全 文 ：文章编号:1001-4829(2011)01-0248-05
　　收稿日期:2010-07-14
　　基金项目:云南省星火产业带项目(2006NG37)
作者简介:周旭红(1978-),女 ,助理研究员 , 硕士 ,研究方向花
卉遗传育种 , E-mail:zhouxuhong7801@126.com, ＊为通讯作者。
玻璃化法超低温保存香石竹种质资源的研究
周旭红 1 , 何　艳1 ,欧阳德爱2 ,桂　敏 1 ,
李绅崇 1 , 曹 　桦 1 ,杨春梅 1 , 卢珍红 1 , 莫锡君 1＊
(1.云南省农业科学院花卉研究所 ,云南省花卉育种重点实验室 ,云南省花卉工程中心 , 云南昆明　650205;2.大理学院生命科学
与化学学院 ,云南 大理　 671000)
摘　要:以香石竹 “云恋蝶 ”离体茎尖为试材 ,研究玻璃化法对香石竹茎尖的离体超低温保存。通过正交设计试验对影响存活率的
主要因素(预培养培养基中蔗糖浓度 、预培养时间 、装载时间和 PVS2 处理时间)进行分析, 结果表明 ,预培养 1d, 预培养基中蔗糖
浓度为 0.5mol/L,装载 40min, PVS2液处理 40min,液氮处理 1d,在 40℃水浴化冻后的香石竹茎尖 ,成活率达 44.13%,且超低温
再生苗与其常温苗的生理生化指标无显著差异。本试验成功地建立了香石竹种质资源玻璃化法超低温保存的技术 ,为香石竹种
质资源的长期保存提供了一条有效途径。
关键词:香石竹;茎尖;玻璃化法;超低温保存
中图分类号:S681.5　　　文献标识码:A
CryopreservationofDianthuscaryophylusLinnGermplasmbyVitrification
ZHOUXu-hong1 , HEYan1 , OUYANGDe-ai2 , GUIMing1 , LIShen-chong1 , CAOHua1 , YANGChun-mei1 , LUZhen-hong1 , MOXi-jun1＊
(1.FlowerResearchInstituteofYunnanAcademyofAgriculturalSciences, KeyLaboratoryofFlowerBreedingofYunnanProvince, Flower
EngineeringCenterofYunnanProvince, YunnanKunming650205, China;2.ColegeofLifeScienceandChemistry, DaliUniversity, Yun-
nanDali671000, China)
Abstract:ShoottipsfromDianthuscaryophylusLinncultivars` YunLianDie , weresuccessfulycryopreservedbyvitrificationmethod.Or-
thogonaldesignwasusedtoanalyzetheefectsofdominantparametersonsurvivalratesofshoottips, includingsucroseconcentrationofpre-
culturemedium, durationofpreculture, durationofloadinganddurationofexposuretoPVS
2
.Theresultshowedthatthehighestshoottip
survivalratewas:preculture1 days, 0.5mol/Lsucrose, loadingtime40minutes, PVS2 treatmentin40minutes, liquidnitrogentreated1d
andthrowingin40℃water, thesurvivalratewasupto44.13%.Theregeneratedplantletsshowednomorediferencethanthenormalpla-
ntletsinphysiologicalandbiochemicalcharacters.ThistestsetupsuccessfulyacryopresevationbyvitrificationsystemtechniqueforDian-
thuscaryophyllusLinngermplasm, whichprovidedaneffectivewayforlong-lastingconservationinvitroofDianthuscaryophylusLinngerm-
plasmresources.
