全 文 ：收稿日期:2007-11-06
基金项目:国家自然科学基金资助课题(30271537)。
作者简介:尹德明(1973-),男 ,讲师 , 博士 ,主要从事植物细胞培养工程研究。
通讯作者:娄红祥 ,教授。 E-mail:louhongxiang@sdu.edu.cn
　文章编号:1671-7554(2008)04-0433-05
地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立
尹德明 ,温学森 ,娄红祥
(山东大学药学院天然药物化学教研室 , 济南 250012)
摘要:目的　探计对地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养的条件。方法　用 MSK-2 和MS 培养基对地钱配子体进
行愈伤组织诱导 , 运用模糊评判对 MSK-2 培养基生长激素组合进行综合性状评价。结果　MSK-2 和 MS(2 mg L
6-BA)均能诱导出地钱愈伤组织 ,其中MSK-2 的诱导效果较好。光照(3 000～ 8 000 lux)能有效地促进地钱愈伤组织
生长。激素配比组合是 0.5 mg L 2 , 4-D+2 mg L NAA+2 mg L 6-BA适合于地钱细胞生长以及次生代谢生产。结论
　地钱愈伤组织的诱导成功和悬浮细胞培养条件的建立 , 为探索药用苔藓植物次生代谢产物生产提供新的途径
以及对苔藓植物细胞规模化培养提供新的理论指导。
关键词:苔藓;地钱;愈伤组织;植物细胞培养
中图分类号:Q813.1　　　文献标志码:A
Initiation of callus tissues and establishment of suspension culture of
Marchantia polymorpha L.cells
YIN De-ming , WEN Xue-sen , LOU Hong-xiang
(Department of Natural Drug and Chemistry , School of Pharmaceutical Science , Shandong University , Jinan 250012 , China)
Abstract:Objective　To induce callus tissues and establish suspension culture of Marchantia polymorpha L.Methods　MSK-
2 andMS mediums were used to induce gametophytes into callus tissues , and the fuzzy comprehensive evaluation method was used
to assess the optimal phytohormone combination.Results　Both MSK-2 andMS(2 mg L 6-BA)mediums could induce callus tis-
sue formation , and the MSK-2 medium was superior to the MS medium for callus tissue induction.Light intensity(3 000-8 000
lux)effectively promoted the callus tissue growth.Optimal phytohormone combination for cell growth and secondary metabolism
production was 0.5 mg L 2 , 4-D+2 mg L NAA+2mg L 6-BA.Conclusions　Successful induction of the callus tissues and es-
tablishment of suspension culture of Marchantia polymorpha L.provide a new pathway for exploring the pharmaceutical moss to
produce secondary metabolism and new theory guidance for suspension culture of moss cells on a large scale.
Key words:Bryophyte;Marchantia polymorpha L.;Callus tissue;Cell culture
　　地钱是苔藓类苔纲地钱科植物 ,其体内含有丰
富的抗真菌和抗肿瘤以及可逆转真菌和肿瘤的耐药
联苄类化合物-羽苔素 E(PLagiochin E)[ 1-2] 。由于
苔藓植株矮小 ,贴地表并常与腐生菌混杂生长 ,不易
采集和分离 ,并且其生物量少 ,很难获得一定数量单
纯的试验材料提取活性成分完成药理学 、药代学等
研究工作 。
植物细胞具有易于培养 ,生长迅速而且不受自
然条件限制和不破坏自然资源 ,可连续 、均匀和无限
地生产次生代谢物质的特点[ 3] ,因此 ,可通过苔藓植
