物取食，至今为止还
未发现苔藓植物中存在病毒［7］。东亚砂藓(Racomitrium ja-
ponicum)属紫萼藓科(Grimmiaceae)砂藓属(Racomitrium)植
物，植物体挺硬，有时粗壮，常呈疏松成片丛生，存在于低海
拔地区的岩面、岩面薄土和沙石地面上。其在东亚分布较
广，植物体经长时间的干旱，复水后仍能马上恢复新鲜绿色，
继续进行生长，具有较强的抗逆性［7］。随着分子生物学的快
速发展，SOD基因已在水稻、玉米、烟草等植物中进行了比较
深入的研究，但在苔藓植物中相关的研究尚很少。该研究首
次克隆到了东亚砂藓的 Cu /Zn SOD基因片段(GenBank登录
号:JQ659261) ，为进一步克隆东亚砂藓 Cu /Zn SOD基因的全
长序列，以及研究 Cu /Zn SOD在苔藓植物抗逆过程中的作用
提供理论依据与基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料。东亚砂藓采自黑龙江省五大连池，选取
长势较好的材料，用流水冲洗干净后，经 7 ～8 d室温培养，用
镊子取顶端新鲜绿色部分，迅速置于 －80 ℃下保存备用。
1． 1． 2 主要试剂。试验所用大肠杆菌 DH5α购自北京原平
皓生物技术公司;克隆载体 pMD-18T、胶回收试剂盒购自大
连宝生物公司;DNase I 酶购自 Promage 公司;Taq 酶购自上
海生工生物公司;质粒小量提取试剂盒购自 Axygen公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 东亚砂藓总 RNA的提取及 cDNA第一条链的合成。
东亚砂藓总 RNA提取采用改良的 SDS法［8］，用1． 0%的琼脂
糖凝胶电泳检测 RNA的完整性，使用 NanoDrop 2000核酸蛋
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(23):11587 － 11590 责任编辑 朱琼琼 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.23.078
白检测仪测定其纯度和浓度，使用 DNase I酶(Promage)去除
总 RNA中的 DNA污染。
cDNA合成:在 PCR管中加入10 μl纯化的 RNA，1 μl 10
mmol /L dNTPs，1 μl Oligo(dT)18，65 ℃下加热 5 min后，迅速
置于冰上冷却，短暂离心后，依次加入 0． 1 mol /L DTT 2 μl、5
× First-Strand Buffer 4 μl、RNase OUTTM核酸酶抑制剂 1 μl，
混合均匀后 37 ℃下孵育 2 min，室温下加入 1 μl(200 单位)
M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀，37 ℃下孵育 50 min，70 ℃
加热 15 min以终止反应。
1． 2． 2 东亚砂藓 Cu /Zn SOD基因 cDNA 的克隆。根据 Gen-
Bank中已登录的毛尖紫萼藓 Cu /Zn SOD基因 mRNA全长序
列设计特异引物，即 SOD-F:CGCGGATCCCAACCCCTTCA-
AAACCGCTCC;SOD-R:CGAGCTCTTCCGAAGGCATAGCTGC-
TGATC。以 cDNA第 1 链为模板，SOD-F 与 SOD-R 为引物，
进行 PCR扩增，反应条件:94 ℃ 预变性 3 min;94 ℃ 30 s，60
℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40个循环;72 ℃延伸 10 min，完成后取 4
μl PCR产物进行 1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 3 目的基因片段的克隆与鉴定。将含有目的基因的
PCR产物纯化回收，与 pMD18-T载体连接后，转化 DH5α 感
受态细胞，用 LB培养基培养过夜后，用质粒小量提取试剂盒
提取质粒，采用 PCR法鉴定，阳性克隆送至上海生物工程技
术服务有限公司进行测序。
1． 2． 4 序列分析。分析测序结果，推导 ORF及编码蛋白的
氨基酸序列;使用 Pfam 24． 0(http:/ /pfam． sanger． ac． uk /)软
件中的 SEARCH功能对基因进行家族预测;利用 ProtParam
和 ProtScale进行编码蛋白的各种基本理化特性和疏水性分
析;通过 NCBI 的 CDD 数据库(http:/ /www． ncbi． nlm． nih．
gov /Structure /cdd /wrpsb． cgi)预测东亚砂藓 Cu /Zn SOD蛋白
的保守区域;通过 NCBI 的 Blast 工具对目的基因进行分析，
