全 文 ：植物生理学报 19 89 , 15 ( 2 ) : 20 5一2 0 9
通以礴 尸妙 t oP hy s’o log t’c a 夕细z’ca
20 5
研究简报
:地钱 、 肾蔽和中山柏中的 NADP硫氧还蛋白系统
曹 日强 周志明
,
(南京大学生物学系 , 南京 2 10 0 0 8 )
关键词 : 肾蔽 , 地钱 , 中山柏 , 硫氧 还 蛋 白 ,
N A D P一硫氧还蛋白还原酶
硫氧还蛋白 (T d) 是一类低分子量酸
性蛋白 ,具有二硫键 。 s一 s一 ) , 通过氧化还
原互变来参与很多反应 (周志民等 1 9 8 6) 。
T d可被 N A D P 一硫氧还蛋白还原酶 (N T R )
还原 :
~
, 、 , 二
~ ~
, , _ _
,
N T R _
.
T do
二
+ N A D P H
·
H + 一二三二止 , T d rde
作用进化提供线索 。 本文还对光 /暗 培养
的中山柏细胞的 N T R活性进行了比较 ,初
步探讨了光在该系统中的作用 。
斗N A D P +
N A D P
,
N T R
,
T d 组成 N A D P / T d
系统 , 已证实存在于厌氧细菌 、 真菌 、 动
物细胞 (H o lm g r e n 198 5 ) 、 庆氧光合细菌
( J o h n s o n 等 1 9 5斗, C l e m e n t一 M e t r a l 等
1 0 5 6 )
、 小麦种子、 大豆 (B r e s t e r m a n n 等
1 9 5 3 , S u s k
e等 1 0 7 0 ) 、 蓝细菌 (G l e a s o n
之98 6 ) , 小球藻 (T s a n g 198 1) 、 胡萝 卜愈
伤组织仃o h n s o n 等 1 0 5 7 )中。 苔鲜植物 、
藏类植物以及裸子植物中 T d和 N T R 的研
究未见报道 。 本文以族类植物肾旅的叶片 ,
苔鲜植物地钱和裸子植物中山柏的培养细
袍为代表 , 检测其N A D P / T d 系统的存在 ,
以 期 证 明 该系统在植物界以至所有生活
一细胞中的普通存在 , 并能对该系统在植物
发育中的功能有更全面了解 , 为研讨光合
1 98 8年 4月 18 日收到 。
国家教委博士点基金资助项目 。
缩写 N T R : N A D -P t h i o er d g x in r e d u e t a s e , N A D -P
硫氧还蛋白还原酶 ; N A D -P M D H ; N A D P 一de 伴 n de nt
m a la t e de h y d
r o
ge n
a s e ,
N A D P
. 苹果酸脱氢酶 ;
D T N B
: 5
,
5
, ·
D i ht io b i s ( 2
一n i t r ob
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nz o ic ac id )
,
5
,
5
, -
二硫双 ( 2一硝基苯甲酸 ) 。
材 料 与 方 法
细胞的培养 中山柏 (Q 巾esr 澎 5 1崛勿n caf vc ·
hz on gs ha n) 和地钱 , 介 hcr an iat OP如口巾ha ) 愈伤
组织采用 M S (M u ar hs i ge 和 Sok哈 19 52 ) 培养
基 , 每升附加 2 , 4一 D 1 m g , K T 0 . 5 m乳 蔗糖
30 9
, 琼脂 0 . 7 % , PH 6 . 5 。 光照培养每天照光
10 h
, 光强 30 00 l x 。 培养温度均为 25 OC 。
靶酶玉米 N A D 一 萃果酸脱氢酶的初步纯化 参
照 Jac qu ot 等 ( 1 9 8 1) 的方法 。 玉米叶片去中脉 ,
用蒸馏水洗净 , 剪成碎片 , 放入液氮中 。 取出叶
片 , 研磨成粉状 , 加入匀浆液 (50 m m ol / L T isr -
H C I
,
l % P V P
,
3 m m o l / L M g C I
: , 0
.
