全 文 ：DOI:10.3971/ j.issn.1000-8578.2011.06.005
收稿日期:2010-08-19;修回日期:2011-03-18
作者单位:1.541004 广西桂林 , 桂林医学院基础医学
院 , 2.药学院
作者简介:陈建荣(1981 -), 女 , 硕士在读 , 主要从事肿
瘤病理和天然药物抗肿瘤方面的研究
文殊兰叶氯仿提取物诱导 NCI-H460细胞凋
亡的研究
陈建荣 ,杨　扬 ,杨　月
Study on Apoptosis of NCI-H460 Cells Induced by Chloroform Extract of Leaves from Cri-
num Asiaticum
CHEN Jian-rong , YANG Yang , YANG Yue
1.Department of Basic Med ical S ciences , Guilin Medical College , Guilin 541004 , China , 2.Depart-
ment o f Pharmacy
Abstract:Objective　To investiga te the effect of chlo rofo rm ex tracts(CE)of leave s from Crinum asiatic-
um on pro life ration and apopto sis of non-small cell lung cancer(NSC LC)NCI-H460 cells .Methods　The
activity o f cell g row th inhibition of NCI-H 460 ce lls w as measur ed by M TT assay.Morpho lo gical changes
of cell nuclei were obser ved by Hoechst 33258 staining.The expression levels of Bcl-2 and Bax proteins
were examined by immunocy tochemistry staining.F low cy tometry w as per formed to measure the cell cy-
cle.Results　CE display ed g row th inhibito ry activity ag ainst NCI-H460 cells with IC50 value s of 36.22
±3.04 , 41.21±2.50 and 62.55±3.47 mg/ L for 24 , 48 and 72 h , respectively.The effect enhanced
with an increase in the concentration o f CE.The condensed chromatin , nuclear fragmentation and a larg e
numbe r of apopto tic bodie s w as obse rved by H oechst 33258 staining.The percentag e of apopto sis in
NCI-H460 cells increased after trea ted w ith CE , compared w ith contro l.The expression level o f Bax pro-
tein in NCI-H460 cells cultured w ith CE w ere higher than that of control , and the expression level of Bcl-
2 pro tein in NCI-H460 cells dealt w ith CE w ere lower than tha t o f contr ol.The a rrest of NCI-H460 cells
in G 1/S phases w as induced by CE.Conclusion　I n vitro CE significantly inhibited the g rowth o f NCI-
H460 cells.Antitumor mechanism of NCI-H460 cells may be associated with the changes of cell cy cle and
cell apopto sis.
Key words:NSCLC;NCI-H460;Leaves from Crinum asia ticum ;Cell apopto sis
摘　要:目的　研究文殊兰叶氯仿提取物(CE)对非小细胞肺癌 NCI-H460 细胞增殖和凋亡的影响。方
法　通过 MT T 法检测 CE 对 NCI-H460 细胞的生长抑制作用;采用 Hoechst 33258 荧光染色法检测 CE
作用后凋亡细胞形态的变化;通过免疫细胞化学检测细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的表达;采用流式
细胞术(FCM)检测 CE 作用后对细胞周期的影响。结果　CE 抑制 NCI-H460 细胞增殖 ,其 24 、48、72 h
的 IC50分别为:(36.22 ±3.04)、(41.21±2.50)、(62.55±3.47)mg/ L;荧光染色显示 , 经 CE 作用后的
细胞出现细胞核裂解 ,染色质浓缩 , 产生凋亡小体;免疫细胞化学法显示 CE 能增强促进凋亡蛋白 Bax
和降低抑制凋亡蛋白 Bcl-2的表达;FCM 检测表明 CE 作用后的细胞被阻滞在 G 1/ S 期。结论　CE 在
体外能有效地抑制 NCI-H460 细胞生长 ,其机制可能与改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关。
关键词:非小细胞肺癌;NCI-H460;文殊兰叶;细胞凋亡
中图分类号:R734.2;R73-36　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8578(2011)06-0628-04
0　引言
肺癌是严重危害人类健康和生存质量的疾病 。
在肺癌的组织病理学分类中 , 75%～ 80%为非小细
胞肺癌(non-small cell lung cancer ,NSCLC)[ 1] 。许
多抗肿瘤药物对正常细胞的不良反应给患者带来极
大的痛苦 ,且肿瘤细胞易产生耐药性 。因此 ,从天然
植物中提取具有抑制肿瘤细胞生长的高效 、低毒的
化合物已经成为抗肿瘤研究的热点。
文殊兰(Crinum asiat icum L .var.sincum.
