全 文 ：东亚砂藓甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析
张梅娟1，沙 伟1，2* ，刘 博2，徐红红2
(1．东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040;2．齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔 161006)
摘要 ［目的］克隆东亚砂藓甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因 ＲjGAPDH，并对其进行生物信息学和表达分析。［方法］通过分析东亚砂藓转录
组测序数据，利用 ＲT-PCＲ技术克隆该基因的全长序列，并通过荧光定量 PCＲ分析 ＲjGAPDH基因在不同干旱胁迫时间的表达情况。
［结果］该基因全长为1 208 bp，开放阅读框1 053 bp，编码350个氨基酸，预测蛋白分子量为38． 66 kD，等电点 pI 为 6． 02，不稳定系数为
23． 97，为稳定蛋白;该基因编码的蛋白无跨膜区和信号肽序列，定位于细胞质。在快速干旱胁迫处理过程中，东亚砂藓 ＲjGAPDH基因的
表达量高于正常生长的材料(CK)，能被诱导表达。［结论］ＲjGAPDH基因可能参与东亚砂藓对干旱的胁迫反应，为后续进一步研究其
功能特征奠定基础。
关键词 东亚砂藓;ＲjGAPDH;基因克隆;表达分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)25 －08506 －05
Cloning and Expression Analysis of Glyceraldehyde-3-Phosphate dehydrogenase Gene ＲjGAPDH in Ｒacomitrium japonicum
ZHANG Mei-juan，SHA Wei et al (School of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040;School of Life
Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjiang 161006)
Abstract ［Objective］The research aimed to clone glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene ＲjGAPDH，and analyze its bioinforma-
tion and expression． ［Method］Based on ＲNA-Seq databases of Ｒacomitrium japonicum，ＲjGAPDH gene was cloned by ＲT-PCＲ，and the ex-
pression of ＲjGAPDH in different times under quick dry was detected by real-time PCＲ． ［Ｒesult］The full length cDNA sequence of ＲjGAPDH
gene was 1 208 bp in length，and contained a 1 053 bp open reading frame which encoded a protein of 350 amino acids，molecular weight was
38． 66 kD and theoretical pI was 6． 02． The predicted ＲjGAPDH protein belonged to stable protein，located in cytoplasm without transmem-
brane protein and signal peptide． In the proceed of quick dry，ＲjGAPDH gene could be induced，and the expression level was higher than that
in CK． ［Conclusion］ＲjGAPDH gene was speculated to participate the stress reaction of Ｒacomitrum japonium，and the results laid the founda-
tions for the further study on its function．
Key words Ｒacomitrium japonicum;ＲjGAPDH;Gene clone;Expression analysis
基金项目 国家自然科学基金项目(31070180;31270254) ;黑龙江省自
然科学基金重点项目(ZD201408)。
作者简介 张梅娟(1982 － ) ，女，山东海阳人，博士研究生，研究方向:
植物分子生物学。* 通讯作者，教授，博士生导师，从事苔
藓植物遗传学和分子生物学工作。
收稿日期 2014-07-22
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate de-
