全 文 ：第 16 卷　第 4 期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vol.16　No.4
2001 年　12 月 　　　　　　　　　　Journal of Yunnan Agricultural Universi ty　　　　　 Dec.2001
昆明香石竹斑驳病毒鉴定
蔡　红 ,孔宝华 ,吴建宇 ,陈海如＊＊ ,段永嘉
(云南农业大学 ,云南省植物病理重点实验室 , 云南 昆明 650201 )
摘要:从表现为叶斑驳 、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,经电镜负染观察 ,该病毒为直径是 28～ 33
nm 的球状粒子 ,病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 , OD260/OD280=1.70;血清学反应与 CarMV 抗血
清出现明显的沉淀线。由此 ,可基本认为该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(Carnation mo ttle virus , CarMV)。
关键词:香石竹;香石竹斑驳病毒;鉴定
中图分类号:S 436.8　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2001)04-0263-04
　　香石竹(Dianthus caryophy llus L.),又称康乃
馨(carnation),是世界主要切花品种之一 。近年
来 ,由于昆明花卉产业的发展 ,各大花卉公司及花
农都在大面积地种植香石竹 ,但由于病毒的侵染 ,
使其不同程度的出现植株矮化 、畸形 、花叶 、花苞开
裂 、花碎色等症状 ,大大降低了其观赏价值和经济
价值 。本实验对症状表现为叶斑驳 、花杂色的香石
竹病株上所获得的一病毒分离物进行鉴定 ,现将鉴
定结果报道如下 。
1 　材料与方法
1.1 　毒源的分离纯化
从云南省呈贡县斗南村花卉苗圃采集到呈典
型斑驳症状的香石竹叶片 ,经苋色藜两次单斑分离
后 ,获得纯毒株 ,保存于中国石竹上 。
1.2 　病毒粗提纯
将感病组织称重 ,按 1∶2(W/V)比例加入 0.1
mol/L , pH 7.2 的磷酸缓冲液(PBS), 并加入
0.1%的巯基乙醇 ,研磨匀浆后 ,双层纱布过滤 ,滤
液以 1∶1体积加入CHCl3 乳化 ,4 ℃搅拌 2 h , 6 000
r/min离心 15 min ,上清液加入 10% PEG(M/W
6000)及 1%NaCl ,4 ℃搅拌 2 h , 30 000 r/min离心
2 h ,沉淀悬浮于 0.1倍体积 0.01mol/L ,pH 7.2的
PBS缓冲液中(内含 1% Triton X -100), 再经
6 000 r/min离心 15min ,上清液重复PEG沉淀 ,最
后 6 000 r/min离心去杂质后 ,所得上清液即为粗
提液 。
1.3 　电镜观察
1.3.1 　电镜负染观察
病毒提纯液经 2%磷钨酸(PTA)染色后置于
JEM-1200EXⅡ型透射电镜下观察并同步随机测
量 100个病毒粒子大小 。
1.3.2 　超薄切片观察
取感病植株叶片 ,切成 10mm ×1 mm 的长条 ,
经 2.5%戊二醛及 1%　酸双重固定 ,乙醇逐级脱
水 ,环氧丙烷置换 , Epon 812 渗透包埋 , LKB -
2188型切片机切片 ,经饱和醋酸双氧铀和柠檬酸
铅双重染色后 ,置 JEM-1200EX Ⅱ型电镜下观察。
1.4 　提纯病毒紫外光吸收测定
病毒提纯液经 608 倍稀释 ,在 HITACHI U -
3000型紫外可见分光光度仪下扫描 ,测定 OD260及
OD280值 ,计算提纯病毒浓度 。
1.5 　血清学反应
采用琼脂糖免疫双扩散实验:配制 1%的琼脂
糖溶液倒入培养皿中 ,在胶板上打梅花型孔穴。在
中央孔穴中注入 CarMV 抗血清(由美国 Agdia 公
司提供),周围 1孔为健株汁液 ,2 ,4 ,6孔为 CarMV
阳性对照 , 3 , 5孔为待测抗原 ,置室温下培育 24 h
后观察结果。
1.6 　寄主范围测定
收稿日期:2000-03-06　　　　＊＊通讯作者
　基金项目:云南省省院省校合作课题(98Y9009)
　作者简介:蔡红(1972-), 女 ,讲师 , 云南昆明人 ,主要从事植物病理学研究。
DOI :10.16211/j.issn.1004-390x(n).2001.04.005
采用汁液摩擦接种法 ,在 6科 11种植物上测
定其寄主范围。
2 　结果
2.1 　症状表现与特点
感病叶片褪色 ,形成黄色斑驳 ,老叶卷曲 ,花呈
碎色(见图 1)。
2.2 　电镜观察
提纯病毒经负染置透射电镜下观察 ,可见到大
量球状病毒粒子 ,直径约 28 nm(见图 2)。感病叶
片经超薄切片电镜观察 ,在木质部导管中可看到散
生的大量球状病毒粒子(见图 3)。
2.3 　病毒紫外吸收测定
病毒提纯液经稀释后 , 置于 HITACHI U -
3000 紫外可见分光光度仪下扫描呈典型核蛋白吸
收曲线 , 紫外吸收最高峰为 260 nm , OD260 =
0.628 0 ,OD280 =0.368 9 , OD260/OD280 =1.70 ,说
明提纯制剂较纯(见图 4)。病毒浓度=稀释倍数
×OD260/OD0.1260 =608 ×0.628 0/5.0 =76.36 mg/
mL ,即:所得提纯病毒粒子浓度为 76.36 mg/mL。
2.4 　血清学反应
病毒分离物与 CarMV 抗血清呈阳性反应 ,形
成一条明显的沉淀线 ,对照无反应 ,说明该病毒分
离物为 CarMV(见图 5)。图 5 中 ,中间孔为 Car-