Bak)为石蒜科 ,属(Crinum)白花文殊兰 ,始载于《本
草纲目拾遗》 。有报道称文殊兰有抗癌 、镇痛 、抗炎 、
抗拟胆碱样 、保护心血管[ 2-3]以及诱导肿瘤细胞凋亡
等多种作用[ 4-5] 。此外 ,文殊兰全草含生物碱(主要
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是石蒜碱[ 6]),并以鳞茎中含量较高 ,其石蒜碱对人
肺癌细胞(A549)、人肠癌细胞(LOVO)人 T 细胞白
血病细胞(6T-CEM [ 7] 和人原髓细胞白血病细胞
(HL-60)[ 8] 均有较好的生长抑制活性 ,但在抑制人
非小细胞肺癌(NCI-H460)的研究则较少见 。本文
旨在观察文殊兰叶氯仿提取物(CE)对 NCI-H460
细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响 ,并初步探讨其抗
肿瘤作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料
细胞培养液 RPM I1640(Gibco 公司);优级胎
牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋
白酶 、MT T(Sigma 公司);Hoechst 33258 染色液
(北京原平皓生物技术有限公司);即用型Bcl-2 、Bax
单克隆抗体及 SP 试剂盒(福州迈新);其他试剂均
为分析纯 。
1.2　方法
1.2.1　药物提取　文殊兰叶切碎 ,晾干 ,打成粗粉 ,
以 6倍量的 95%乙醇加热回流提取三次 ,每次 1 h ,
合并提取液 ,旋转蒸发仪回收溶剂 ,浓缩干燥得总提
取物 。将总提取物以 2%HCl 溶解 、过滤 。滤液用
Na2CO 3 调 pH =9后用氯仿提取 ,氯仿层回收氯仿 ,
浓缩干燥得文殊兰叶氯仿提取物。
1.2.2　细胞株的培养　NCI-H460细胞株由本院
药理学教研室馈赠 ,在 RPMI1640中加入 10 %胎
牛血清 , 100 u/ml青霉素及 100 mg/ L 链霉素 , 置
37℃,5%CO2 的培养箱中常规培养 。
1.2.3　MTT 法测定 NCI-H460细胞的增殖　取
对数生长期的细胞按(3.0 ～ 5.0)×104/ml接种于
96孔细胞培养板中 ,每孔 180 μl;待细胞贴壁后按
每孔 20μl加药 ,并分以下几组(以下实验都是按此
分组):空白对照组 ,加入 RPM I 1640 培养液;CE
组 ,加入 12.5 、25 、50 、100 mg/ L CE(终浓度);阳性
对照组 ,加入 5-Fu (10 mg/ L);溶媒对照组 ,加入
10%DMSO;阴性对照组 ,加 PBS 。每个浓度均设 5
个复孔 ,37℃,5%CO 2 分别培养 20 、44 、68 h 后 ,每
孔加入 MTT(5 g/ L)20 μl ,继续培养 4 h后每孔加
入 DMSO 150 μl。在微型振荡器上摇匀 ,用酶标仪
在主波长为 490 nm 处测 OD 值 ,实验重复 3 次 ,取
3次平均值。细胞生长抑制率(%)=(对照组 A 值
-加药组 A值)/对照组 A 值×100%[ 9] 。采用 Or-
igin 7.5软件计算半数抑制浓度 IC50 。
1.2.4　Hoechst 33258 染色观察凋亡细胞形态 　
取对数生长期细胞 ,调整细胞浓度为2.0×106/ml ,
加 2 ml到预先放置盖玻片的 6孔板中 , 24 h 待细胞
爬片后 ,加入终浓度为 100 、50 mg/L 的 CE ,继续培