hydrogenas，GAPDH)是糖酵解、糖异生和卡尔文循环途径中
的关键酶［1］，参与糖酵解过程中第一个 ATP 的形成，是维持
生命活动能量形成的基本酶类之一［2 －3］。GAPDH存在于所
有生物中，高度保守，且在细胞中含量丰富，占总蛋白的 10%
～20%［4］。由于 GAPDH在生物体不同组织和细胞中高丰度
表达且非常稳定，因此，一直以来被人们当作“管家”基因，用
作研究目标基因相对表达的内参对照［5］。但随着研究的深
入发现，当外界环境发生改变时(如无氧胁迫，伤害，高温，高
盐碱和干旱) ，GAPDH在 mＲNA和蛋白质水平上也会随之发
生改变，并大量积累表达［6 －7］，表明其与抗逆代谢有一定的
关联，且可以定位于除细胞质之外的质膜、细胞核、多聚体、
内质网与高尔基体上，功能呈现多样性［8 －9］。目前，已从许
多植物中克隆得到 GAPDH 基因，并对其开展参与逆境胁迫
的分子响应机制研究［3，6，10 －16］，发现其在增强植物抗旱性方
面具有一定的功能［17 －18］。
东亚砂藓(Ｒacomitrium japonicum)隶属于紫萼藓科
(Grimmiaceae)砂藓属(Ｒacomitrium) ，生于低海拔地区的岩
面、岩面薄土和砂地面上，有时见于石壁上或近树基部地上，
在我国南北多省区广泛分布［19］。东亚砂藓在干燥状态下呈
休眠状态，复水后可短时间内恢复生活力，是典型的耐旱藓
类，但有关与其抗旱性相关的分子生物学研究很少。笔者对
东亚砂藓转录组测序数据进行分析，发现 1 条与 GAPDH基
因同源性较高的基因序列，以此设计引物，克隆获得该基因
的全长序列，并对其生物信息学和快速干旱胁迫下的表达情
况进行了分析，为深入研究 GAPDH 基因的抗旱功能提供理
论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂 东亚砂藓采于黑龙江省五大连池风景
区。材料采回后进行组织培养试验，以获得的无菌组培苗作
为后续试验材料。
选取生长旺盛、高约 1． 5 cm的无菌组培苗植株，用镊子
快速将附着根部的培养基去除，放入平皿中，分 2部分处理。
一部分直接用液氮速冻，放入 － 80 ℃冰箱保存，用于 ＲjGAP-
DH基因的克隆。另一部分用硅胶进行快速干旱处理，处理
时间为 10、20、30和 60 min，同时以未经处理的材料作为对照
(CK) ，液氮速冻后于 － 80 ℃冰箱保存，用于 ＲjGAPDH 基因
的表达验证分析。
ＲNAse抑制剂、DNaseⅠ购自 Promega 公司;Oligo(dT)15、
dNTP和 M-MLV反转录酶购自 Invitrogen公司;pMD 18-T载
体、DNA Marker 购自 Takara 公司;Sso Fast TM Evagreen Su-
permix购自 Bio-Ｒad公司;大肠杆菌 E． coli DH5α 由齐齐哈
尔大学遗传学实验室保存;其他生化试剂均购自上海生工生
物工程有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;
荧光定量表达分析于 Bio-Ｒad公司的 CFX-96仪器上进行。
责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(25):8506 － 8510
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.25.012
1． 2 总 ＲNA的提取及 cDNA第一链的合成 参照宋晓宏
等［20］和沙伟等［21］方法提取上述样品的总 ＲNA，用 NanoDrop
2000微量紫外分光光度计测定样品的浓度和 OD260 /OD280，
并用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。为防止总 ＲNA
中残留的基因组 DNA 干扰后续试验，利用 Promega 公司的
DNase I 对总 ＲNA 进行纯化。以总 ＲNA 为模板，以 Oligo
(dT)15为反转录引物，用 M-MLV 反转录酶合成 cDNA 第一
链，具体方法参照 M-MLV试剂盒说明书进行。
1． 3 ＲjGAPDH基因的克隆及生物信息学分析 根据获得
的东亚砂藓转录组数据库中 GAPDH基因的序列，利用 NCBI
中的 OＲF Finder查找较长的完整开放阅读框(OＲF) ，设计扩
增包含 GAPDH基因起始密码子的上游引物 ＲjGAPDH-A(5-
TGCTTCGGTGAGCCCTGGTGGAG-3)和包含终止密码子的
下游 引 物 ＲjGAPDH-S (5-TTGCCTTTCACCACCCCCCGTC-
3) ，预期目的片段大小为 1 208 bp。PCＲ扩增体系为 20 μl，
包含2 μl 10 × Buffer，1． 5 ng模板，1． 0 μl dNTP(10 mmol /L) ，
0． 8 μl 上游引物或下游引物(10 μmol /L) ，Ex Taq 酶 0． 20
μl，14． 2 μl ddH2O。反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 40 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环;72 ℃延
