全 文 ：研究报告
Research Report
砂藓MYB转录因子基因 RcMYB的克隆及表达分析
沙伟 * 索荔 张梅娟 张春蕾 周伯
齐齐哈尔大学,生命科学与农林学院,齐齐哈尔, 161006
*通讯作者, shw1129@263.net
摘 要 以砂藓(Racomitrium canescens)转录组测序获得的一条与抗旱相关的 MYB转录因子基因为基础，
采用 RT-PCR技术克隆得到该基因的 cDNA全长序列，命名为 RcMYB。该序列全长为 862 bp，开放阅读框
为 726 bp，共编码氨基酸 241个。该基因的蛋白相对分子质量为 28.8 kD，等电点为 7.77，不稳定系数为
70.03，是不稳定性蛋白，平均亲水数为 -0.548，预测分析该蛋白具有强亲水性。蛋白结构域分析表明，
RcMYB蛋白含有Myb-DNA结合结构域和MYB-CC结构域。实时荧光定量 PCR研究表明，在复水过程和
干旱处理的条件下 RcMYB基因均有所表达。上述研究结果为基因 RcMYB的功能研究奠定基础。
关键词 砂藓, MYB转录因子, RcMYB基因,基因克隆,表达分析
Cloning and Expression Analysis of MYB Transcription Factor Gene
RcMYB from Racomitrium canescens
Sha Wei * Suo Li Zhang MeiJuan Zhang Chunlei Zhou Bo
College of Life Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar, 161006
* Corresponding author, shw1129@263.net
DOI: 10.13417/j.gab.034.000792
Abstract A full length cDNA sequence of MYB transcription factor gene was cloned from Racomitrium
canescens using RT-PCR, named as RcMYB. RcMYB was 862 bp in length, and open reading frame of 726 bp,
encoding a protein of 241 amino acids. Protein relative molecular mass of gene was 28.8 kD and pI was 7.77.
Unstable coefficient is 70.03 and showed this protein was instabile, and average number of hydrophilic was
-0.548. Prediction and analysis of sequence showed the protein was highly hydrophilic. Protein domain analysis
showed that RcMYB protein contained MYB DNA-binding domain and MYB-CC domain. The qRT-PCR results
showed that RcMYB gene could express in water recovery process and drought treatment. The results would lay
the foundations for the study of RcMYB gene function.
Keywords Racomitrium canescens, MYB transcription factor, RcMYB gene, Gene cloning, Expression analysis
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31070180, 31270254)资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 4期，第 792-796页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.4, 792-796
植物受到非生物胁迫后，会通过体内的生理生
化和分子机制进行调节，快速修复逆境胁迫所造成
的损伤，适应不断变化的环境。而转录因子在介导适
应环境的变化过程中发挥重要作用。
MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族
成员。MYB家族基因都具有MYB-DNA结合域，并
且高度保守。MYB结构域一般含有 1~3个重复序
列，每个重复有 51~53个氨基酸的重复序列组成。每
个序列中的第 2个与第 3个螺旋会形成 HTH的构
象(螺旋 -转角 -螺旋)，而序列中的第 3个 琢螺旋具
