全 文 ：书第３５卷　第４期
２０１３年１２月 　 　　　　　
延　边　大　学　农　学　学　报
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　　　　
Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．４
　Ｄｅｃ．２０１３
收稿日期：２０１３－０９－２０　基金项目：吉林省科技支撑计划重点项目（２０１２０２５１）
作者简介：郑美香（１９８８—），女（朝鲜族），吉林龙井人，延边大学农学院，在读硕士。宗成文为通讯作者，
　　　　 Ｔｅｌ：０４３３－２４３５５８８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｏｎｇｃｈｅｎｇｗｅｎ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
长白山笃斯越桔离体器官再生不定芽的研究
郑美香，　宗长玲，　宋春艳，　曹后男，　宗成文＊
（延边大学农学院，吉林 延吉１３３００２）
摘要：以长白山笃斯越桔组培苗为试材，研究了外植体类型、培养基种类、植物生长调节剂组合、暗培养时间
对笃斯越桔不定芽再生的影响。结果表明，以组培苗叶片为外植体的再生不定芽效果好于叶柄和无芽茎段，
基本培养基中以改良 ＭＳ最为适合，１／２改良 ＭＳ、１／４改良 ＭＳ培养基均不利于不定芽的再生，培养基中添加
ＺＴ的诱导效果好于ＴＤＺ、ＩＢＡ。改良ＭＳ为基本培养基附加ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ和ＩＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ，暗培养１４ｄ后转
到光下培养３０ｄ，可以使再生频率达到７８％，再生芽数达到１２．６。
关键词：笃斯越桔；离体器官；再生；不定芽
中图分类号：Ｓ６６６．９　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００４－７９９９（２０１３）０４－０２９３－０５
笃斯越桔（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ　ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍＬｉｎｎ．）又称笃斯、黑豆树（大兴安岭），甸果、地果（吉林、临江）、龙果、
蛤塘果（吉林）、讷日苏（蒙古族语），鄂温克（ｊｉｇｄａ）。是我国重要的野生浆果资源，具有许多特殊的优良性
状，如抗寒能力极强、花青素含量高等［１－４］，是越桔育种的宝贵资源。目前，国内有关于笃斯越桔以单芽茎段
和单芽为试材离体培养及再生植株研究的报道［５］，此外，刘永富［６］等以笃斯越桔去叶带芽嫩茎为试材，研究
组培快繁技术，但利用笃斯越桔组培苗叶片、叶柄、无芽茎段为外植体材料建立再生体系的研究在国内外迄
今尚未见研究报道。本文拟以外植体类型、培养基种类、植物生长调节剂组合、暗培养时间对笃斯越桔不定
芽再生的影响进行研究，结果将为笃斯越桔大规模快繁和进一步的组培诱变、基因工程育种提供理论基础。
１　材料与方法
１．１　材料
以本实验室保存的长白山笃斯越桔组培苗的叶片、叶柄及无芽茎段作为材料。
１．２　方法
１．２．１　笃斯越桔组培苗不同部位对不定芽形成的影响
取２５～３０ｄ幼龄的笃斯越桔组培苗的叶片、叶柄、无芽茎段，在无菌操净工作台上将３种材料切成
３ｍｍ×３ｍｍ的小块，接种在改良 ＭＳ培养基，附加２．０ｍｇ／Ｌ　ＺＴ、０．３ｍｇ／Ｌ　ＩＢＡ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、琼脂８ｇ／Ｌ、
ｐＨ值调制为４．２的培养基上，暗培养１４ｄ之后光照培养。每个培养瓶接种５个叶片，每个处理接种９瓶作
为重复。培养４０ｄ后，调查不定芽再生频率和平均再生芽数。
１．２．２　不同培养基和植物生长调节剂对不定芽形成的影响
选取幼嫩的笃斯越桔组培苗顶端叶片，用上述１．２．１的方法切成小块后，放于培养基上培养。试验采用
Ｌ９（３４）正交试验设计（表１），４因素及３个水平分别是：基本培养基（改良 ＭＳ、１／２改良 ＭＳ、１／４改良 ＭＳ）、
ＺＴ（１．０、２．０、３．０）ｍｇ／Ｌ、ＩＢＡ（０．１、０．３、０．５）ｍｇ／Ｌ。另外添加蔗糖３０ｇ／Ｌ、琼脂８ｇ／Ｌ，ｐＨ值调制为４．２。每
个培养瓶接种５个叶片，每个处理接种９瓶作为重复。经过暗培养１４ｄ后光照下培养４０ｄ，调查不定芽再
生频率、平均再生芽数。
DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2013.04.009
延　边　大　学　农　学　学　报 第３５卷　
表１　试验因子水平
Ｔａｂｌｅ１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｌｅｖｅｌ
因子水平
Ｆａｃｔｅｒ　ｌｅｖｅｌ
因子及其代号Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｃｏｄｅｓ
（Ａ）基本培养基 Ｍｅｄｉｕｍ （Ｂ）ＺＴ／（ｍｇ／Ｌ） （Ｃ）ＩＢＡ／（ｍｇ／Ｌ）
１
２
３
改良 ＭＳ
１／２改良 ＭＳ
１／４改良 ＭＳ
１
２
３
０．１
０．３
０．５
１．２．３　不同细胞分裂素对不定芽形成的影响
以改良 ＭＳ培养基为基本培养基，分别附加 ＴＤＺ、ＺＴ 、６－ＢＡ　２、２、５ｍｇ／Ｌ，ＩＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ，蔗糖
３０ｇ／Ｌ，琼脂８ｇ／Ｌ，ｐＨ值调制为４．２，暗培养１４ｄ。每个培养瓶接种５个叶片，每个处理接种９瓶作为重
复。培养４０ｄ后统计不定芽再生频率和平均再生芽数。
１．２．４　不同生长素对笃斯越桔不定芽形成的影响
