全 文 ：第 19卷　第 2期
2003年 6月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal of Fujian No rmal Univ ersity ( Natural Science)
Vo l. 19　 No. 2
Jun. 2003
文章编号: 1000-5277( 2003) 02-0069-03
濒危植物刺桫椤 RAPD反应体系的优化
黄儒珠1 , 王经源2
( 1. 福建师范大学生物工程学院 , 福建 福州　 350007; 2. 福建农林大学生命科学院 , 福建 福州　 350002)
　　摘要: 以高盐 SDS法提取濒危植物刺桫椤 (Alsophila spinulosa) 嫩叶总 DNA, 进行 RAPD分析 , 分别
研究了模板 DN A、 引物、 dN TP、 Mg2+ 和 Taq DN A聚合酶用量以及反应体积对反应结果的影响 . 筛选并建
立了适合于刺桫椤 RAPD扩增的反应体系: 反应体积 10μL , 内含 2 ng /μL模板 DN A, 2. 0 mmo l / L MgCl2 ,
0. 3μmo l /L引物 , 300μmo l /L dN TP, 0. 5 u Taq DNA聚合酶 .
关键词: 刺桫椤 ; RAPD; 反应体系 ; 优化
中图分类号: Q946　　　文献标识码: A
　
应用 RAPD ( random ampli fied polymorphic DN A)技术对国家首批公布的一级重点保护植物刺桫
椤 ( Alsophila spinulosa) [1 ]进行遗传多样性分析 , 从分子水平上揭示其致濒机制 , 有助于制定科学的保
育策略 . RAPD标记使用的引物长度一般为 10个碱基 , Tm值较低 , 因而其 PCR反应易受实验条件的
影响 . 对刺桫椤进行 RAPD分析 , 首先要建立一个稳定的反应体系 , 以确保 RAPD结果的可靠性 . 为
此 , 本文作者就刺桫椤 RAPD反应中的模板 DN A、 引物、 dN TP、 Mg2+ 和 Taq DN A聚合酶用量以及
反应体积对反应结果的影响进行了探讨 , 筛选并建立一个稳定的反应体系 , 为刺桫椤的遗传分析提供
一个标准化程序 .
1　材料与方法
1. 1　模板 DNA的制备及其质量检测
将采自福建省福州市森林公园未完全伸展的拳卷状刺桫椤嫩叶 , 按高盐 SDS法提取模板总 DNA
并进行质量检测 [2 ] .
1. 2　RAPD反应体系优化
以刺桫椤总 DNA为模板 , 分别采用 S66 ( GAACGGACTC) , S1405 ( CCCG AAGCGA) , S1418
( CTGGCGTGTC) 为引物 , 在 M J PTC-100型 PCR仪上进行 RAPD扩增反应 . 初始条件为: 反应体
积 10μL,内含 5 ng /μL模板 DNA, 2. 0 m mol /L MgCl2 , 0. 2μmol /L引物 , 300μmol /L dN T P, 0. 5
u Taq DN A聚合酶及其 Buf fer. 扩增程序为: 94℃预变性 4 min. 然后于 94℃变性 30 s, 36℃复性 40
s, 72℃延伸 90 s,循环 42次 . 再在 72℃延伸 7 min后于 4℃保存 . 扩增产物用 100 bp DN A ladder作
为相对分子量标准 , 在 1. 5%琼脂糖凝胶上 , 于 3 V /cm电场中电泳 , 溴乙锭染色 30 min后 , 在 BIO-
RAD凝胶成像仪上检测并照像记录 .
RAPD反应体系优化时 , 固定扩增程序 , 每次改变 RAPD反应中的 1个参数 , 以确定该参数对
RAPD结果的影响 . 筛选的参数包括: ( 1) 模板 DNA质量浓度 ; ( 2) 反应体积 ; ( 3) Taq DN A聚合


作者简介: 黄儒珠 ( 1957—　 ) , 女 , 福建屏南人 , 副教授 .