有识别功能并结合 DNA的大沟(Ogata et al., 1996; Jia
et al., 2004)。所以根据MYB转录因子结构域和序列数
目不同分为 4种类型：(1) 1R-MYB；(2) R2R3-MYB；
(3) 3R-MYB；(4) 4R-MYB, R1/R2。共 4个结构域组
成(Dubos et al., 2010)。
最早的 MYB转录因子是从鸟类的成髓细胞瘤
病毒 v-myb中发现的，而 v-myb形成是初始 DNA进
行重排后，前体 c-myb 随之作为中间体进行剪接
RNA而成(Klempnauer et al., 1982)。植物中首次发现
是在 1987年，在单子叶植物玉米中克隆出与色素合
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
成相关的 ZmMYBCl 基因，该基因与动物体内的
MYB基因具有 40%的相似率(Paz-Ares et al., 1987)。
大量类基因从植物中分离鉴定。在细胞分化、环境调
节及次生代谢中起到了重要作用。
砂藓(Racomitrium canescens)为紫萼藓科(Grim-
miaceae)砂藓属(Racomitrium)，生于高山地区岩石或
砂土山坡上，植物体粗壮。叶干燥时紧贴覆瓦状排
列，湿润时伸展，卵圆形至阔卵圆状披针形。复水后
可在短时间内恢复活力，是典型的耐旱藓类，是较好
的抗逆基因资源植物。本研究利用转录组测序数据
进行分析，得到一条与抗旱相关的MYB转录因子基
因，通过 RT-PCR的方法克隆得到 RcMYB基因。再
通过生物信息学软件分析该基因的特征，同时利用
荧光定量 PCR比较砂藓在不同时段复水和干旱状
态下基因的相对表达水平，为进一步研究砂藓抗旱
分子机制奠定基础。
1结果分析
1.1 RcMYB基因的克隆
利用引物 RcMYB-F和 RcMYB-R扩增的目的片
段通过 1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，得到一条清晰
并单一的特异性片段，如图 1所示，经测序检验，条
图 1 RcMYB基因扩增产物
Figure 1 Amplification of RcMYB gene cDNA sequence
带长度为 862 bp，与预期片段大小一致。
1.2砂藓 RcMYB基因所编码蛋白的生物信息学分析
经分析，RcMYB序列全长 862 bp，开放阅读框
为726 bp，共编码氨基酸 241个(图 2)。使用软件(Prot
Param)预测出蛋白的相对分子质量为 28.8 kD，理论
等电点为 7.77其中有 31个氨基酸残基(Asp+Glu)带
正电荷，30个氨基酸残基(Arg+Lys)带负电荷；不稳
定系数为 70.03，是不稳定性蛋白(<40为稳定性蛋白)，
平均亲水数为 -0.252。用 Prot Scale对该基因亲疏水
性分析发现，最低得分 (MIN)为 -3.289，最高得分
(MAX)为 1.833，由于具有较低负值的氨基酸具有较
强的亲水性，推测该蛋白也具有较强的亲水性。用
Singal P进行信号肽预测显示，氨基酸序列无信号肽
图 2 RcMYB cDNA的核苷酸序列及氨基酸序列
Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of RcMYB
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砂藓MYB转录因子基因 RcMYB的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of MYB Transcription Factor Gene RcMYB from Racomitrium canescens
位点，属于非分泌性蛋白质；用 Tmpred对 RcMYB
氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，结果显示，
RcMYB位于细胞膜外；使用 Target P 软件预测得
知，RcMYB 的 cTP 值为 0.056，mTP 值为 0.220，SP
值为 0.074，而在其它细胞器的值高达 0.818；蛋白结
构域分析表明，RcMYB蛋白含有Myb-DNA结合结
构域和 MYB-CC结构域(图 3)。通过蛋白质二级结
构预测表明，该蛋白质 33.71%为 琢螺旋，11.99%为延
伸链，54.31%为无规则卷曲(图 4)。用 SWISS-MODEL
模拟 RcMYB的三维立体结构，如图 5所示。
1.3 RcMYB基因的序列比对及系统进化树分析
利用 BLAST软件在线搜索与 RcMYB基因同源
性较高的序列，再通过 MEGA 5.0软件构建系统进
化树(图 6)。结果发现，该基因与玉米(Zea mays)、粟
(Setaria italica)、高粱 (Sorghum bicolor)、小立碗藓
(Physcomitrella patens)、山羊草(Aegilops tauschii)、籼