伸 10 min。将 PCＲ产物进行凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收
目的产物，连接到 pMD 18-T载体上，转化到大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，经 Amp +抗性及蓝白斑筛选，将验证转化成功
的菌株送北京华大基因公司测序。
利用 NCBI 网站进行 BLAST比对和蛋白的保守结构域
分析;用 DNAMAN软件进行核苷酸的序列翻译和多重比对;
利用 ProtParam 程序(http:/ /web． expasy． org /protparam/)预
测蛋白的基本理化性质;用 SingalP 4． 1(http:/ /www． cbs．
dtu． dk /services /SignalP /)检测信号肽结构;用 TMpred(ht-
tp:/ /www． ch． embnet． org /software /TMPＲED_form． html)预测
跨膜结构域;用 Protscale(http:/ /web． expasy． org /protscale /)
预测亲 /疏水性;利用 PSOＲT Prediction(http:/ /psort． hgc． jp /
form． html)进行亚细胞定位预测;用 SOPMA(http:/ /npsa-
pbil． ibcp． fr /cgi-bin /npsa_automat． pl?page = npsa_sopm． ht-
ml)预测二级结构。利用 MEGA5． 0软件构建系统进化树。
1． 4 ＲjGAPDH基因的表达分析 根据东亚砂藓 ＲjGAPDH
基因序列设计荧光定量 PCＲ引物 ＲjGAPDH-qF(TCAGGATT-
GGCATCAATGG)和 ＲjGAPDH-qＲ (GATCGAAGCAGAGCG-
TCTGCTC) ，以表达稳定性好的 Actin基因为内参基因，并设
计内参引物 Actin-F(GGCGATTCAGGCAGTGTT)和 Actin-Ｒ
(TCAGTGCGTCCGTCAAGT) ，进行荧光定量表达分析。反应
体系为 SsoFast EvaGreen supermix(2 ×)10 μl，引物各 1． 0 μl
(10 μmol /L) ，模板 cDNA 0． 5 μl(100 ng /μl) ，ddH2O补至20
μl。反应条件为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，
35个循环。每个反应设 3 个重复，采用 2 － ΔΔCt法分析基因的
相对表达量。
2 结果与分析
2． 1 总 ＲNA的提取及 ＲjGAPDH基因的克隆 总 ＲNA质
量的好坏对后续试验至关重要。用改良的 SDS法所提取东
亚砂藓总 ＲNA经琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰，完整性良
好，OD260 /OD280 = 1． 8 ～ 2． 0，总 ＲNA 质量较好。
根据 GAPDH基因 OＲF序列设计的引物，在东亚砂藓中
扩增得到一条与预期片段大小基本一致的特异产物(图 1)。
将此特异片段回收，克隆到 pMD 18-T载体上，经测序验证，
与预期片段序列也一致，说明克隆所得序列为 GAPDH 基因
编码框全长 cDNA，命名为 ＲjGAPDH。
注:M． DL2000．
图 1 ＲjGAPDH基因 OＲF扩增
2． 2 ＲjGAPDH基因的序列分析 ＲjGAPDH 基因 cDNA 全
长为 1 208 bp，包含 1个 1 053 bp的 OＲF，编码 350个氨基酸
残基(图 2)。预测的蛋白分子量为 38． 66 kD，理论等电点 pI
为 6． 02，不稳定系数为 23． 97，属于稳定蛋白(＜ 40 蛋白稳
定) ，有 46个氨基酸残基(Asp + Glu)带正电荷，46 个氨基
酸残基(Arg + Lys)带负电荷;经 SignalP 4． 0和 TMpred程序
检测 ＲjGAPDH基因编码的蛋白不含信号肽序列且无跨膜
区，为非分泌型蛋白;Protscale 程序预测发现该蛋白为亲水
性蛋白;PSOＲT Prediction预测亚细胞定位于质膜。NCBI 中
的 Conserved Domains分析表明，ＲjGAPDH 蛋白具有 2 个保
守区(图 3) ，一个为 Gp_dh_N，该序列是典型的 NAD +结合
域，另一个为 Gp_dh_C，其 C端是 α螺旋和反平行 β折叠的
混合结构，是行使糖运输和糖代谢的催化功能区。利用
SOPMA程序预测二级结构显示，ＲjGAPDH蛋白含有 120 个
α螺旋，占 34． 29%;含 79 个延伸链，占 22． 57%;含 34 个 β
折叠，占 9． 71%;含有 117个无规则卷曲，占 33． 43%(图 4)。
将 ＲjGAPDH cDNA 序列通过 NCBI 进行 BLAST 同源性
比对，结果显示 ＲjGAPDH 蛋白与其他物种的 GAPDH 蛋白
具有较高相似性，与马铃薯(Solanum tuberosum)、甜橙(Citrus