基金项目: 福建省教委基金资助项目 ( JA99143)
收稿日期: 2002- 11- 05
酶用量 ; ( 4) 引物用量 ; ( 5) dN T P浓度 ; ( 6) M g2+浓度 .
上述所用 RAPD引物、 酶及有关试剂均购自上海 Sangon公司 .
2　结果与分析
2. 1　模板 DNA质量浓度对 RAPD的影响
模板 DNA质量浓度是影响 RAPD扩增产物产率与特异性的一个重要因子 .模板质量浓度太低 ,则
扩增产物产量低或不稳定 ; 模板质量浓度太高 , 则可能增加非特异产物的扩增 . 图 1泳道 1～ 7是不同
模板 DNA质量浓度 (从 0. 5 ng /μL倍增至 32 ng /μL) 下 , 以引物 S1405进行 RAPD扩增的结果 . 从
图 1可以看出 , 模板 DNA用量在 1～ 8 ng /μL范围内能获得较为一致的扩增结果 . 模板 DNA质量浓
度较高 ( 16 ng /μL) 的扩增带较弱 , 尤其对相对分子量小的扩增带的影响更为明显 , 如 230 bp和 390
bp两条带不能得到有效扩增 . 模板 DNA质量浓度太高 ( 32 ng /μL) 则扩增结果产生弥散现象 , 不能
得到清晰的条带 . 模板 DNA质量浓度太低也影响部分条带的扩增强度 , 当模板 DNA质量浓度为 0. 5
ng /μL时 , 230 bp的条带变弱 . 说明对于刺桫椤的 RAPD扩增 ,较适的模板 DNA质量浓度范围为 1～
8 ng /μL, 这与 Low e等 [3 ]的研究结果基本一致 . Low e等认为 50μL的反应体积 , 模板 DNA的量在 5
～ 500 ng之间常可以得到较好的结果 , 10～ 50 ng是最适宜的 .
2. 2　反应体积对 RAPD的影响
图 1泳道 8～ 12是不同反应体积 ( 7. 5、 10、 15、 20、 25μL) , 内含 5 ng /μL模扳 DNA, 同样以
S1405为引物的 RAPD扩增结果 . 由图可见不同反应体积的扩增结果基本一致 , 即改变反应体积 (在
7. 5～ 25μL范围内 ) 对扩增结果基本没有影响 .
2. 3　 Taq DNA聚合酶用量对 RAPD的影响
在 PCR反应中 , Taq DN A聚合酶用量受到反应体积、酶活、酶的耐热性及反应程序等因素的影响 .
为了确定刺桫椤 RAPD反应中 Taq DN A聚合酶的适宜用量 , 试验选择 4个酶梯度 , 分别为 0. 5、 1. 0、
1. 5和 2. 0 u /反应 . 结果表明 Taq DN A聚合酶的用量在 0. 5～ 2. 0 u /反应范围内扩增结果差异不大
(图 2泳道 1～ 4) . 因此 0. 5 u /反应的酶量对 10μL的反应体积已足够 .
M. 100 bp DN A ladder; 1～ 7. 模板 DN A浓度: 分别为 0. 5、 1、
2、 4、 8、 16、 32 ng /μL; 8～ 12. 反应体积: 分别为 7. 5、 10、 5、
20、 25μL
图 1　模板 DN A浓度及反应
体积对 RAPD的影响
2. 4　引物浓度对 RAPD的影响
分别以 0. 1、 0. 2、 0. 3、 0. 4、 0. 5μmol /L5个
引物浓度梯度进行 RAPD扩增 , 结果表明引物浓度
对 RAPD扩增结果有较大的影响 . 从图 2 (泳道 5～
9)可以看出 ,当引物 S1405浓度为 0. 1μmol /L时 ,
所得的扩增带较弱 , 且相对分子量分别为 230、 390、
930 bp的 3条带不能得到有效的扩增 ; 引物浓度在
0. 2～ 0. 4μmol /L范围内 ,扩增结果较为一致 ,当浓
度增加到 0. 5μmol /L时 , 一些条带的强弱发生改
变 , 相对分子量为 950、 1060 bp的两条带变弱 , 相
对分子量为 230、 740 bp的条带明显增强 .