稻 (Oryza sativa indica Group)、拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)、亚麻芥 (Camelina sativa)和海枣 (Phoenix
dactylifera)等对比后其同源相似性均在 40%以上。
1.4 RcMYB基因在复水和干旱处理过程中的表达分析
以RcMYB-A和 RcMYB-B为引物，分别取不同
时间段复水和干旱处理下砂藓茎尖的 cDNA为模
板，进行实时荧光定量 PCR检测，结果显示，RcMYB
基因在不同时间段处理条件下均有所表达(图 7)。复
水 4 d时表达量较高，是对照组表达量的 6.7倍，当
复水 5 d时表达量有所下降，表达趋于稳定。当快速
图 5砂藓 RcMYB蛋白三维结构
Figure 5 The predicted 3D structure of RcMYB in R. canescens
图 4 GOR法预测 RcMYB的二级结构
注:竖线从长至短依次为: 琢螺旋,延伸链,无规则卷曲
Figure 4 The secondary structure prediction of RcMYB by GOR
method
Note: The vertical line from long to short sequence for: alpha he-
lix, extended strand, random coil
图 3砂藓 RcMYB蛋白结构域
Figure 3 Protein domain of RcMYB in R. canescens
图 6 RcMYB基因编码蛋白的系统进化树
Figure 6 Phylogenetic tree analysis of proteins encoded byRcMYB
genes
图 7砂藓 RcMYB在复水(A)和干旱(B)处理时基因的表达量
Figure 7 Expression analysis of RcMYB gene during rehydration
(A) and hydration (B) treatment
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
干燥 10 min、20 min时基因表达变化不显著，当处理
时间延长至 1 h，基因表达量快速升高，达到对照表
达量的 7.1倍。随着胁迫时间间隔的延长，其表达量
具有下降的趋势，而快速干旱 2 d后，其表达量到达
最低，但高于对照组，是对照 CK的 2.3倍。结果说明
当基因 RcMYB基因受到干旱胁迫后能被诱导表达，
能够对干旱胁迫作出相应的响应。
2讨论
近些年研究表明，MYB转录因子基因在植物抵
抗逆境胁迫时具有重要作用。有研究报道，超表达水
稻 OsMYB2基因，发现超表达的植株与野生型植株
在表型上没有区别，但是超表达植株对于耐盐、冷、
脱水比野生型更具有耐受性，对脱落酸更为敏感，在
盐胁迫下转基因比野生型积累更多的可溶性糖和脯
氨酸。OsMYB2编码 myb转录因子，并发现此基因起
到监控管理的作用(Yang et al., 2012)。小麦中发现
TaMYB73基因是一种新型的MYB蛋白，在拟南芥
中过表达该基因，增强对 Nacl的抗性(He et al., 2012)。
在转基因拟南芥中过表达 tamyb30-b 基因表明，
tamyb30-b蛋白可提高发芽率和幼苗期干旱胁迫的
耐受性；还发现在干旱胁迫响应下，过表达 tamyb30-b
基因引起某些生理指标的变化，使植物克服不利条
件。显著提高了转基因植株对干旱胁迫的抗性(Zhang
et al., 2012)。水稻中 osmyb2p-1 基因是一种新型的
R2R3-MYB转录因子，参与水稻磷饥饿信号应答。
利用 RNA 干扰使转基因水稻对磷更为敏感，而
osmyb2p-1可控制调节蛋白表达(Dai et al., 2012)。
正常环境下，大部分植物受到干旱胁迫后，植物
会丢失相应比例的水分直至萎蔫死亡，而耐旱藓类却
可以抵御干旱并且能快速复水(宋晓宏和沙伟, 2014)。
耐旱藓类在复水和干旱情况下基因表达有所不同，
研究发现对山墙藓复水的最初蛋白合成没有明显的
变化，随着复水时间延长，蛋白合成逐渐上升直至恢
复稳定(Oliver, 1991)，而对其缓慢的干燥过程中发现
山墙藓产生必要的保护机制抵御干旱(吴鹏程, 1998)。
本实验通过实时荧光定量 PCR的方法研究 RcMYB
在复水与干旱条件下转录水平的变化情况。结果表
明，RcMYB在复水与干旱条件下均有所表达，复水
后表达量在 4 d时达到最大值，干旱处理后表达量在
1 h时达到最大值，但之后有下降的趋势，但表达量
始终是高于对照 CK，说明基因 RcMYB在复水与干
旱条件下可能都参与了应答反应。该结论为研究
RcMYB 在转录水平上如何参与砂藓抗旱信号转导
奠定了基础，同时也为 RcMYB在信号通路中的定位
提供了资料。对砂藓 RcMYB基因的克隆、生物信息
学分析和表达特性方面的研究，有助于深入研究该
基因在干旱胁迫中的分子功能，并为进一步研究苔
藓植物的耐旱机制奠定基础。