以改良 ＭＳ为基本培养基，加入ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ后，分别附加０．３ｍｇ／Ｌ的ＩＢＡ、ＩＡＡ及ＮＡＡ。另外添加
蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂８ｇ／Ｌ，ｐＨ值调制为４．２，暗培养１４ｄ。每个培养瓶接种５个叶片，每个处理接种９瓶作为
重复。培养４０ｄ后调查不定芽再生频率、平均再生芽数。
１．２．５　暗培养时间对不定芽形成的影响
将笃斯越桔组培苗的叶片用上述１．２．１的方法切成小块后，接种在改良 ＭＳ培养基上，附加２．０ｍｇ／Ｌ
ＺＴ，０．３ｍｇ／Ｌ　ＩＢＡ，蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂８ｇ／Ｌ，ｐＨ值调制为４．２。暗培养处理时间分别设置为０、７、１４、２１ｄ。
每个培养瓶接种５个叶片，每个处理接种９瓶作为重复，培养４０ｄ后调查不定芽再生频率、平均再生芽数。
１．２．６　统计方法
采用ＳＰＳＳ　ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ１１．５统计分析软件包对实验结果进行方差分析，显著性测验。正交设计进行极
差分析。
２　结果与分析
２．１　笃斯越桔组培苗不同部位对不定芽形成的影响
由表２可知，组培苗叶片再生频率和再生芽数分别为７８％和１２．６，明显高于无芽茎段和叶柄。叶片再
生芽数比较多，而叶柄和无芽茎段很少产生丛生芽，说明组培苗叶片适合做再生材料。
表２　笃斯越桔组培苗不同部位对再生的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｐａｒｔ　ｏｎ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ　ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
再生频率／％
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
再生芽数
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ
叶片Ｌｅａｆ　 ７８ａ １２．６ａ
叶柄Ｐｅｔｉｏｌｅ　 ５ｃ ０．２ｃ
无芽茎段Ｓｔｅｍｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｂｕｄ　 ２０ｂ ２．０ｂ
２．２　不同培养基和植物生长调节剂对不定芽形成的影响
由表３可知，最优的离体叶片再生不定芽培养基组合基本培养基为改良 ＭＳ，ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ，ＩＢＡ
０．３ｍｇ／Ｌ，再生频率和再生芽数与其他相比有显著差异，以极差来看，其值越大，表示该因素越重要。因此，
从本试验可以预见，在此３种因素中，最重要的因素是基本培养基，其次为ＺＴ和ＩＢＡ。
４９２
　第４期 郑美香，等：长白山笃斯越桔离体器官再生不定芽的研究
表３　不同培养基和植物生长调节剂对叶片再生的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｌｅａｆ
因子水平
Ｆａｃｔｅｒ　ｌｅｖｅｌ
因子种类及其代号Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｃｏｄｅｓ
（Ａ）基本培养基 Ｍｅｄｉｕｍ （Ｂ）ＺＴ （Ｃ）ＩＢＡ
再生频率／％
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
平均再生芽数
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ
１ 改良 ＭＳ（１） １（１） ０．１（１） ５２　 ３
２ 改良 ＭＳ（１） ２（２） ０．３（２） ６８　 ４．２
３ 改良 ＭＳ（１） ３（３） ０．５（３） ３２　 ２．３
４ １／２改良 ＭＳ（２） １（１） ０．３（２） ３０　 ２．１
５ １／２改良 ＭＳ（２） ２（２） ０．１（３） ２８　 １．２
６ １／２改良 ＭＳ（１） ３（３） ０．５（１） １５　 ０．８
７ １／４改良 ＭＳ（３） １（１） ０．５（３） ８　 ０．６
８ １／４改良 ＭＳ（３） ２（２） ０．１（１） ４　 ０．２
９ １／４改良 ＭＳ（３） ３（３） ０．３（２） ０ ０
Ｉ １５２（９．５） ９０（５．７） ７１（４） — —
Ⅱ ７３（４．１） １００（５．６） ９８（６．３） — —
Ⅲ １２（０．８） ４７（３．１） ６８（４．１） — —
极差Ｒａｎｇｅ　 １４０（８．７） ５３（２．６） ３０（２．３）
　　注：１）表中再生频率和再生芽数的数据为平均值；２）Ｉ、Ⅱ、Ⅲ和极差括号中的数据为再生芽数的结果。
Ｎｏｔｅ：１）Ｄａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｂｌｅ　ａｒｅ　ａｖｅｒａｇｅｓ；２）Ｄａｔａ　ｉｎ　ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ　ａｒｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｔｏ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ．
２．３　不同细胞分裂素对不定芽形成的影响
细胞分裂素种类和浓度是培养基中提高植物离体再生效率的关键因子。本试验研究６－ＢＡ、ＴＤＺ和
ＺＴ　３种细胞分裂素对笃斯越桔不定芽形成的作用。结果表明，再生培养基中的细胞分裂素对笃斯越桔不定
芽形成中有重要影响，且ＴＤＺ、ＺＴ和６－ＢＡ　３种细胞分裂素在诱导笃斯越桔不定芽形成中有显著性差异，