Keywords:DianthuscaryophylusLinn;Shoot-tips;Cryopreservation;Vitrification
　　香石竹(Dianthuscaryophylus)又名康乃馨 、麝
香石竹 ,为石竹科石竹属多年生宿根草本植物 ,原产
地中海地区 、南欧及西亚 ,花瓣具香郁气味 ,在世界
各地广为种植。目前对香石竹种质资源的保存主要
采用田间保存法和组织培养保存法。田间保存法不
仅需要大量的人力 、物力和财力 ,而且不可避免地受
到各种自然灾害和人为的影响 ,最终可能造成珍贵
品种资源的遗失或混杂;组织培养保存工作量大 、费
用高 ,继代培养易出现体细胞变异 ,不利于种质资源
的遗传稳定性 ,因此有必要探讨新的种质资源保存
方法 。
超低温保存是植物种质保存的理想途径 ,自从
1973年 Nag和 Street首次成功地用液氮超低温保存
了胡萝卜悬浮细胞后 ,迄今进行超低温保存的植物
材料已达 200余种 [ 1] 。随着种质离体保存技术的发
展 ,与传统的超低温保存方法相比 ,近年来发展较快
的玻璃化法超低温保存具有设备要求简单 、材料处
理步骤简便 、效果和重演性好等优点[ 2] ,是目前较
为理想的植物种质资源长期稳定的保存方法 ,尤其
适合组培物和茎尖培养物的保存 ,已经成功应用于
几十种植物的茎尖保存 [ 3] 。本试验用玻璃化法进
248
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2011年 24卷 1期
Vol.24　　No.1
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2011.01.068
表 1　香石竹 “云恋蝶”茎尖超低温处理正交设计方案
Table1　TheorthogonaltestaftercryopreservationofDianthuscaryophylusLinnshoottips
因素 Factors 代号 Code 水平 Levels
1 2 3
预培养基蔗糖浓度 (mol/L) A 0.3 0.5 0.7
预培养时间 (d) B 1 3 5
装载时间 (min) C 20 30 40
PVS2 处理时间 (min) D 20 40 60
行香石竹茎尖的超低温保存 ,以期建立起香石竹茎
尖的超低温保存体系 ,为长期稳定保存香石竹种质
资源提供技术支持。
1　材料与方法
1.1　材料
香石竹自育品种 “云恋蝶”的组织培养苗。
1.2　方法
茎尖玻璃化超低温处理的步骤为:无菌茎尖培
养※预培养※装载※脱水※液氮处理※化冻※去装
载※恢复培养。
茎尖超低温保存受多种因素的影响 ,本实验利
用正交设计方法对其中一些重要的影响因子进行优
化 ,实验结果数据采用 F测验及 Tukey分析方法 。
其中包括预培养基中蔗糖浓度 (A)、预培养时间
(B)、装载液处理时间(C)、玻璃化液(PVS2)处理时
间(D)等 4个因素 ,上速因素按照 L9(34)进行正交
设计(如表 1),共 9种处理 ,每个处理 20个茎尖 , 3
次重复 。
1.2.1　预培养　试验取继代 30 d后的香石竹 “云
恋蝶”无菌组培苗 ,切取 1cm的茎段放入 MS+(0.
3, 0.5, 0.7mol/L)蔗糖 +5%二甲基亚砜(DMSO)
+7g/L琼脂培养基中 ,在培养温度为 25±2 ℃,每
天光照 10h,光照强度为 2000 lx,预培养 1, 3, 5d。
1.2.2　装载　取出预培养的茎段 ,在无菌条件下切
取 2 ～ 3 mm大小的茎尖在室温下装载。装载液为
MS+2 mol/L甘油 +0.4 mol/L蔗糖 ,装载时间设定
为 20、30、40min3个级别 。
1.2.3　脱水　将茎尖从装载液中转移到玻璃化液
(PVS2:MS+30%甘油 +15%乙二醇 +15% DMSO
+0.4 mol/L蔗糖)中进行脱水处理 ,此过程需在 0
℃下进行 ,处理时间设定为 20、40、60 min3个级别 。
1.2.4　液氮处理　脱水过后 ,换新鲜的 PVS2液 ,将
茎尖投入新的装有 PVS2 液的冻存管(10个茎尖 /
管)中 ,然后将冻存管迅速投入液氮(-196 ℃)中 ,
保存 24 h。
1.2.5　化冻　材料在液氮贮藏 1 d后 ,进行化冻 。
化冻方式为 40 ℃水浴迅速解冻 。
1.2.6　去装载　经过化冻后 ,当冻存管中的冰刚刚
化时 ,弃去 PVS2液 ,先用去装载溶液 MS+1.2 mol/
L蔗糖的洗涤液洗涤 ,期间轻轻摇动 ,弃培养液 ,再
用同样的培养液洗涤 2次 ,每次 10 min。
1.2.7　恢复培养　经化冻和洗涤后的香石竹 “云
恋蝶 ”茎尖接在 MS+BA0.2 mg/L+NAA0.1 mg/
L, pH值为 6.0的培养基上 ,在培养温度为 25±2
℃,每天光照 10 h,光照强度为 2000 lx,进行恢复培
养。
1.2.8　成活率检测　记录香石竹茎尖的成活率及
恢复生长的时间 ,并在继代 2次后测定超低温保存
后的再生苗与常温保存试管苗的叶绿素含量 、可溶
性蛋白含量 、POD值的差异。试验结果用 SPSS13.
