全 文 ：收稿日期:2008-05-17;修回日期:2008-06-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870900);粤
港合作课题(GHP/ 022/ 06)
作者单位:1.524023 广东湛江 , 广东医学院广东天然药
物研究与开发重点实验室;2.香港 新界 沙田 韦尔斯亲王医
院 香港中文大学外科系;3.广东医学院生物化学与分子生
物学研究所
通信作者:梁念慈 , E-mail:plliu78@ sina.com
作者简介:刘义(1978-), 男 , 硕士 , 助理研究员 , 主要从
事抗肿瘤生化药理研究
DOI:10.3971/ j.issn.1000-8578.2009.01.003
半边旗提取物 5F 对非小细胞肺癌 NCI-H460
细胞生长的抑制作用
刘　义1 ,吴科锋1 ,李　立1 , Geo rge G CHEN 2 , Michael K Y HSIN 2 ,
Malcolm J UNDERWOOD2 ,梁念慈1 , 3
Inhibitory Effects of 5F from Pteris semiinnata L.on Prol iferation of Non-small Cell
Lung Cancer NCI-H460 Cells
LIU Yi1 , WU Ke-feng 1 , LI L i1 , George G CHEN 2 ,Michael KY HSIN 2 , Malco lm J UNDERWOOD2 , LI-
ANG Lian-ci1 ,3
1.Guangdong Key Laboratory f or Research and Development o f Nature Drugs , Guang dong Medical
College , Zhan jiang 524023 , China;2.Department o f S urgery , The Chinese University of HongKong ,
Prince of Wales Hospital , Shatin , N.T.;3.Institute o f B iochemistry and Molecular B iology , Guang-
dong Medical College
Corresponding Authors:LIANG Lian-ci , E-mail:plliu78 @sina.com
Abstract:Objective　 To investiga te inhibito ry effects of 5F from Pteris semiinnata L.on proliferation o f
Non-small cell lung cance r NCI-H460 cells.Methods　NCI-H 460 cell gr ow th inhibition media ted by 5F
was de tected by MT T.P I-Hoechst double staining and TUNEL assay w ere used to observ e cell apopto-
sis.Flow cy tometer was used to determine the effect of 5F on the content o f DNA in cells.Results　5F
display ed g row th inhibito ry activity ag ainst NCI-H 460 cells with IC50 values o f 21.40 , 4.52 and 1.02μg/
ml at the point of 24 , 48 and 72 hours.5F could induce apoptosis.NCI-H460 cells trea ted by 5F we re
arre ste t in G 2/M.Conclusion　In vitro 5F significantly inhibited the prolifera tion of NCI-H460 cells and
the activity might be rea lized thr ough inducing apopto sis.
Key words:Pteris semiinnata L;5F;NCI-H460;P rolifera tion inhibited
摘　要:目的　研究半边旗提取物 5F 对非小细胞肺癌 NCI-H460 细胞生长的抑制作用。方法　M TT
法检测 5F 对 NCI-H460 细胞的生长抑制作用;用 P I-H oechst 荧光双染法和 TUNEL法检测细胞凋亡;
流式细胞仪检测 5F 对 DNA 含量的影响。结果　5F 抑制 NCI-H460 细胞的生长 ,其效果与 5F 的浓度
和作用时间相关 , 24、48 、72 h 的 IC50分别为:21.40、4.52 、1.02μg/ ml;荧光双染色法显示经 5F 作用后