物细胞培养规模化培养药用苔藓[ 4] ,也可作为模式
植物进行生物学研究[ 5-6] 。本实验以地钱为材料 ,对
其进行愈伤组织诱导和悬浮细胞培养条件的探索 ,
旨在为规模化培养地钱细胞生产次生代谢产物提供
理论依据 。
　第 46 卷　第 4期
　Vol.46　 No.4 　 　 　 　 　
山　东　大　学　学　报　(医　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)　 　 　 　 　
2008年 4 月　
Apr.2008　
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　无菌材料获得及愈伤组织诱导　实验所用
的地钱(Marchantia polymorpha L.)配子体由本实验
室提供 。将培养在温室内地钱上的湿沙洗掉 ,流水
冲洗 2 h ,在无菌室内用无菌滤纸吸干 ,剪成 0.5 cm
块状 ,放入 7%NaClO消毒 2 min ,无菌水冲洗 3次 ,
于培养温度为 25 ℃,光照时间 12 h d ,光强为 5 000
lux 的条件下。采用 MS 、MS(2 mg L 6-BA)和 MSK-
2
[ 7]作为愈伤组织诱导培养基。以上培养基均添加
0.9%琼脂 ,在高温灭菌前 pH值调至 5.8。
1.1.2　悬浮培养条件的建立　悬浮细胞经液体培
养基继代培养 5代以上 ,作为细胞种子 。选取MSK-
2 、MS 、KNOP 、White 、B5 、Miller、1 2MSK-2 和 1 2MS等
用于筛选悬浮细胞培养基 ,将筛选得到对细胞生长
良好培养基进行激素 2 ,4-D 、NAA和 6-BA(浓度0.5 、
1和 2mg L)组合优化 ,以求建立对细胞生长和次生
代谢合成均为有利的悬浮培养条件。第 20 d取样
进行各生化指标测定 ,重复 3次 。
1.2　实验方法
1.2.1　光照强度的设定　将固体培养愈伤细胞置
于培养温度25 ℃,光照时间12 h d HPG-350HX智能
型植物生长培养箱(黑龙江哈尔滨市东联电子技术
开发有限公司)内 ,分别设定光照强度 0 、3 000 、5 000
和8 000 lux 来考察光照对细胞生长的影响。
1.2.2　pH 的测定　采用 PHS-2型精密酸度计(上
海雷磁仪表厂)测定 。
1.2.3　叶绿素(chlorophyll)含量的测定　采用丙酮
乙醇混合液法测叶绿素含量[ 8] 。将 10 mL悬浮地钱
细胞经3 000 r min离心后 ,置于 6mL 丙酮和无水乙
醇等比例混合浸提液中 , 放于暗处 ,室温下进行浸
提 ,652 nm 处测定光密度 ,叶绿素含量用 mg g 或
mg L表示 。
1.2.4 　细胞膜通透性的测定 　采用伊文思蓝
(Evans blue)染色法[ 9] 。取 1 g 鲜细胞 ,用 0.5mL 0.
05%的伊文斯兰溶液将细胞染色 5min后 ,PBS 洗 3
次 ,以除去剩余染料 ,然后用含1%SDS(w v)的50%
(v v)甲醇于 50 ℃下水浴 30min ,以抽提蓝色染料 ,
在600 nm下测定吸光值 。
1.2.5　酚类积累的测定　取2 mL培养基滤液 ,加入
10mL乙酸乙酯 ,超声振荡后静止萃取 2 h ,取 5mL 乙
酸乙酯组分自然风干后 ,残留物溶于 3 mL 75%乙
醇中 ,在 280 nm下测量其吸光度 ,以 3mL 75%乙醇
为对照 ,以水杨酸为标准 ,以 1μg 水杨酸在 280 nm
处的吸光度代表一个单位的酚积累[ 10] 。
1.2.6　生化指标综合评价　采用模糊隶属法用多
项指标对激素配比组合进行综合评价:其中:U =
{U1 , U2 ……Un}为评价因素集 , R ij(i=1 ,2……m;
j=1 ,2……n)为评价值 , i 为处理 , j 代表各生物学
性状 。将各测得到的数据按公式 R ij =(R ij -R jmin)
(R jmax -R jmin)处理 , R jmin —指 J 性状中最小值;
R jmax —指 J 性状中最大值 ,得到评判模糊矩阵 R 。
按照各性状的重要性确立各因素的权重 ,得权重分
配集 A ,使权重满足归一化要求 ∑n
i=1Wi=1 ,通过矩阵
运算 B= R·AT 。
1.3　统计学处理　所有数据均以 x ±s表示 ,应用
SAS统计学软件进行方差分析 ,采用 t 检验进行显
著性检验 ,以 P<0.05为差异有统计学意义。
2　结　果
2.1　地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养　见图
1 。由图1可见 。MSK-2培养基第15d就可见在地
　　　　　　图 1　用不同培养基诱导的地钱愈伤组织和悬浮细胞照片
A:用 MSK-2 培养基诱导(第20 d);B:用MS(2 mg L)培养基诱导(第 20 d);C:第 15 d 时地钱
悬浮细胞(×2 000)
Fig.1　Graphs of callus tissues and suspension culture cells of Marchantia polymorpha L.