sinensis)、毛果杨(Populus trichocarpa)、烟草杂交种(Nicotiana
langsdorffii × Nicotiana sanderae)、烟草(Nicotiana tabacum)、
地钱(Marchantia polymorpha)、菠萝(Ananas comosus)、鹰嘴豆
(Cicer arietinum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等的相似性均
在 64%以上。系统进化树分析表明，以上 10 个物种的 GAP-
DH蛋白大概分为 3类，东亚砂藓与马铃薯和毛果杨的亲缘
关系较近，来自同一个进化支(图 5)。
705842 卷 25 期 张梅娟等 东亚砂藓甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析
注:阴影为起始密码子和终止密码子。
图 2 ＲjGAPDH cDNA序列及推导的氨基酸序列
图 3 ＲjGAPDH蛋白结构域预测
注:蓝． α螺旋;红．延伸链;绿． β转角;粉红．无规则卷曲。
图 4 ＲjGAPDH蛋白二级结构预测
2． 3 ＲjGAPDH基因的表达分析 东亚砂藓 ＲjGAPDH基因
在不同快速干旱胁迫时间下的表达变化见图 6。在整个干旱
胁迫过程中，ＲjGAPDH基因均能诱导表达，表达量呈先升高
后降低的趋势。快速干旱 10 min 时，ＲjGAPDH 基因表达量
迅速升高，约为对照的 8． 7倍;随着胁迫时间的延长，表达量
呈逐渐下降的趋势，当快速干旱 60 min时，表达量最低，约为
8058 安徽农业科学 2014年
图 5 GAPDH蛋白的系统进化分析
对照的 1． 61倍。说明 ＲjGAPDH基因受到干旱胁迫的诱导表
达，能对干旱胁迫作出防御反应。
图 6 快速干旱胁迫下 ＲjGAPDH基因的表达分析
3 讨论
甘油醛-3-磷酸脱氢酶在高等植物中以 2种形式存在，一
种是由 GAPA和 GAPB 2 个亚基组成的存在于叶绿体中的
GAPDH，主要参与卡尔文循环;一种是由 4 个同种亚基
GAPC组成的存在于细胞质中的 GAPDH，主要参与糖酵解和
糖异生过程。GAPA 和 GAPB 的同源性较高，可达 80%，而
GAPC与两者的同源性较低，小于 45%［22］。该研究通过 ＲT-
PCＲ法从东亚砂藓中克隆得到含完整编码序列的 ＲjGAPDH
基因全长序列，对其生物信息学和同源序列分析发现，该基
因编码的氨基酸序列具有 Gp_dh_N和 Gp_dh_C 2个保守区，
符合 GAPC亚基的结构特征，且亚细胞定位于细胞质，与马
铃薯和毛果杨等植物细胞质中 GAPDH基因氨基酸序列的同
源性较高，因此认为该基因为位于细胞质中的 GAPDH基因。
在逆境胁迫下，GAPDH可参与多种有异于糖酵解和糖
异生过程中的生理生化途径，能抵御逆境胁迫对植物造成的
伤害［23］。目前，有关植物 GAPDH基因应答逆境胁迫的报道
较多。BAEK等［24］将 GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中
发现，该基因能强烈抑制热胁迫时 H2O2 的产生和细胞的死
亡。于丽丽等［14］研究发现，刚毛柽柳(Tamari hispid)在受到
PEG、NaCl、CdCl2 和 NaHCO3 胁迫时，ThGAPDH 基因的表达
量发生明显变化，具有对胁迫的应答能力。张旸等［3］克隆得
到星星草 PtGAPDH 基因，Northern 杂交分析显示，随着
Na2CO3 溶液浓度的增加，PtGAPDH 基因在盐碱胁迫下叶片
和根部表达量都显著升高;超过最大耐受量后，PtGAPDH 基
因表达丰度逐渐降低。ZIAF等［25］发现，在干旱等各种胁迫
下，野生型番茄(Solanum pennellii)的 ADH和 GAPDH基因能
被诱导表达，而植物膜脂过氧化的程度则随之减轻。MEＲE-
WITZ等［26］在研究含有衰老响应启动子 SAG12 和 IPT 基因
的转基因植物匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)时发现，耐旱
植物的叶在水分胁迫下衰老更慢，而在水分亏缺时，该植物
的 GAPDH 蛋白含量较高，增加了植物的抗性。齐晓花等［15］
以黄瓜(Cucumis sativus)耐涝品系“早二 N”为材料，研究3–
磷酸甘油醛脱氢酶基因 CsGAPDH 时得出，CsGAPDH 属于黄
瓜涝胁迫响应基因，在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要
的调控作用。该研究中，当东亚砂藓受到干旱胁迫时，Ｒj-
GAPDH基因明显诱导表达，说明干旱胁迫可使糖酵解途径
增强，糖代谢能力明显加强，有一定的抗胁迫功能，推测该基
因可能参与了东亚砂藓的抗逆调控并发挥作用。
为明确 ＲjGAPDH基因的功能，正在进行遗传转化模式
植物的研究，为进一步研究东亚砂藓的抗旱机制提供参考。
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(上接第 8501页)
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