细胞出现变形 ,染色质浓缩 , 产生凋亡小体;细胞被阻滞在 G 2/M 期。结论　5F 在体外能有效地抑制
NCI-H460 细胞的生长 ,其作用可能是通过诱导其凋亡产生的。
关键词:半边旗;5F;NCI-H460;生长抑制
中图分类号:R734.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8578(2009)01-0009-04
0　引言
半边旗(Pteris semiinnata L.)是生长在我国南方
的传统中草药 ,民间用其来治疗感染性疾病。从半边
旗中分离提取到一些具有生物活性的物质 ,以 5F 含
量最高 ,其结构为二萜类化合物 ,见图 1。化学结构
名为 11-α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸
(Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur 16-en-19-oic acid)。本
课题研究表明 5F在体外能抑制多种癌细胞的生长并
诱导凋亡的发生;能明显减小 K562 、S180等瘤株在小
鼠所形成的肿瘤大小 ,延长小鼠存活时间[ 1-3] 。
图 1　5F的化学结构
Fig 1　The structure of compound 5F
·9·肿瘤防治研究 2009年第 36卷第 1期
　　肺癌是目前全世界人类最主要的癌症死因之
一 ,其中 75%～ 80%为非小细胞肺癌(NSNLC), 晚
期肺癌患者仅有 2%存活率超过 5 年 ,通常不满 1
年。近年来 ,对肺癌患者的治疗还是以化疗和放疗
为主导 ,这些治疗药物和措施会给患者带来极大的
痛苦 ,因此 ,从天然植物中提取具有抑制肺癌细胞生
长的高效低毒的化合物已经成为抗肿瘤研究的热
点。本研究旨在探讨 5F 对非小细胞肺癌 NCI-
H460细胞生长的抑制作用及可能的机制。
1　材料与方法
1.1　材料
从植物半边旗中提取的 5F ,纯度为 100%,使
用前溶于 DMSO 。
MTT 、Hoechst33342 、PI 为 Sigma 公司产品;
超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料
有限公司;RPM I-1640 购自美国 Hyclone 公司;胰
酶购自美国 Gibco 公司;细胞凋亡检测试剂盒为武
汉博士德生物工程有限公司产品;其余试剂均为国
产分析纯 。
非小细胞肺癌 NCI-H460细胞由本室传代 。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养
NCI-H460细胞培养于含 10%小牛血清 , 100
kU/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素的 RPM I-1640培
养液中 ,37℃、5% CO 2饱和湿度细胞培养箱培养 。
取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2　MTT 法检测 5F 对 NCI-H460细胞的生长
抑制作用
取对数生长期的 NCI-H460 细胞 ,用 0.25%胰
蛋白酶消化 , RPM I-1640 完全培养液调制成2.0×
10
4/ml细胞悬液 ,接种于 96 孔板中 ,每孔接种 100
μl(含2.0×103个细胞)。培养过夜后 ,吸出培养液 ,
加入新培养液 90μl及不同浓度的 5F 药液 10μl ,使
终浓度分别为 5 、10 、20 、40 、80 μg/ml。同时设置
ADM 阳性对照组 ,空白对照组加入相同体积的培
养液 ,每一浓度设 8个平行孔。继续培养 24 、48 、72
h。每孔加入 MT T(5 g/L)20μl ,继续培养 4 ～ 6 h 。
每孔加入 DMSO 100 μl。在微型振荡器上摇匀 15
min ,结晶溶解后 ,立即比色 ,用 ELX800 型酶标仪
在主波长为 570 nm , 参比波长为 630 处测量 OD
值 ,比色以空白孔调零。实验重复 3次 。
抑制率=(1-实验组 8孔 OD 值平均值/对照
组 8孔OD 值平均值)×100%。
Bliss方法计算半数抑制浓度 IC50 。
1.2.3　荧光显微镜观察细胞形态
取对数生长期细胞 , 调整细胞浓度为 2.0 ×
10
5/ml , 加 1ml到预先放置盖玻片的 6孔板中 , 24
h待细胞爬片后 , 加入不同浓度的 5F 药液 , 使其终
浓度为 5 、10 、 20μg/ml , 继续培养 24 h后 , 用预冷
的 PBS 洗涤 2次 , 加入 Hoechst33342 37℃染色 15
min , PBS 洗涤 2次 , 再加入 PI 染色液于冰上染色
15 min , PBS洗涤 2次 ,于荧光显微镜下观察并拍
照 。
1.2.4　流式细胞仪检测 DNA 含量的变化
参照文献介绍的方法略加改进 , 1 000 r/min ,
离心 5min收集药物处理组和对照组细胞 , PBS 洗