养 24 h 后 ,吸尽培养液 ,用固定液固定 10 min 后 ,
去固定液 ,PBS 洗两次 ,每次洗 3 min ,加入 Hoechst
33258染液 ,余按说明书操作 ,于倒置荧光显微镜下
观察并拍照 ,实验重复 3次[ 1] 。
1.2.5　免疫细胞化学染色检测凋亡相关因子 Bcl-2
及 Bax 的表达　取对数生长期细胞 2.0×10 5/ml加
入 6孔板内 ,每孔 1.5 ml ,待细胞贴壁后加药12.5 、
25 、50 、100 mg/L ,常规培养 48 h后 , 95%乙醇固定
15 ～ 30 min ,PBS冲洗 3次×5 min ,用 SP 法进行免
疫细胞化学染色 ,分别检测细胞内Bcl-2蛋白及 Bax
蛋白的表达。实验步骤依照试剂盒说明书进行 ,
DAB 显色 ,苏木精对比染色 ,中性树胶封片。以胞
质内出现明显棕褐色颗粒 ,其强度大于背景非特异
性染色者判定为阳性[ 9] 。
1.2.6　流式细胞仪检测细胞周期　取对数生长期
的 NCI-H460细胞 ,0.25%胰酶消化成单细胞悬液 ,
以 3.0×106/ml接种于 6孔培养板中 ,每孔 2 ml ,常
规培养 ,待细胞贴壁后加药。药物处理组加入终浓
度分别为 12.5 、25 、50 mg/L 的药液 ,对照组加入等
量的PBS液继续培养 ,于 48 h消化收集各组细胞离
心(1 000 r/ min×7 min),制成单细胞悬液 ,用预冷
的 70%乙醇固定过夜 ,余按试剂盒说明操作[ 10] 。
1.3　统计学方法
实验数据采用 Origin 7.5 统计软件处理 ,结果
用 x±s表示。
2　结果
2.1　CE 对 NCI-H460细胞增殖的影响
采用 MT T 法检测 CE 对细胞增殖的影响 ,结
果表明 CE 能明显抑制 NCI-H460 细胞的生长 ,其
效果与时间和浓度相关 ,见表 1。
表 1　CE对 NCI-H460 细胞生长的抑制率( x±s , n=3)
Tab1e 1　Growth inhibition of NCI-H460 cell induced
by CE( x±s , n=3)
T ime
IC50(mg/ L)
CE 5-Fu
24 h 36.22±3.04 46.76±2.24%
48 h 41.21±2.50 48.20±3.42%
72 h 62.55±3.47 24.27±2.60%
2.2　CE 诱导 NCI-H460细胞凋亡的形态学变化
经 Hoechst 33258染色后的 NCI-H460 细胞 ,
对照组细胞核大小较均一 ,呈圆形或椭圆形 ,染色质
分布均匀;而经 CE处理 24 h 后则观察到典型的细
·629·肿瘤防治研究 2011年第 38卷第 6期
胞凋亡形态学特征:细胞核出现不同程度皱缩 、变
形 、部分细胞核染色体碎裂 、体积缩小 、呈致密的颗
粒状 、块状浓染荧光 、并有凋亡小体出现 ,且凋亡细
胞数目的多少与 CE的浓度相关 ,见图 1。
2.3　免疫细胞化学染色检测 NCI-H460 细胞中凋
亡相关因子 Bcl-2及 Bax 的表达
Bcl-2 、Bax 主要表达于胞质。根据实验结果阴
性对照组 Bcl-2和 Bax 几乎无表达;CE作用组中两
者的阳性细胞数明显多于阴性对照组且 Bcl-2表达
的颜色随 CE 作用的浓度增大而变淡 , Bax 表达的
颜色随 CE作用的浓度增大而加深。由此可见 CE
可通过上调凋亡促进因子 Bax 同时下调凋亡抑制
因子 Bcl-2的表达来促进 NCI-H460细胞的凋亡。
2.4　流式细胞仪检测细胞周期
CE作用细胞 48 h 后 , NCI-H460 细胞的细胞