A:callus tissues induced by gametophyte grew on the MSK-2 medium at day 20;B:callus tissue in-
duced by gametophyte grew on the MS(2 mg L)medium at day 20;C:micrograph taken by light mi-
croscopy at day 15(×2 000)
　434　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 46 卷 4期　
钱配子体周围已有深绿色愈伤组织产生 ,愈伤组织
呈凝聚状 ,不断增多 ,并向培养基四周扩展及培养基
内渗入 ,配子体不断缩小而愈伤组织愈来愈多 。同
样 ,培养在MS(2mg L 6-BA)中的地钱配子体周围也
产生浅绿色的愈伤组织 ,只是其配子体缩小缓慢 ,愈
伤细胞生物量没有MSK-2培养基多。而在MS 培养
基的配子体第 20 d仍未见愈伤组织的产生 。
2.2　光强对地钱愈伤组织生长的影响　见表 1。
由表 1可见 ,在光照3 000 、5 000和8 000 lux条件下 ,
地钱愈伤细胞生物量显著高于未光照条件下地钱愈
伤细胞生物量(n =3 , P<0.05)。但是随着光强的
升高 ,愈伤组织细胞生物量在光强 8 000 lux 下的生
物量低于光强 5 000 lux条件下细胞生物量。
表 1　光强对地钱愈伤组织生长和叶绿素含量的影响
光照强度
(lux)
生化指标
生物量(mg , DW) 叶绿素含量(mg g , FW)
8 000 219.50 3.93
5 000 260.70 3.83
3 000 126.94 3.23
0 67.10 0.51
2.3　不同培养基对地钱悬浮细胞生长和叶绿素含
量的影响　见表 2。由表 2可见 ,KNOP 培养基细胞
生物量最高 ,其次是 MSK-2 ,次之是 MS 培养基 ,而
Miller等培养基的细胞生物量则要显著低于上述 3种
培养基(n=3 , P<0.05)。其中稀释培养基1 2MSK-2
和1 2MS 培养基的细胞生物量则分别低于MSK-2和
MS培养基(n =3 , P <0.01)。
表 2　不同培养基对地钱悬浮细胞生长和叶绿素含量的影响
培养基 生化指标生物量(mg , DW) 叶绿素含量(mg g , FW)
KNOP 165.10 0.13
MSK-2 135.20 3.93
MS 112.08 1.33
Miller 95.50 0.51
B5 81.30 3.85
1 2MSK-2 78.40 3.31
White 56.10 4.77
1 2MS 41.00 3.24
MSK-2培养基生物量高于除 KNOP 外的其他培
养基 ,其叶绿素含量 3.93 g L 高于 KNOP 、Miller 和
MS等培养基(n =3 , P <0.05)。另外 ,MSK-2培养
基诱导愈伤组织的效果比 MS(2 mg L 6-BA)培养基
要好(图 1),因此本研究在MSK-2培养基基础上 ,对
其激素 2 ,4-D 、NAA和 6-BA进行不同比例组合优化 ,
以求建立对细胞生长和次生代谢生产都较为有利的
培养条件 。
2.4　不同激素组合对地钱细胞生长及次生代谢的
影响　见表 3。由表3可见 ,表中序号 1和3细胞生
物量高于序号 10 [MSK-2(n=3 , P <0.05)] ,序号
6 、7 、8和 9要低于序号 10(n=3 , P<0.05),而序号
2 、4和 5细胞生物量与序号 10没有区别。同样 ,对
于叶绿素含量来说 ,序号 1和 4叶绿素含量极显著
高于序号10(n=3 , P<0.01),序号 2 、3 、5 、6和8叶
绿素含量则显著高于序号 10(n =3 , P <0.05),剩
下的序号 7和 9叶绿素含量则要低于序号 10(n =