0统计软件进行数据分析。成活率(%)=玻璃化
超低温保存后成活的茎尖数 /保存的总茎尖数 ×
100。
2　结果与分析
2.1　各因素对香石竹茎尖玻璃化超低温保存的影
响
对预培养基中蔗糖浓度 、预培养时间 、装载液处
理时间 、PVS2溶液处理时间等 4个因素按照 L9(34)
进行正交处理 [ 4] ,结果如表 2所示。从表 2可见 ,处
理 1、处理 3与其他处理均达到显著差异水平 ,处理
1成活率最高 , 44.13 %;处理 3成活率次之;成活率
最低的为处理 7。因此 ,预培养基中蔗糖浓度为 0.5
mol/L,预培养时间为 1d,装载时间为 40 min, PVS2
液处理时间为 40 min,茎尖的成活率最高 。
分析各个因素对处理后成活率的影响(表 3)可
知 ,对于超低温处理后的茎尖成活率 ,各个因素水平
之间均达到了极显著差异 。从极差分析中可以看
出 , 4个因素对茎尖成活率的影响程度为:预培养时
间 >装载时间 >PVS2处理时间 >预培养基蔗糖浓
度。比较极差分析结果发现 ,预培养时间是影响超
低温处理后茎尖成活率的主要因素 ,而预培养基蔗
2491期 　　　　　　周旭红等:玻璃化法超低温保存香石竹种质资源的研究
表 2　正交实验结果
Table2　Resultsfromorthogonalexperiment
处理号
No.
因素及其代号
Factorsandcodes
超低温处理后的成活率(%)
Survivalrate
蔗糖浓度
A(mol/L)
预培养时
间 B(d)
装载时间
C(min)
PVS2 处理
时间 D(min) Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
5%显
著水平
1%极显
著水平
1 0.5 1 40 40 30.00 52.38 50.00 44.13 a A
2 0.3 1 20 20 22.22 13.64 13.04 16.23 b B
3 0.7 1 30 60 20.00 30.43 27.27 24.41 ab AB
4 0.7 3 40 20 4.35 4.76 10.00 6.67 b B
5 0.5 3 20 60 8.33 12.00 13.79 11.38 b B
6 0.3 3 30 40 15.15 20.00 13.04 16.07 b B
7 0.7 5 20 40 0.00 6.90 0.00 2.30 b B
8 0.5 5 30 20 6.45 5.00 11.11 7.30 b B
9 0.3 5 40 60 11.11 18.18 22.58 17.29 b AB
表 3实验结果数据的方差分析
Table3　AOVforthedateoftheexperimentresult
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P-值 极差 R
预培养基蔗糖浓度 0.0405 2 0.0203 6.1602 0.0092 0.0948
预培养时间 0.2103 2 0.1052 31.973 0.0001 0.1974
装载时间 0.0715 2 0.0358 10.871 0.0008 0.126
PVS2 0.0567 2 0.0283 8.6152 0.0024 0.1077
误差 0.0592 18 0.0033
A:转绿的茎尖;B:未成活的茎尖;C:茎尖分化的不定芽;D:成活的香石竹苗
A:Shoot-tipofturninggreen;B:Shoottipsofnotsurviving;C:Budsregeneratedfromshoot-tip;D:Regeneratedplantletsfromshoot-tips
图 1　香石竹茎尖的恢复培养与植株再生 (Bar=1cm)
Fig.1　RecoverycultureandplantregenerationfromshoottipofDianthuscaryophyllusLinn(Bar=1cm)
糖浓度对茎尖成活率影响较小 。
2.2　茎尖的恢复培养与植株再生
香石竹茎尖经液氮保存后接种在培养基上约 7
～ 14 d,成活的茎尖会逐渐转成淡黄色(图 1-A),未
成活的茎尖则发生漂白或褐变(图 1-B),继续培养
20 ～ 30d后茎尖成活 ,慢慢分化不定芽(图 1-C),继
250 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
表 4　玻璃化法超低温保存后再生苗与常温苗生理生化指标的比较
Table4　Comparisonofphysiologicalandbiochemicalcharactersoftheregeneratedplantletsaftercryopreservationbyvitrificationwithnormalplant-
lets
处理
Treatment
叶绿素 a
Chlorophyla