MV抗血清;1为健株汁液;2 ,4 ,6为阳性对照;3 , 5
为待测病毒分离物。
2.5 　寄主范围测定
经汁液摩擦接种后 ,在供试的 6 科 11 种鉴别
寄主上仅侵染 4科 5种植物(见表 1)。
表 1 　病毒分离物在寄主植物上的反应及症状
Tab.1　Symptoms in different plant species by isolated virus
寄　　主 症状
苋色藜(Chenopidium amaranticolor) L
菠菜(Spinacia oleracea) L
千日红(Gompherena globosa) L
中国石竹(D .Chinensis) S
菜豆(Phaseolus vulgaris) N
蚕豆(Vicin f aba) N
豇豆(Vigna unguiculata) N
番杏(Tetragonia epansa) L
普通烟(N.tabacum) N
黄花烟(Tetragonia expansa) N
假酸浆(Physalis alkekengi) N
　　注:N 为不侵染;L 为局部侵染;S 为系统性侵染。
3 　讨论
从云南省呈贡县斗南村花卉苗圃采集到的呈
斑驳症状的香石竹病株上分离得到的球状病毒回
接香石竹后 ,产生与原来相同症状的香石竹植株 。
此病毒还能感染藜科 、苋科 、石竹科的部分植物 ,导
致这些植物产生局部或系统症状 。经电镜观察统
计 ,该病毒直径约为 26 ～ 33 nm ,并以 28 nm 的粒
子居多。血清学反应显示病毒分离物与 CarMV
抗血清呈阳性反应 。参考有关文献资料[ 1 , 3 , 4 ,
5] ,可认为该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(Car-
nation mo tt le virus , CarMV)。
参　考　文　献
[ 1] 　张健如.香石竹病毒病研究[ J] .植物检疫 , 1984 ,(1):
2-8.
[ 2] 　刘伟 ,张成良.香石竹斑驳病毒检疫技术进展[ J] .植
物检疫 , 1991 , 5(1):64-65.
[ 3] 　张健如.花卉植物病毒及病毒病[ M] .上海:上海科
学技术出版社 , 1990.
[ 4] 　季良编.中国植物病毒志[ M] .北京:农业部植物检疫
实验所 , 北京枫叶印刷厂印刷 , 1991.
[ 5] 　保阪康弘 , 松井千秋.植物病毒图鉴[ M] .梁训生 , 张
成良译.北京:农业出版社 , 1983.
264 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 16卷
Identification of Carnation Mottle Virus
on Carnation in Kunming
CAI Hong ,KONG Bao-hua ,WU Jian-yu ,CHEN Hai-ru,DUAN Yong-jia
(Phy topatho logy Laboratory of Yunnan Province , Y A U , Kunming 650201 , China)
Abstract:A isolated virus from carnation w ith mosaic on leaves and breaking on flow ers.Through TEM , the
vi rus particle w as spherical about 28-33 nm in diameter.The purified virus from infected t issue showed typi-
cal ult raviolet absorption of nucleopro tein , OD260/OD280=1.70.Virus part icles w ere in bar shape with anti-
serum of CarMV by immunodiff sion tests.On the basis of these characteristics , the vi rus isolate w as consid-
ered to be identical to carnation mot tle vi rus(CarMV).
Key words:carnation;carnation mot tle virus;identif ication
图 1 　感染 CarMV 病毒的香石竹植株(左:叶斑驳;右:花碎色)
F ig.1　The symptom of carnation infected by CarMV(Left:mo ttle leaves;Right:breaking flowers)
图 2 　香石竹斑驳病毒粒子 , (×120 000)
Fig.2　Electron micrograph of carnation mo ttle virus
图 3 　CarMV 散生于导管内 , (×37 500)
Fig.3　Disperse CarMV particles in the vessel of the xylem
265第 4期　　　　　　　　　　　蔡红 ,等:昆明香石竹斑驳病毒鉴定
图 4 　提纯病毒液紫外吸收曲线
Fig.4　The ultraviole t absorption curve of purified CarMV
图 5 　琼脂双扩散试验结果
F ig.5　Results of immunodiffusion tests
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266 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 16卷