Clustal X软件进行多序列比对;选择与其相似性高的不同植
物的同一蛋白氨基酸序列，使用 MEGA5 软件构建系统进
化树。
2 结果与分析
2． 1 总 RNA的提取及其质量检测 采用改良的 SDS法提
取了东亚砂藓的 RNA，经核酸检测仪检测，其 A260 /A280的比
值在 1． 89 ～1． 95之间，且 1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显
示，28S RNA的亮度约为 l8S RNA的2倍(图1) ，说明所提的
RNA质量很好，可用于反转录试验。
2 ． 2 PCR产物的扩增和克隆 以东亚砂藓cDNA为模板，
通过特异引物进行 RT-PCR扩增，得到长度约 600 bp左右的
图 1 东亚砂藓总 RNA的电泳检测
特异条带(图 2) ，这与预期目的片段大小一致。PCR产物经
纯化后，连接至 T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞，提取
重组质粒，进行 PCR，经电泳检测，所连片段为目的片段，送
交上海生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
注:1、2． PCR产物;M． DNA Marker。
图 2 RT-PCR产物电泳结果
2． 3 东亚砂藓 Cu/Zn SOD基因的序列分析及同源性比较
2． 3． 1 东亚砂藓 Cu /Zn SOD基因的序列分析。将所得测序
结果通过 VecScreen去除载体序列，采用 Bioedit 软件拼接获
得了大小为 565 bp 的基因片段，该序列包含起始密码子
ATG，终止密码子 TAG，且有完整的编码区，其中最大ORF框
长 465 bp，编码 154 个氨基酸残基，将该基因命名为 RjSOD
(GenBank登录号 JQ659261)。
通过 Pfam对 RjSOD 基因进行家族预测，结果显示 Rj-
SOD基因属 Sod Cu 基因家族。对其氨基酸序列进行 Prot-
Param预测，可知该蛋白质的相对分子质量是 15． 5 kD，理论
等电点为 5． 77，负电荷残基(Asp + Glu)总数为 18，正电荷残
基(Arg + Lys)总数为 12，不稳定系数是 13． 36，证明其为稳定
蛋白质。利用 NCBI 的 CDD(Conserved Domain database)数
据库对 RjSOD基因进行蛋白保守区预测，结果显示与该基因
匹配的蛋白保守区共 5个，均为铜锌超氧化物歧化酶超家族
(Cu-Zn Superoxide Dismutase superfamily)特有(图 3)。
图 3 RjSOD基因氨基酸序列的保守区预测
88511 安徽农业科学 2012 年
应用 ProtScale的默认算法(Hphob． /Kyte＆Doolittle)预测
RjSOD基因编码蛋白质的疏水性，发现该蛋白质 N端和 C端
有较强的疏水区，从分布图(图 4)可看出，东亚砂藓 Cu /Zn
SOD蛋白的亲水性不强。
图 4 Cu /Zn SOD基因的疏水性预测
2． 3． 2 东亚砂藓 Cu /Zn SOD 基因核苷酸序列的同源性分
析。通过 Blastn 对 RjSOD基因的核苷酸序列进行同源性分
析，结果显示:东亚砂藓 Cu /Zn SOD基因的核苷酸序列与毛
尖紫萼藓(Grimmia pilifera)Cu /Zn SOD 基因核苷酸序列
(GU989312． 1)的同源性高达 99%，与小立碗藓(Physcomitre-
lla patens，XM_001760752． 1)、东亚小金发藓(Pogonatum in-
flexum，AB079116． 1)、扭口藓(Barbula unguiculata，AB09105-
5． 1)、小金海棠(Malus xiaojinensis，DQ431473． 1)、珍珠粟
(Pennisetum glaucum，EF49535． 1)、大麦(Hordeum vulgare，
AK363344． 1)、玉米(Zea mays，BT087406． 1)、豌豆(Pisum sa-
tivum，AB189165． 1)的同源性分别为 82%、79%、89%、72%、
73%、71%、73%和 74%，这说明该试验成功获得了东亚砂藓
Cu /Zn SOD蛋白基因的部分序列。
2． 3． 3 东亚砂藓 Cu /Zn SOD 基因氨基酸序列的同源性分
析。通过 Blast P 对 RjSOD 基因的氨基酸序列进行比对，结
果显示:其氨基酸序列与毛尖紫萼藓 Cu /Zn SOD基因氨基酸
序列(ADF56045． 1)的同源性高达 99%，与小立碗藓(XP_
001760804． 1)、东亚小金发藓(BAL27543． 1)、北美云杉(Pi-