1 % 筑基
乙醇 , p H 7 . 9) 匀浆 2 m in , 4 层纱布过滤。 滤液
用 6 m ol / L 甲酸滴至 PH 牛. 6 , 过夜。 离心 10 0 0
r
/ m i n
,
2 0 m in
, 上清液用硫酸钱 3 0% ~ 90 % 饱和
度分级沉淀 ,溶解沉淀 ,透析 (透析液 : 30 m m ol /L
T r i s~ H C I
,
0
.
1% 疏基乙醇 , p H 7 . 9 ) 。 离心
10 00 0 r / m i n
,
20 m i n, 上清液上 D E A E一纤维素
(D E
一
52 )柱 (2 . 6 x 15 . 5 mC ) , 用 0 ~ 5 00m
o l / L
N a 0 l( 平衡缓冲液同透析液 )梯度洗脱 , 收 集 活
性部分 , 蔗糖浓缩 。 浓缩液透 析后 , se ph ad ex
G 一 75 柱 (2 . 6 x 90 . o c m )层析 , 佚脱浓同透析液 ,
收集活性部分 , 蔗糖浓缩 , 透析。
菠莱 T d 的初步纯化 参照 C ar w fo dr 等 ( 1 98 6) 的
方法。 菠菜叶片去叶柄 ,洗净 ,剪成碎片 ,匀浆 (同
上 )2 m in , 过滤 。 滤液用 6 m ol / L 甲酸滴至 p H
杏. 6 , 过夜。 离心 10 0 0 r /而 n , 20 m i n , 上清液
用硫酸铁60 %饱和度分级沉淀 , 离 心 , 透 析 。
D E A E 一纤维素柱层析 (同上 ) , 收集活性部分 ,
7 o5 C水浴保温 3 im n , 骤冷 , 离心去除沉淀 。
N A D P / T d 系统的检洲 样品在缓冲液 (5 0 ~ of
2 06 植 物 生 理 学 报 15卷
结果见图 l ~ 3A 。
ǎ工`口毛ǎ1.层曰
:二
P r o t e in
`
下 d , N T R 睿、宜
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2O
F r a e t i o n
如
n u m b e r
卜.,L0 O.
图 1 肾孩叶中T d 和N T R 的D E A E es纤维素 (D E ~
5 2 )柱层析图
F i乡 1 E lut 呈o o p r o f j e of T d a o d N T R 纽 N动h ,-o
,eP
z’s co , J如 tI’a le ~ 5 fr o m a D E A E . c e U曰 05 .
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20
F r a c t i o n
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n u m b e r
图 2 光照培养的地线细胞 中 T d 和 N T 双 的
D E A E 一纤维案 (O E一2) 柱层析图
F七 . 2 lE u it 0 0 p r o曰 e of T d a n d N T R 纽 U g卜t
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D E A E
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·
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.
9 )
,
l % p v p
,
3 m m o l / L
M g C I
: , 0
.
1% 疏基 乙醇 , 1 m m o l / L E D T A ) 中
匀浆 2 m in , 过滤 , 滤液用 6 mo l/ L 甲酸滴至
p H 4
.
6
, 过夜 。离心去除沉淀 , 上清液用 N H召O H
滴至 p H 7 . 9 , 上 D EA E 一纤维素 (D E 一 5 2 ) 柱 (2 . 6
x 1 5
.
5 c m )
, 先用 30 0 m l缓冲液 (同上 )洗脱 ,再
用含5 00 ~ ol / L N
a C I的缓冲液洗脱 , 测定 T d
和 N T R的活性。
T d活性测定 参照 J o h sn o n等 ( 19 84) 的方法 。 激
活体系 : 20拜1 0 . 2 m o l / L T r is 一H C I (p H 8 . 0 )
缓冲液 , 30 解 1 20 0 m m o l / L D T T , 20拜 I N A D P -
M D H粗酶 , 4 0 拜 l样品 , 90 邵 1 H 2 0 。 3 0 0 0 激活
30 m i n
。 反应体系: 0 . 1 lnI 1 m o l / L T ir s书 C ’
(p H 7
.