(μg/g)
叶绿素 b
Chlorophylb
(μg/g)
总叶绿素
Totalchlorophyl
(μg/g)
可溶性蛋白
Solubleprotein
(mg/g)
POD活力
PODactivity
(U/g/min)
常温保存苗 1417.68±113.21 467.07±35.08 1884.75±148.3 8.9±0.56 708.68±844.69
冻后再生苗 1170.74±322.16 364.08±76.3 1534.82±398.46 8.83±0.43 1164.28±138.73
代 1 ～ 2次后长成比较健壮的再生植株(图 1-D),与
超低温处理前后的香石竹苗从外观和形态上并无明
显区别 。
2.3　玻璃化超低温保存后香石竹再生苗与常温苗
生理生化指标的比较
通过对玻璃化超低温保存后香石竹再生苗与常
温苗植株叶片中叶绿素 a、叶绿素 b、总叶绿素含量 、
可溶性蛋白含量 、POD活力等 5个值的测定 ,结果
如表 4所示 。从表 4可见 ,超低温再生苗与其常温
苗的生理生化指标基本一样 ,其叶绿素和可溶性蛋
白含量以及 POD活力虽有差异 ,但未达到显著性水
平 ,这在一定程度上保证了遗传的稳定性 。
3　讨　论
3.1　香石竹茎尖玻璃化法超低温保存过程中的影
响因素
蔗糖对于提高植物组织的抗寒性有着重要的作
用 [ 5] ,而且预培养对提高超低温保存后的成活率有
很大的影响 [ 6] ,它使保存的材料达到最适合于超低
温保存的生理状态 ,主要是提高分裂细胞的比例和
减少细胞内自由水含量 ,增强细胞的抗寒力 [ 7] 。脱
水时间取决于材料的特性 ,包括植物的基因型 、抗冻
性及细胞的年龄 、生理状态等[ 8] 。装载液预处理则
是 PVS2溶液快速脱水前必不可少的一步 ,它起到
必要的渗透保护作用;PVS2溶液是玻璃化冰冻保护
剂 ,同时其毒性成分(DMSO)又可能会对材料造成
毒害 ,而且 PVS2溶液处理时间过长也可能会导致
材料的过度脱水而使细胞受损 。为优化玻璃化超低
温保存体系 ,本试验采用了正交设计方法 ,对几个主
要的因素进行了优化 , 结果显示:采用高糖 (0.5
mol/L)预培养 1 d,室温下用装载液装载 40 min, 0
℃下用冰冻保护剂 PVS2处理 40 min可以避免超低
温保存对香石竹造成的冷害 ,同时可以对香石竹茎
尖进行诱导脱水 ,大大提高了超低温保存的成活率 。
其中 ,预培养时间对超低温处理后茎尖的存活率影
响最为明显 。这在 Halmagyi[ 9]研究发现将香石竹品
种 “Palas”茎尖接种在 MS+0.5 mol/L的蔗糖培养
基上 , 24℃预培养 1d,冻存率较高试验中也得到了
证明。
3.2　茎尖的恢复培养与植株再生
解冻后茎尖的恢复培养一般是在弱光或黑暗条
件下进行培养 ,再转入新鲜培养基上正常光照下培
养[ 10] ,以减少茎尖褐变及褐变对生长分化的阻碍 ,
提高茎尖的成活率。但香石竹组培苗易玻璃化 ,且
玻璃苗绝大多数来自茎尖或茎切段培养物的不定
芽 ,而光照则可以显著降低玻璃苗百分率 [ 11] 。本实
验将经化冻和洗涤后的香石竹 “云恋蝶 ”茎尖在培
养温度为 25 ±2 ℃,每天光照 10 h, 光照强度为
2000 lx,进行恢复培养 ,其对茎尖成活率的影响需要
进一步实验证实。
3.3　茎尖超低温保存后再生植株的遗传稳定性
植物种质资源保存时特别要注意保存材料的遗
传稳定性 ,否则保存就失去了意义 。而保存材料的
选择至关重要 ,因为不同的材料遗传组成并不一定
完全相同 [ 12 ～ 15] 。茎尖分生组织由于细胞分化程度
小 ,在植物保存后的再生过程中 ,比其它细胞培养物
的遗传性稳定 [ 16 ～ 17] ,所以成为超低温保存的一种理
想材料 ,而且具有其独特的优越性 ,冻存的茎尖分生
组织可以直接形成小植株 ,既可快速地进行无性繁
殖 ,又减少了材料的遗传变异 ,尤其对那些易产生体
细胞无性系变异或营养繁殖的作物来说 ,茎尖分生
组织超低温保存更是较理想的保存方法 [ 3] 。本研
究对香石竹种质超低温保存后的生理指标进行了检
验 ,其与未冻存的植株比较各项指标都无显著差异 ,
证明了茎尖分生组织是种质超低温保存的理想材
料。
此外 ,超低温保存过程中 ,材料在液氮中保存的
时间长短可能不是影响保存效果的因素 。生物材料
在液氮条件下 ,其生理代谢基本停止 ,所以保存时间
长短不会影响保存结果。保存 1 d和保存 10个月
的[ 18]樱桃在保存效果上没有明显区别 ,香蕉在液氮
中保存时间的长短不影响保存效果 [ 19] 。至于超低
温保存过程给材料造成的损伤及其对保存效果的影
响 ,有必要从细胞的超微结构上对其进行探讨。
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(责任编辑　王家银)
252 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