3材料与方法
3.1材料及处理
砂藓采自黑龙江省五大连池风景区。将新鲜采
集植株带回实验室后风干保存，留以实验备用。将标
本复水处理，时长分别为 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，使用
培养恢复至自然生长的材料作为对照；将自然生长
状态下的材料进行硅胶快速干燥处理，处理时间依
次是 10 min、20 min、30 min、1 h、4 h、8 h、1 d、2 d，并
以长期干旱的材料作为对照，取材后用液氮速冻后
于 -80℃冰箱保存备用。
3.2方法
3.2.1砂藓总 RNA提取及 cDNA第一链合成
使用改良的 SDS提取方法(张梅娟等, 2009)，用
NanoDrop 2000和 1%琼脂糖凝胶电泳对 RNA完整
性进行检测。取 OD260/280在 1.8~2.0之间的样品进行
RNA纯化(用 DNase去除 RNA中的 DNA污染)，用
M-MLV反转录酶(TaKaRa公司)合成 cDNA第一链。
3.2.2 RcMYB基因的克隆
在NCBI网站上查找预测序列的开放阅读框。在
两端非编码区设计特异引物 RcMYB-F：ACGCGTCG
ACTTGCGTGTCATGGGGGTT和 RcMYB-R：CGGG
ATCCTCGTCCCAGAAGTTACCCTAGA，使用 PCR
扩增该基因的 cDNA序列。PCR反应条件：94℃预变
性 4min；94℃变性 55 s，56℃退火 55 s，72℃延伸 90 s，
运行 32个循环；72℃延伸 8 min的程序。经 PCR扩增
的产物通过 1%琼脂糖凝胶进行检测，利用的胶回收
试剂盒进行回收并连接到载体 pMD18-T上，将重组
质粒转化到 DH5琢中，通过蓝白斑筛选阳性克隆，送
至华大生物技术有限公司进行测序。
3.2.3 RcMYB基因的生物信息学分析
利用 Prot Param (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pr
ojects/gorf/)软件对氨基酸序列的多个物理和化学参
数(分子量,等电点,吸光系数等)进行计算。氨基酸亲
疏水性特征分析采用 Prot Scale (http://expasy.org/tools/
protscale.html/)程序；蛋白信号肽预测用 Signal P程
序 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；利用 Tm-
795
pred软件(http//www.ch. Embnet.org/software/TMPR-
ED form.html)预测蛋白跨膜区域；亚细胞定位采用
Target P程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)
进行预测；蛋白质结构功能域分析通过 SMART (http://
smart.embl-heidelberg.de/)进行分析。使用 GOR软件
(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/
NPSA/npsa_gor4.html)进行蛋白质二级结构的预测；
采用 SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)预
测蛋白的三级结构；系统进化树利用 MEGA 5.0计
算同源性。
3.2.4基因 RcMYB荧光定量 PCR分析
提取各处理样品的总 RNA，用琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA的完整性反转录合成 cDNA。根据荧光定
量引物设计原则，设计其引物 RcMYB-A：GACCTGA
GCTTTCTGGCATC和RcMYB-B：TTGTGCCTTCAC
TTGCATTC以砂藓的 18SrRNA-F：CCGCTAAGTCC
GTCACAG；rRNA-R：AGTCACGCAGGCAGTTCC为
内参基因，用荧光染料(EvaGreenTM)法，进行实时荧
光定量 PCR检测，PCR反应体系(20滋L)为：Eva Green
10 滋L，cDNA 2 滋L，上下游引物各 0.8 滋L，加入适量
ddH2O，反应参数：95℃ 30 s；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃
30 s，35个循环；溶解曲线的绘制温度为 65~95℃，每
个反应重复 3次，求平均值，利用 2-驻驻Ct算法计算基因
的相对表达量。
作者贡献
沙伟主要负责实验设计与指导和论文修改；索荔
主要负责基因克隆、基因的生物信息学分析以及基因
的表达分析；张梅娟主要负责实验样品的采集及设计
基因表达实验；索荔、张春蕾和周伯负责提取 RNA。
致谢
感谢国家自然科学基金项目(31070180, 31270254)
对本实验的资助。
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