9 )缓冲液 , 0 . 0 3 m l 6 un
o l / L N A D p H
,
激活液 0 . 15 m l , 0 . 7 1 m l H a O , 最后加入 0 . 0 1
m l 50 m m ol / L O A A
。 随即开始记录每分钟
A o 4。的变化 。
N T R的活性测定 参照 J o h sn o n 等 ( 19 5 4 ) 的方
法。 0 . 2 m l 0 . 5 m o l / L的磷酸缓冲液 ( p H 7 . 9 ) ,
50 m m o l / L E D T A
,
0
.
0 3 m l 6 rn m o l / L
N A D PH, 0
.
2 m l 1 m m o l /L D T N B (4 m g
D T N B溶于 1 . 0 m l 9 5% 乙醇 ,然后加人 9 . 0 m l
0
.
5 m o l / L T r i-s H C I
,
p H 8
.
0缓冲液 ) , 0 . 0 5 回
菠菜 T d 粗品 , 0 . 1 m l样品 , .0 42 m l 风 O 。 测
定每分钟 人 1: 的变化 。
电镜观察 以光照和黑暗培养的中山 柏 细 胞 为
材料 。 2%戊二醛 (11/ 5 m ol / L磷酸缓冲液 p H 6 . 8
配制 )预固定4 h , 漂洗多次 , 1%饿酸固定 24 h ,
漂洗多次 。 30 拓 , 50 % , 70 % , 80 % 乙醇脱水各
2 0 而 n , 8 5 % , 9 5% , 20 0% 乙醇脱水各 30 m in 。
环氧丙烷处理2 0 而 n , 5 0%包埋剂 E p o n 8 12 (包
埋剂 : 环氧丙烷 = 1 : 1 )在 35 00处理 Z h , 然后用
6 7 % EP
o n 8 12 处理 12 h , 最后用 10 0% E P on
8 12 在 35 o C处理 12 h , 4 5O C保温 2 4 h , 60 Q C保温
24 h
。 超薄切片经醋酸铅和柠檬酸铅 双 重 染 色
后 , 用 uJ el 10 05 电镜观察。
屠
.0能石
卜
,陌ó、é一,e
了尹卜、、`司Q`,庄
`…国n结 果
肾旅 、 地钱和中山柏中N A D P / T d 系统的
检测
以 20 9肾旅叶片 , 50 9光照培养的地
钱细胞以及 75 9光照培养的中山柏细胞为
材料 , 分别测定它们的 T d和 N T R活性 ,
映0 0
F r a e t i o n
图 3 光照 (A )和黑暗 (B ) 培养的中山柏细胞中
T d和 N T R 的D E A E 一纤维素 (D E一2) 柱层析图
F王9 .
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3 lE ut io
o p r o曰 se of T d o d N T R 纽 1呈g h t (朴
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c o l u r n 。
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o . 几
C h “ i at 称介口 c 、 Z h o n g b s明 、
a D E A] 压 e e l 公o s e (D E . 5 2 ) ,
2期 地钱、 肾蔗和中山柏中的 NA D P /硫氧还蛋白系统
、 光照培养的地线和中山柏细胞分别有
两个 T d活性峰 , 表明有两种 T d , 都能增
加靶酶玉米N A D P 一 M D H的活性 , 而肾截
叶片只检测到一个 T d 活性峰 , 说明不 同
的植物之间 T d 存在着差异 。 地线 、 肾旅
和中山柏在植物系统发育中处于不 同的地
位 , 其中所存在的 T d 可能不同 , 即氨基
酸序列不同 。 植物细胞虽然具备全能性 ,
但培养的植物细胞与植物原材料的代谢不
一定完全相同 , 其中 T d 也可能不同 。 而
且肾蔽叶片是全自养型 , 地钱和中山柏光