由表４可知，ＺＴ的再生芽数为１２．６明显高于ＴＤＺ和６－ＢＡ，ＴＤＺ和６－ＢＡ和ＺＴ再生芽数的生长情况有
显著差异。
表４　细胞分裂素对笃斯越桔叶片再生的影响
Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ　ｏｎ　ｂｕｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅａｆ
细胞分裂素
Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ
浓度／（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
再生频率／％
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
再生芽数
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ
ＴＤＺ
ＺＴ
６－ＢＡ
２
２
５
６８ｂ
７８ａ
３２ｃ
２．９ｂ
１２．６ａ
０．８ｃ
　　注：改良 ＭＳ＋ＩＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ．
Ｎｏｔｅ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ＋ＩＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ
２．４　不同生长素对不定芽形成的影响
培养基中生长素种类对笃斯越桔不定芽再生有显著影响。由表５可知，对于笃斯越桔不定芽形成，ＩＢＡ
的效果最好，与其余的生长素再生频率和再生芽数差异显著，ＩＢＡ叶片再生频率达到７８％，平均再生芽数达
到１２．６，愈伤组织块数大，且浓绿色，显著好于ＮＡＡ。
５９２
延　边　大　学　农　学　学　报 第３５卷　
表５　生长素对笃斯越桔叶片再生的影响
Ｔａｂｌｅ　５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ　ｏｎ　ｂｕｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅａｆ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
浓度／（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
再生频率／％
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
再生芽数
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ
ＩＢＡ
ＩＡＡ
ＮＡＡ
０．３
０．３
０．３
７８ａ
２０ｃ
５２ｂ
１２．６ａ
１．４ｃ
２．５ｂ
　　注：改良 ＭＳ＋ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ
Ｎｏｔｅ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ＋ＺＴ２．０ｍｇ／Ｌ
２．５　暗培养时间对不定芽形成的影响
笃斯越桔叶片接种后进行不同时间暗培养然后转移到光照下培养。由表６可知，接种在再生培养基上
的叶片先进行一段时间暗培养，然后在光下培养，可以显著地提高笃斯越桔组培苗叶片形成不定芽的再生芽
数，在４个暗培养时间处理的笃斯越桔组培苗叶片形成不定芽的再生频率高于没有暗培养的，没经过暗培养
的笃斯越桔组培苗叶片也有一定再生能力，但叶片再生频率和再生芽数极低。采用笃斯越桔组培苗叶片形
成不定芽试验时，暗培养是建立高效率再生体系的重要因素，一般选用１４ｄ的暗培养处理，再生频率和再生
芽数分别为７８％和１２．６。
表６　暗培养时间对笃斯越桔叶片再生的影响
Ｔａｂｌｅ　６　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄａｒｋ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｎ　ｂｕｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅａｆ
暗培养时间／ｄ
Ｄａｒｋ　ｐｅｒｉｏｄ
再生频率／％
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
平均再生芽数
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ
０
７
１４
２１
６８ｃ
７０ｂ
７８ａ
６０ｄ
２．４ｄ
６．２ｂ
１２．６ａ
３．５ｃ
图１　笃斯越桔叶片再生芽的生长情况（改良 ＭＳ＋ＺＴ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．３　ｍｇ／Ｌ）
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｌｅａｖｅｓ　ｃａｌｕｓ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ＋ＺＴ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．３　ｍｇ／Ｌ）
Ａ：１４ｄ暗培养后转到光下培养情况；Ｂ：３０ｄ培养情况；Ｃ：３５ｄ培养情况；Ｄ：４０ｄ培养情况
Ａ：１４ｄｄａｒｋ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ；Ｂ：３０ｄｃｕｌｔｕｒｅ；Ｃ：３５ｄｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄ：４０ｄｃｕｌｔｕｒｅ
６９２