3 , P <0.05)。
表3　不同激素组合对地钱细胞生长及次生代谢的影响
序号
激素组合(mg L)
2 , 4-D NAA 6BA
生化指标
生物量
(mg , DW) pH
叶绿素含量
(mg L)
细胞膜透性
(OD g , FW)
多酚含量
(U mL)
1 0.5 0.5 0.5 115.50 7.22 3.41 0.92 21.30
2 0.5 1.0 1.0 96.75 6.15 1.26 1.00 29.68
3 0.5 2.0 2.0 106.65 7.35 1.69 0.68 34.96
4 1.0 0.5 1.0 93.40 7.08 3.51 1.02 27.86
5 1.0 1.0 0.5 91.90 7.50 1.31 0.97 33.32
6 1.0 2.0 2.0 64.50 6.67 0.96 0.58 36.60
7 2.0 0.5 2.0 78.90 6.20 0.45 1.15 25.67
8 2.0 1.0 0.5 83.85 6.37 1.18 2.08 28.40
9 2.0 2.0 1.0 76.60 6.12 0.48 1.10 32.23
10 1.0 0 0 96.87 6.03 0.73 0.42 22.39
　　对次生代谢多酚含量来说 ,序号 2 、3 、4 、5 、6 、8
和9多酚含量要高于序号 10(n=3 , P <0.05),而序
号1和 7多酚含量与序号 10差异不明显。
2.5　各评价因素权重　按照各性状的重要性确立
各因素的权重 ,权重分配集 A=(0.75 , 0.02 , 0.05 ,
0.03 ,0.2)T 。
2.6　评价单元各评价因素的隶属度与综合评价指
数　见表 4。由表 4可见 ,序号 3综合系数最大为
尹德明 ,等.地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立 435　 　
0.841 3 ,其次是序号1 ,其综合系数为0.823 6 。最小 的是序号 6 ,其综合系数为 0.219 9。
表 4　各评价因素的隶属度与综合评价指数
序号 各评价因素的隶属度生物量 pH 叶绿素 膜通透性 多酚 综合评价指数
1 1.000 0 0.809 5 0.967 3 0.301 2 0.000 0 0.823 6
2 0.632 4 0.081 6 0.264 7 0.349 4 0.547 7 0.609 2
3 0.826 5 0.898 0 0.405 2 0.156 6 0.892 8 0.841 3
4 0.566 7 0.714 3 1.000 0 0.361 4 0.428 8 0.585 9
5 0.537 3 1.000 0 0.281 0 0.331 3 0.785 6 0.604 1
6 0.000 0 0.435 4 0.166 7 0.096 4 1.000 0 0.219 9
7 0.282 4 0.115 6 0.000 0 0.439 8 0.285 6 0.284 4
8 0.379 4 0.231 3 0.238 6 1.000 0 0.464 1 0.423 9
9 0.237 3 0.061 2 0.009 8 0.409 6 0.714 4 0.334 8
10 0.634 6 0.000 0 0.091 5 0.000 0 0.071 2 0.494 9
3　讨　论
本试验结果表明 ,地钱配子体在第 15 d就诱导
愈伤组织 ,步聚简单 ,一步即可完成 ,减少了污染机
会 ,优于文献报道的方法[ 11] 。本试验结果可为其他
苔类及苔藓植物细胞培养提供理论依据 。
光是调控植物生长发育的一个有效影响因子 ,
高光强有利于配子体启动并促进其诱导愈伤组织 。
本试验结果表明 ,地钱愈伤组织细胞受到光照后 ,有
利于增加叶绿素含量和光合效率 ,促进了细胞物质