照培养细胞虽然叶绿体片层结构 发 育 完
全 , 但培养基中还存在着碳源 , 不是完全
自养 , 其 T d 也可能不同 。
三种材料都具有 N T R 活性峰 , 活性
与图 3B相比都较低 , 肾旅 N T R 的洗脱体
积较另两个大一些 , 表明其分子上所带电
荷量不同 , 分子结构上存在着差异。
光 /暗培养的中山柏细胞中N T R活性的比
较
黑暗培养的中山柏细胞没有叶绿体 ,
只有质体 , 不能进行光合作用 ; 光照培养
的 中山柏细胞叶绿体 已经形成 ( 电镜照片
略 ) 。
为使蛋白上柱量与光照培养的相同 ,
取 10 0 9 黑暗培养中山柏细胞为材料 。 层
析结果表明 , 光照和黑暗培养的中山柏细
胞都具有两个 T d 活性峰 , ’ 它们的洗脱体
积很相近 , 活性大小也相似 。 但两者N T R
的活性却存在着明显差异 , 光培养活性 :
暗培养活性一 1 : 8多 而两者的洗脱体积接
近 , 因此可能具有相同的分子结构 (图 3) 。
这与C a 。 等 ( 1 98 4) 已报道的胡萝 卜细胞的
结果类似 , 即光 、 暗培养细胞 N T R 的活
性比为 1 : 6 , 差异也同样显著 。 因此 ,可以
肯定地说 , N A D P理 d 系统在黑暗培养的
细胞中占有优势 , 对 T d 的还原起着主导
作用 。 而光照培养的细胞中由于叶绿体的
形成 , 还具有另一个 T d 还原系统铁氧还
蛋白 /硫氧还蛋白系统 。
讨 论
N A D P汀 d 系统最先在 E . co il 中发
现 , 然后又在真菌、 哺乳动物中发现 。 最
初 , 在植物细胞中没有发现该系统 , 只发
现铁氧还 蛋 白 /硫氧还蛋白系统 , 因此 ,
认为N A D P / T d 系统存在于异养细胞中 。
小球藻及光 /暗培养的胡萝 卜细胞中该 系
统的发现 ,使人们对这一假说提出了疑间 。
本文所取的三种材料分别为苔鲜 、 麟
类和裸子植物的叶片或光照培养的绿色细;
胞 , N A D P T/ d 系统的存在为该系统在植
物界的普遍存在提供了证据 。 最近 , 菠菜
叶片中 N T R 已得到纯化 (B u e h a n a n 私人
通信 ) 。 这一切表明 , 该系统在植物从低等
到高等的系统发育过程中是普遍存在的 。
我们认为 , N A D P / T d 系统参与了原核和
真核细胞最基本的生物化学反应 , 例如 ,
为核糖核酸还原成脱氧核糖核酸提供氢 ,
还原蛋白质的二硫键等等 。 因此 , 在生物从
原核到真核的进化过程中被保留下来了 。 .
由于光诱导形成叶绿体 , 产生能够进
行光合作用的自养细胞 , 同时也产生了另
一个T d系统铁氧还蛋白 / T d系统 。 在这个
系统中 , 光 /暗调节着 T d 的氧化还原 , 从
而调节细胞内物质的合成和分解等一系列
重要的生物化学反应 , 使整个细胞与外界
环境协调 。
N T R 活性在光 /暗培养条件 下 的 差
异 , 可能是由于两种不同的生理环境造成
酶活性的差异 , 即照光时生长速度比较慢 ,
生物合成的速度相应较慢 , 体 现 为 酶 的
活性较低 ; 另一方面 , 光照培养的细胞申
叶绿体的形成造成另一个 T d 系统的形成 ,
从而削弱 了N A D P尸 d 系统的作用 。 光是
20 8 植 物 生 理 学 报 1 5卷
一否造成光 /暗培养条件下 N T R 活性 的 差
异 , 以及 N A D PT/ d 系统和铁氧还蛋 白 /
.
T d系统之间有没有制约作用 , 目前还均不
清楚 。
绿色植物中N T R的性质 , N A D P理d
系统在植物细胞中的作用都有待于进一步
探讨 。
人
~
致谢 : 地钱和中山柏愈伤组织分别由上海植物生
理所李文安和江苏植物所陈为民同志赠予 。 并承
上海植生所施教耐教授 、 李斌同志的热心帮助 。
参 考 文 献
周志民 、 曹日强 。 铁氧还蛋白一硫氧还蛋白系统 。
植物生理学通讯 1 9 8 6( 3) : 1一 5
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