　第４期 郑美香，等：长白山笃斯越桔离体器官再生不定芽的研究
３　讨论与结论
外植体类型、植物生长调节剂种类及浓度、暗培养时间等对植株再生体系的成功建立尤为重要。以组培
苗叶片为外植体再生的丛生芽多（图１），这与一些学者［７－９］的报道相一致。采用正交试验设计研究表明，在
３种因素中，最重要的因素是基本培养基，且改良 ＭＳ对不定芽的诱导优于１／２改良 ＭＳ、１／４改良 ＭＳ，表明
笃斯越桔诱导愈伤组织需要较高的营养条件，筛选植物生长调节剂的种类及浓度是离体叶片再生不定芽所
必须的，本试验表明，培养基附加ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ时能诱导愈伤组织和再生出丛生芽，附加ＴＤＺ虽然能产生
块数较大的愈伤组织，但是愈伤组织是淡绿色，而且分化出丛生芽少，这与一些学者［１０－１１］的报道不一致，另
外，作者发现适合的植物生长调节剂浓度有利于愈伤组织的生成，植物生长调节剂浓度高使愈伤组织褐化，
再生率低。
参考文献：
［１］　杨桂霞．笃斯越桔花色素的分离鉴定及栽培种花色素的定量分析［Ｄ］．长春：吉林农业大学，２００４．
［２］　王二雷，林松毅，刘静波，等．笃斯越桔中花青素含量分析［Ｊ］．食品科学，２００７，２８（１０）：４６０－４６３．
［３］　张燕．笃斯越桔槲皮素的检测、制备及其功能特性研究［Ｄ］．长春：吉林大学，２００９．
［４］　宗长玲，邓萌，宗成文，等．笃斯越桔研究进展［Ｊ］．北方园艺，２０１１（１２）：１７３－１７６．
［５］　顾地周，高捍东，顾美影，等．笃斯越桔离体培养及植株再生体系的建立［Ｊ］．林业科学研究，２００９，２２（２）：２２６－２２９．
［６］　刘永富，陈建军，吴俊遥，等．笃斯越桔组培繁殖育苗技术研究初报［Ｊ］．吉林林业科技，２００８，３７（４）：４０－４３．
［７］　黄翠，景丹龙，王玉兵，等．水杉愈伤组织诱导及植株再生［Ｊ］．植物学报，２０１０，４５（５）：６０４－６０８．
［８］　张杨军，涂艺声，彭先全，等．云锦杜鹃离体再生培养基的条件优化［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０，３８（１１）：６００８－６０１０．
［９］　尚霄丽，马春华，冯建灿，等．中华猕猴桃叶片再生体系的建立［Ｊ］．江西农业学报，２０１０，２２（４）：５０－５２．
［１０］　徐凌飞．梨离体再生和遗传转化的研究［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２００５．
［１１］　徐凌飞．梨（Ｐｙｒｕｓ）叶片和叶柄再生体系建立的研究［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２００１．
Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｓｈｏｏｔｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ
Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ　ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍｏｆ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ
ＺＨＥＮＧ　Ｍｅｉ－ｘｉａｎｇ，　ＺＯＮＧ　Ｃｈａｎｇ－ｌｉｎｇ，　ＳＯＮＧ　Ｃｈｕｎ－ｙａｎ，　ＣＡＯ　Ｈｏｕ－ｎａｎ，　ＺＯＮＧ　Ｃｈｅｎｇ－ｗｅｎ＊
（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ　Ｊｉｌｉｎ　１３３００２，Ｃｈｉｎａ）
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ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｓｏｕｒｃｅ，ｍｅｄｉｕｍ　ｔｙｐｅｓ，ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｄａｒｋ
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ＭＳ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ，１／２ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ，１／４ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｒｅ　ｎｏｔ　ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
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ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＳ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２．０ｍｇ／Ｌ　ＺＴ　ａｎｄ　０．
３ｍｇ／Ｌ　ＩＢＡ，１４ｄｄａｒｋ　ｐｅｒｉｏｄ　ｔｏ　３０ｄｌｉｇｈｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ｈｉｇｈｅｓｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　７８％，ｗｉｔｈ　１２．６ｓｈｏｏｔｓ　ｐｅｒ
ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ　ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｓｈｏｏｔｓ
７９２