的吸收和代谢活动 ,有利于细胞增埴 ,细胞呈鲜绿
色 ,并很快长满培养基质 ,第 20 d后培养基上已长
满一厚层的愈伤组织 。但是光强过强容易造成细胞
光过氧化和破坏细胞叶绿体结构而降低光合效率 ,
不利于细胞增殖 。虽然细胞在无光源照射条件仍能
生长 ,但是细胞细疏 ,颜色淡黄 ,其生物量显著低于
光照培养(n=3 , P <0.01),并且叶绿素含量也低
于有光照条件(n=3 , P <0.01)。
虽然 KNOP 培养基生物量是最高的 ,但其叶绿
素含量 0.13 mg L 显著低于 MSK-2培养基的 3.93
mg L 和MS培养基的 1.33 mg L ,而且 KNOP 培养基
细胞在第 20 d呈灰色 ,表明此时细胞进行光合作用
作用较差 ,因此不适宜对地钱愈伤细胞进行培养 。
稀释一倍的 1 2MS 和 1 2MSK-2 的生物量也不如
MSK-2和MS的好 ,故也不利于悬浮细胞增殖培养 。
MSK-2培养基生物量仅低于 KNOP 培养基 ,而
其叶绿素含量显著高于 KNOP 、Miller 和MS 等培养
基(n=3 , P<0.05)。MSK-2 培养基诱导愈伤组织
的效果优于 MS(2mg L 6-BA)培养基 ,因此本研究选
择使用MSK-2培养基对地钱细胞进行悬浮培养。
因MSK-2培养基只含有 2 ,4-D一种植物激素 ,
比较单一[ 12-13] 。植物生长激素是最有效地调控细胞
生长的化学物质 ,若按一定比例组合可以达到增效
作用 ,从而更好地调控植物细胞的生长 ,因此本研究
对主要激素配比进行了优化处理。结果表明 ,激素
配比组合序号 1和 3对细胞的生长最为有利 ,但它
们细胞的其它生物学性状在各自同一生化指标中并
不是最好 ,说明仅从生物量来选择培养基不是很准
确。因此 ,本研究在建立不同激素配比组合为主的
细胞培养体系时 ,既考虑生物量的同时也兼顾与生
物量和次生代谢相关的一些事件(pH 、叶绿素含量 、
膜通透性和多酚),并运用模糊数学的方法对这些生
化指标进行综合评判。模糊综合评价分析法不仅考
虑生物量 ,同时还考虑与细胞生长和次生代谢相关
的多个性状指标 ,较为全面地综合分析和评价各激
素比例组合 ,具有可靠性和客观性 。
本试验评价要素主要包括生物量以及与生物量
和次生代谢有关的生物学性状:如叶绿素 、膜通透
性 、pH和多酚 。将各项指标的隶属函数的数值之和
视为激素配比组合综合评价值 ,评价值大 ,配比组合
效应好 ,反之评价值小 ,综合配比组合差。序号 3的
综合系数最大 ,其生物量与序号 1没有显著差异 ,其
次生代谢显著高于对照序号 10 ,其叶绿素含量和膜
通透性适中 ,有利于以后对细胞进行操作。因此确
定 ,适合于地钱细胞生长和次生代谢的培养基激素
配比组合是0.5mg L 2 ,4-D+2mg L NAA+2mg L 6-
BA ,这为其他苔藓植物细胞规模化培养提供了理论
依据和指导。
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(编辑:孙玉芝)
(上接第 432页)　简化了手术过程 ,手术技术要求
低 ,缩短了操作时间 ,使翻修手术简单易行;②无需
取出髓腔中用骨水泥固定的假体柄 ,克服了传统翻
修术中骨水泥及假体取出过程多种弊端如骨折 、截
骨不愈合等;③手术不用显露假体在股干的髓内部
分 ,切口短 ,患者创伤小 ,恢复快 ,能早期进行功能锻
炼 ,肢体功能恢复好;④减少了假体翻修术的感染等
并发症的发生率;⑤假体的费用较传统翻修假体低 ,
术式安全 ,使患者的医疗费用下降 。
综上所述 ,定制肿瘤人工髋关节假体需要在应
力集中部位 ,在假体的尺寸 、外形 、材料等方面得到
加强 ,套接式翻修假体在其适用范围内有较高的应
用价值 ,近期效果良好 ,但需进一步随访 。
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