涤 2次 ,体积分数为 70%的乙醇-20℃固定 24 h以
上 ,PBS 离心洗去乙醇后加 PI 染液(含 50 mg/L
PI , 10 mg/L RnaseA , 0.1% T ri tonX-100 , 0.1%柠
檬酸钠和0.5%NaCl),室温下避光染色 30 min , 400
目筛网过滤 ,用 EPICSXL 型(美国)流式细胞仪检
测 DNA含量 ,实验重复 3次。
1.2.5　细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡
取对数生长期细胞 ,调整细胞浓度为2.0×105
个/ml ,加 1ml到预先放置盖玻片的 6孔板中 ,24 h
待细胞爬片后 ,加入不同浓度的 5F 药液 ,使其终浓
度为 5 、10 、20μg/ml ,继续培养 24 h 后 ,用 4%多聚
甲醛/0.01M PBS 室温下固定 60 min ,余下步骤按
试剂盒说明书进行操作 。
2　结果
2.1　5F 对 NCI-H460细胞生长的抑制作用
从表 1和图 2的结果可以看出 , 5F 能明显抑制
NCI-H460细胞的生长 ,其效果与时间和浓度相关。
5 、10 、20 、40 、80μg/ml的 5F 在作用细胞 48 h后效
果与阳性对照药 ADM 相近。 5F 作用 NCI-H460
细胞 24 、48 、72 h 的 IC50分别为:21.40 、4.52 、1.02
μg/ml。
2.2　荧光显微镜观察 5F 对 NCI-H460细胞的影响
经 PI-Hoechst 双染的 NCI-H460 细胞 , 对照
组细胞核大小较均一 , 呈圆形或椭圆形 , 染色质分
布均匀 , 此外光下显蓝色荧光 , 出现个别坏死细
胞 , 见图 3a 。而经 5F 处理 24 h后的 NCI-H460细
胞细胞形态则出现不同程度皱缩 , 变形 , 染色质浓
缩 , 部分细胞核染色体碎裂 , 并有凋亡小体出现 ,
见图 3b ～ d 。且细胞凋亡形态出现的多少与 5F 的
浓度相关。
2.3　流式细胞仪检测细胞 DNA的变化
5F 作用细胞 24 、48 h 后 NCI-H460 细胞的
DNA 含量发生变化 。随着 5F 作用终浓度的增加
(5 ～ 40μg/ml), G 0/G 1期DNA出现含量降低 , S期
·10· 肿瘤防治研究 2009年第 36卷第 1期
表 1　5F对 NCI-H460细胞的生长抑制作用( x±s , n=8)
Tab 1　Inhibition of NCI-H460 cell proliferation by 5F( x±s , n=8)
Concentration
(μg/ ml)
24 h 48 h 72 h
OD570 IR(%) OD570 IR(%) OD570 IR(%)
　　　Control 0.283±0.014 - 0.464±0.026 - 0.699±0.033 -
　ADM(5μg/ ml) 0.175±0.008 ＊＊ 38.3 0.107±0.003＊＊＊ 76.9 0.050±0.001 ＊＊＊ 93.9
　　　　 5 0.257±0.007 ＊ 8.9 0.201±0.015＊＊＊ 47.9 0.184±0.017 ＊＊＊ 73.7
　　　　10 0.178±0.010 ＊＊ 37.0 0.137±0.009＊＊＊ 70.5 0.083±0.005 ＊＊＊ 88.2
　　　　20 0.144±0.006 ＊＊＊ 49.1 0.101±0.006＊＊＊ 78.1 0.056±0.002 ＊＊＊ 92.0
　　　　40 0.104±0.010 ＊＊＊ 63.0 0.067±0.005＊＊＊ 85.4 0.002±0.001 ＊＊＊ 94.7
　　　　80 0.036±0.001 ＊＊＊ 87.0 0.040±0.003＊＊＊ 91.2 0.025±0.007 ＊＊＊ 96.5
　　＊:P<0.05;＊＊:P<0.01;＊＊＊:P<0.001
表 2　5F处理 NCI-H460 细胞不同时相 DNA含量的影响(%, x±s , n=8)
Tab 2　Effect of DNA content of NDI-H460 cells treated by 5F(%, x±s , n=8)
Concent ration
(μg/ml)
24 h 48 h
G 1/ G0 S G2/M G1/G 0 S G 2/M
　　Control 47.4±3.3 47.2±2.6 5.4±2.1 59.4±1.2 38.4±3.3 2.2±3.1
　　　 5 44.4±4.2 48.9±1.2 6.7±5.3 57.8±4.5 39.8±5.2 3.2±2.1
　　　10 43.5±2.5 48.4±3.1 8.1±3.3 54.6±3.1＊ 39.7±3.2 5.7±3.3
　　　20 39.4±3.2 ＊ 49.9±2.2 10.7±5.1＊ 48.9±4.2＊ 42.8±6.3 ＊ 9.3±4.1 ＊
　　　40 35.2±5.1 ＊ 51.6±3.4 13.2±3.2＊ 44.7±1.5＊ 44.7±2.4 ＊ 12.0±4.4 ＊