2. 5　 dNTP浓度对 RAPD的影响
dN TP是 Taq DN A聚合酶的底物 , 其浓度将直
接影响 RAPD扩增产物的量 ,同时也可能影响 Taq DN A聚合酶的活性和扩增的特异性 .用引物 S66对
100、 200、 300、 400μmol /L4个水平的 dN T P浓度进行的试验结果表明 , 当 dN TP浓度为 100μmol /
L时 , 扩增条带很弱 , 且有一条大小为 720 bp的带不能有效扩增 . 在 200～ 400μmol /L范围内扩增带
则基本一致 ,但带的强度有明显的不同 (图 3) . 考虑到带的强度和清晰度两方面 ,选择 300μmo l /L的
70 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 　　　　　　　　　　　 2003年　
dN TP浓度用于刺桫椤的 RAPD扩增较为适宜 .
M. 100 bp DNA ladder; 1～ 4. Taq DNA聚合酶
用量: 分别为 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0 u;
5～ 9.引物浓度: 分别为 0. 1、 0. 2、 0. 3、 0. 4、
0. 5μm ol /L
图 2　 Taq DN A聚合酶用量和
引物浓度对 RAPD的影响
M. 100 bp DN A ladder;
l～ 4. d N TP浓度: 分别为 100、 200、
300、 400μmol /L
图 3　 d N T P浓度
对 RAPD的影响
l～ 7. Mg2+浓度:
分别为 1. 0、 1. 5、 2. 0、 2. 5、 3. 0、 3. 5、
4. 0 mmol /L
图 4　 Mg2+浓度对
RAPD的影响
2. 6　Mg2+ 浓度对 RAPD的影响
Mg
2+ 是 Taq DN A聚合酶的激活剂 , 太低或太高都将影响酶的活性 , 此外其浓度还影响引物与模
扳的解链与退火 . 图 4显示了不同 Mg2+ 浓度对 RAPD扩增结果的影响 , 结果表明 , 以 S1418为引物 ,
Mg
2+ 浓度为 1. 0 mmo l /L时 , 扩增产物较少 , 条带模糊难辨 , 浓度为 1. 5～ 2. 5 mmol /L能扩增出清晰
的 DNA条带 , 随着 Mg2+浓度的进一步提高 , 扩增条带逐渐减弱 , 且变得难以识别 . 因此 2. 0 mmol /
L的 Mg2+浓度是进行刺桫椤 RAPD扩增的最适浓度 .
3　小结
综合考虑上述各因素对 RAPD扩增的影响 ,最后选定刺桫椤 RAPD扩增反应体系为: 反应体积 10
μL, 内含 2 ng /μL模板 DNA, 2. 0 mmol /L M gCl2 , 0. 3μmol /L引物 , 300μmol /L dN TP, 0. 5 u Taq
DN A聚合酶及其 Buffer. 扩增程序: 94℃预变性 4 min. 然后于 94℃变性 30 s, 36℃复性 40 s, 72℃
延伸 90 s, 循环 42次 . 最后进 72℃延伸 7 min.
参考文献:
[ 1]国家环境保护局 , 中国科学院植物研究所 . 中国珍稀濒危保护植物名录: 第一册 [ M ]. 北京: 科学出版社 , 1987.
[ 2] 王经源 , 黄儒珠 . 刺桫椤 DN A的简便快速提取方法 [ J]. 福建林学院学报 , 2001, 21 ( 4): 376- 379.
[ 3 ] Lowe A J, Hano tte O , Guarino L. Standardiza tion o f molecular g enetic tech niques fo r the cha racterization of
g erm plasm collections: the ca se o f random amplified polymo rphic DN A ( RAPD ) [ J]. Plant Genetic Resources
New slet ter, 1996, 107: 50- 54.