cea sitchensis，ABK24535． 1)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula，
XP_003626362． 1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon，XP_
003562484． 1)、水稻(Oryza sativa，AAA33917． 1)、绿竹(Bam-
busa oldhamii，ACX94084． 1)、大麦(BAJ94548． 1)同源性分别
为 87%、85%、71%、75%、77%、75%、77% 和 77%(图 5)。
根据 Blast P比对结果，选取其中 10个物种使用 MEGA
图 5 东亚砂藓与几种植物的 Cu/Zn SOD基因编码氨基酸序列比对
5软件利用邻接法构建系统发育树(图 6) ，结果显示，在比较
的物种中东亚砂藓与毛尖紫萼藓的亲缘关系最近，它们与小
立碗藓和东亚小金发藓聚为一类。
图 6 10种植物 Cu/Zn SOD蛋白的聚类分析
3 讨论
根据 NCBI毛尖紫萼藓 Cu /Zn SOD 基因的 mRNA 序列
设计特异引物，通过 RT-PCR克隆得到东亚砂藓 Cu /Zn SOD
蛋白基因片段，序列长度为 565 bp，编码 154 个氨基酸残基，
将该基因命名为 RjSOD。通过其的序列特征、蛋白质理化性
质分析，利用 Blast n、Blast P 进行同源比对，发现东亚砂藓
Cu /Zn SOD蛋白基因具有较高的保守性。系统进化分析表
明，东亚砂藓 Cu /Zn SOD最先与同属紫萼藓科的毛尖紫萼藓
聚类，然后再和小立碗藓聚类。
植物体内主要是通过保护酶与抗氧化的物质来进行活
性氧的清除。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧
化物歧化酶(SOD)等是生物体内重要的保护酶，其中超氧化
9851140卷 23期 于 冰等 东亚砂藓 Cu /Zn SOD基因的克隆及序列分析
物歧化酶起到主要的作用。在 Cu /zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD
3种超氧化物歧化酶中，Cu /Zn SOD在生物体内的分布是最
广的，稳定性也是最高的。研究表明，植物体内抗氧化酶
SOD 活性的提高能增强植物对多种氧化胁迫的抗性［10］。据
报道，超氧化物歧化酶活性的生化指标可作为棉花育种的辅
助选择，在生长发育的后期，SOD 的活性与短季棉早熟而不
早衰的特性直接相关［11］。有关 SOD基因工程改良植物耐旱
性的研究已有了一定的发展，从具有抗旱性的植物中克隆出
SOD基因，并在转基因植株中验证其活性。李文凤等［12］将
乳酸克鲁维酵母中的 Cu /Zn-SOD基因在酿酒酵母W303α菌
株中表达，并通过添加百草枯和热激胁迫对宿主耐受性进行
探讨，结果证明 SOD 酶的表达是菌体抵抗外界压力适应和
生存所必须。吴建慧等［13］将碱茅中的 Cu /Zn-SOD基因转入
酵母中，通过盐碱、氧化胁迫试验检测，结果发现重组酵母的
抗盐碱、抗氧化能力明显增强，从而证明了碱茅 Cu /Zn-SOD
基因在酵母表达中具有提高其抗盐碱和耐氧化能力。通过
对苜蓿及烟草进行转 SOD 基因的研究，发现转化了 SOD 基
因的植株抗氧化、抗寒的能力明显得到增强［14］。
干旱、高盐及低温等缺水胁迫是最主要的影响植物生长
和发育的环境胁迫因素。水资源短缺已成为制约全世界农
业发展的一个重要不利条件。因此，如何提高植物的抗逆
性，成为各国科学家的研究热点。紫萼藓科植物多生长在砂
土或裸露的岩石上，为典型的耐旱藓类，具有很强的耐旱性，
蕴含着大量优质的抗逆基因资源。如果能够将这些抗逆基
因通过现代生物学手段转入其他植物中，不仅可解决粮食产
量低的问题，还可改善生态环境。该试验通过对东亚砂藓
Cu /Zn-SOD基因的克隆，为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱
性以及 Cu /Zn-SOD在苔藓中的抗非生物胁迫方面的功能提
供了理论依据与基础。
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2169 －2174．
(上接第 11572页)
3 结论与讨论
试验从米仔兰枝叶的氯仿和乙酸乙酯萃取物中分离得
到了 4 个含有环戊烷并苯呋喃结构的化合物，经1H NMR、13
C NMR 和 MS 等波谱技术鉴定为 3-Hydroxyrocaglafolin、
aglaroxin E、rocaglamide和 3-Hydroxyaglamide;其中，aglarox-
in E为首次从米仔兰植物中被发现。该研究为深入开发利
用米仔兰资源提供了依据。
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