　　＊:P<0.05
图 2　5F对 NCI-H460 细胞的生长抑制作用
Fig 2　Inhibition of NCI-H460 cell proliferation by 5F
变化不明显 , G2/M 显著增加。提示 5F 可以将
NCI-H460细胞阻滞在 G 2/M 期 ,见表 2。
2.4　T UNEL 法检测 5F 对 NCI-H460细胞凋亡的
影响
T UNEL 法检测显示正常对照细胞不显深棕黄
色 ,而经 5F 处理后的细胞胞核呈深棕黄色 ,表现为
形态皱缩 ,核固缩 ,凝集成块 ,并形成凋亡小体 ,其凋
亡数与 5F 剂量呈正相关 ,见图 4。
3　讨论
临床上用于治疗肿瘤的热疗 、放疗 、化疗及生物
疗法一直被用于杀死肿瘤细胞 ,随着肿瘤的治疗正
朝着日益完善的综合治疗方向迈进 ,尤其近十几年
迅速发展的生物治疗给人们带来了新的希望 ,但目
前化学药物治疗在临床上依然起着重要作用。由于
化疗药物的毒副作用及易产生耐药性等缺陷 ,从天
然产物中筛选新的高效低毒的抗肿瘤药仍然是当务
之急。本课题对半边旗的有效活性成分及提取工艺
进行了详细的研究[ 4-6] ,多年的实验证实其二萜类提
取物 5F 在体外可致人的多种癌细胞死亡 ,主要作
用机制是诱导肿瘤细胞凋亡并能抑制肿瘤细胞的迁
移[ 7-9] 。
细胞凋亡(Apopto sis)是细胞在其生长 、发育过
程中发生的一种复杂的生理和病理过程 ,对机体的
正常发育和自身稳定起着极其重要的作用 。凋亡细
胞的特征是细胞体积缩小 ,随即与邻近细胞的连接
丧失 ,彼此脱离 ,失去微绒毛 ,胞浆浓缩 ,内质网扩张
呈泡状并与细胞膜融合 ,核染色质浓缩呈块 、团 ,典
型的为半月形 ,凝聚于核膜周边 ,核仁裂解 ,进而细
胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜性结
构 ,内含各种细胞成分的凋亡小体。不少疾病(包括
肿瘤)的发病与凋亡受抑制有关 ,许多抗癌药物都是
通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目
的[ 6] 。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡 ,
诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通
路 ,所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一
项重要指标 。
　　实验结果表明 ,5F在体外能显著的抑制NCI-H460
·11·肿瘤防治研究 2009年第 36卷第 1期
a:con trol;b:5μg/ml 5F , 24 h , cells stained wi th Hoechst-PI;c:10μg/m l 5F , 24 h , cells s tained w ith
H oechst-PI;d:20μg/ml 5F , 24 h , cell s stained w ith H oech st-PI
图 3　荧光显微镜观察 5F 诱导的 NCI-H460 凋亡细胞形态学变化(×200)
Fig 3　Morphological analysis of NCI-H460 apoptotic cells induced by 5F by flurescence microscopy(×200)
a:cont rol;b:10μg/ml 5F;c:20μg/m l 5F
图 4　TUNEL法检测 5F诱导的 NCI-H460 细胞凋亡(×200)
Fig 4　TUNEL analysis of NCI-H460 cells apoptosis induced by 5F(×400)
细胞的生长增殖 ,24 、48 、72 h 的 IC50分别为:21.40 、
4.52 、1.02μg/ml , 5F 对其的生长抑制作用呈浓度
-剂量及时间-剂量关系;荧光双染的结果显示经
不同浓度的 5F 处理 24 h后的 NCI-H460细胞细胞
形态出现不同程度皱缩 ,变形 ,染色质浓缩 ,部分细
胞核染色体碎裂 ,并伴有凋亡小体出现 ,细胞凋亡形
态出现的数量与 5F 的作用浓度有关 ,这提示 5F 体
外对 NCI-H460的生长抑制作用可能与其诱导凋亡
有关;流式细胞仪检测结果发现细胞被阻滞在 G 2/
M 期 ,但 5F 终浓度为 40 μg/ml时 ,细胞周期各时
相均出现不同程度的改变 ,这可能与高浓度 5F 直
接杀伤细胞 , 表现出细胞毒作用有关;进一步用
T UNEL 法进行凋亡检测证实了 5F 抑制 NCI-
H460生长的作用是由其诱导凋亡而产生的。提示
5F 具有诱导 NCI-H460细胞凋亡的能力 ,是一种值
得深入研究的新型抗肿瘤候选化合物。
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[ 编辑:周永红;校对:杨　卉]
·12· 肿瘤防治研究 2009年第 36卷第 1期