(下转第 81页 )
71　第 2期　　　　　　　　　　　黄儒珠等: 濒危植物刺桫椤 RAPD反应体系的优化
( 3) 不同树上的圆盖阴石蕨其地上部分的黄酮含量明显高于地下部分的含量 . 这可能是由于地上
部分的纤维素等机械组织和运输组织的含量明显低于地下部分的缘故 .
参考文献:
[ 1]周铜水 , 周荣汉 . 骨碎补类生药商品的调查和性状鉴定研究 [ J] . 中国中药杂志 , 1993, 18 ( 12): 710- 712.
[ 2]福建省科学技术委员会 , 福建植物志编写组 . 福建植物志: 第一卷 [ M ]. 福州: 福建科学技术出版社 , 1982.
[ 3]蒋道松 , 陈德懋 . 神农架蕨类植物生态分布规律研究 [ J]. 武汉教育学院学报 , 2000, 19 ( 3): 19- 24.
[ 4]周铜水 , 林东武 . 12种骨碎补黄酮类成分定性定量分析 [ J]. 中国药科大学学报 , 1996, 27 ( 9): 540- 543.
[ 5]唐孟成 , 贾之慎 , 朱祥瑞 , 等 . 春秋桑叶中黄酮类化合物总量及提取方法比较 [ J]. 浙江农业大学学报 , 1996 ( 4):
394- 398.
[ 6]中国科学院上海药物研究所 . 中草药有效成分提取与分离 . 第二版 [ M ]. 上海: 上海科学技术出版社 , 1983.
[ 7] 肖崇厚 . 中药化学 [ M ]. 上海: 上海科学技术出版社 , 1996.
A Study on the Total Flavonoids inHumata tyermanni
LIN Yun-l iang, CHEN Bing-hua, LIU Jian-qiu
(Bioengineering College , Fujian Normal University , Fuzhou 350007, China )
Abstract: The rutin was used as a standa rd compound . Ex tracted by ethano , f lav onoids produced
colour wi th aluminium nit rate that was quanti ta ted by measurement of the abso rbance at 510 nm. The
resul t show s tha t: The stabi li zation and duplication a re good. The content of to tal f lav onoids in
Humata tyermanni o f the same grow th period co llected f rom ten kinds of t rees indicated a certain
rela tionship wi th the g rowing area. The content o f to tal flavonoids f rom leaves is from 0. 595% ～
3. 508% , while the content o f total f lav onoids f rom stem is f rom 0. 226% ～ 1. 34% .
Key words: Humata tyermanni Moo re; total f lav onoids ; spectrophotometry
(责任编辑　余　望 )
(上接第 71页 )
Optimal Choice for Reaction System in RAPD
Analysis of Alsophila spinulosa
HUANGRu-zhu
1 , WANG Jing-yuan
2
( 1. Bioengineering College , Fujian Normal University , Fuzhou 350007, China;
2. College of L ife Science , Fujian Agriculture and Forestry Univ ersity , Fuzhou 350002, China)
Abstract: The DN A templates of Alsophila spinulosa ex t racted f rom young leaf w ere ampli fied by
RAPD. Ef fects o f the content o f DN A templa tes, primers, dN T P, M g
2+
, Taq DN A po lymerase and
to tal reaction volume on experimental resul ts w ere tested and the optimal reaction system o f RAPD fo r
A. spinulosa was determined a s fo llow s: 2ng /μL DNA template, 2. 0 mmol /L MgCl2 , 3. 0μmol /L
primer, 300μmo l /L dN TP, 0. 5 u Taq DN A polymerase in to tal 10μL reaction volume.
Key words: Alsophila spinulosa; RAPD, reaction sy stem; optimal choice
(责任编辑　余　望 )
81　第 2期　　　　　　　　　　　　　林云良等 : 圆盖阴石蕨黄酮类化合物的研究