周期发生了变化。随着 CE 作用浓度的增加 , G 0/
G 1 期细胞逐渐增多 , S 期的逐渐细胞减少 ,见图 2。
结果表明 CE 能够影响 NCI-H460 细胞的细胞周
期 ,使其被阻滞在 G1/S期 ,从而抑制细胞的增殖。
3　讨论
Bcl-2和 Bax 分别是 Bcl-2家族中最有代表性
的抑制凋亡和促进凋亡的蛋白 ,并且 Bax 是 Bcl-2
活性的主要调控因子 ,这两种蛋白以线粒体为靶点
共同调控着细胞对凋亡信号的敏感度[ 9] 。本实验发
现 ,当 CE 的浓度达到 50 mg/L 时 ,能够抑制 Bcl-2
蛋白的表达同时促进 Bax 蛋白的表达;当作用浓度
达到 100 mg/L 时作用更明显。这说明 CE对 Bcl-
2 、Bax 蛋白表达的影响与其浓度密切相关。在线粒
体凋亡通路中 ,Bax 与 Bcl-2蛋白相互结合 ,彼此制
约 ,细胞凋亡与否取决于两者在细胞中的相对含量。
当 Bax/Bcl-2比值升高会促进细胞凋亡 ,比值降低
会抑制细胞凋亡 。研究结果发现 ,在 CE诱导 NCI-
H460细胞凋亡中 ,Bcl-2和 Bax 蛋白都发挥着不可
替代的作用 。
Hoechst 33258染色后 ,在荧光显微镜下观察 ,对
照组 NCI-H460细胞的细胞核为蓝色 ,比较均匀 ,无
凋亡细胞;而 50 、100 mg/ L CE作用组的细胞核 ,染色
质比较致密发亮 ,有的形成凋亡小体 ,有的细胞核断
裂为不同的碎片 ,显示有凋亡细胞存在 。采用 FCM
检测不同浓度的 CE作用 NCI-H460细胞 48 h 后对
细胞周期的影响 ,可反映肿瘤细胞的增殖状态。随着
CE作用浓度的增大 ,G0/G 1 细胞逐渐增多 ,S期细胞
逐渐减少 ,因为G 1 期是决定细胞增殖状态的关键阶
段 ,存在调节细胞周期的检测点(R点),可以阻止受
伤的细胞进入 S期 ,从而抑制细胞的增殖。
1a:contro l g roup ;1b ～ 1c:NCI-H 460 t reated w ith 50 and 100 mg/L CE for 24 h , respectively
图 1　CE诱导的 NCI-H460 凋亡细胞形态学变化(荧光显微镜×400倍)
Figure 1 　Morphology of apoptotic NCI-H460 cells induced by CE observed by fluorescence microscopy(×400)
A:control g roup ;B ～ D:NCI-H460 treated w ith 12.5 , 25 and 50 mg/L CE , respectively for 48 h
图 2　CE作用 NCI-H460 细胞后细胞周期分析
Figure 2　Cell cycle analysis of NCI-H460 cells
·630· 肿瘤防治研究 2011年第 38卷第 6期
　　综上所述 ,文殊兰叶氯仿提取物可以抑制 NCI-
H460肿瘤细胞的增殖 ,并呈剂量和时间依赖性;同
时它能诱导 NCI-H460 细胞的凋亡 ,且凋亡的程度
随着 CE 浓度的增大而增大 ,细胞周期被阻滞于
G 1/S 期 ,这可能与细胞的增殖抑制有关 。本课题虽
然对 CE 抗肿瘤及诱导肿瘤细胞凋亡做了一些工
作 ,但对其单体化合物以及诱导肿瘤细胞凋亡的机
制有待进一步探讨。
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[ 编辑:黄园玲;校对:安　凤]
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