全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 6期，第 1214-1222页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.6, 1214-1222
研究论文
Research Article
新疆野扁桃 CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析
余曦瑶 李疆 * 姚正培 任艳萍 罗淑萍 * 张亮 王敏
新疆农业大学,乌鲁木齐, 830052
*通讯作者, lijiangxj@163.com; luoshuping2008@163.com
摘 要 CBF基因主要功能是调控下游大量抗冷基因的表达。CBF基因是植物抗冷途径的枢纽，对增强植
物的抗冷能力极为重要。本研究利用染色体步移法得到了新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche) CBF
基因家族成员 AlsCBF翻译起始位点上游的启动子序列，长度为 1 391 bp (GenBank登录号: KP662710)。对
启动子序列进行生物信息学分析表明，该序列存在启动子的基本元件 CAAT-box和 TATA-box，并且含有
多个与植物非生物胁迫有关的响应元件：ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和 LTRE低温
应答元件等。在烟草叶片中进行瞬时表达的结果表明，该启动子序列具备在逆境胁迫下诱导驱动报告 GUS
基因表达的功能。本研究可为揭示 CBF基因在野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理，以及为增
强野扁桃 CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改良中的作用奠定一定的基础，同时对野扁桃的繁育和保护也有
极为重要的意义。
关键词 野扁桃, CBF基因,启动子,染色体步移
Cloning and Transient Expressing the Promoter of AlsCBF Gene Amygdalus
ledebouriana Schleche in Xinjiang
Yu Xiyao Li Jiang * Yao Zhengpei Ren Yanping Luo Shuping * Zhang Liang Wang Min
College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi, 830052
* Corresponding authors, lijiangxj@163.com; luoshuping2008@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.001214
Abstract CBF gene is very important to increasing plant freezing tolerance by regulating various down-stream
cold-induced genes expression. CBF gene plays a central role in CBF cold-response pathway in plant. Obtained
CBF gene family members AlsCBF promoter sequence length of 1 391 bp from the genomic DNA of Amygdalus
ledebouriana Schleche by genome walking technique, which had been deposited in GenBank with accession
KP662710. Bioinformatics analysis revealed that the sequence contained basic cis-elements, such as TATA-box
and CAAT-box and many elements involved in the plant abiotic stress. The results for transient expression in
tobacco leaves showed that the promoter sequence with driving under the stress-induced expression of GUS gene
function. This study reveals the mechanism of CBF genes opposition almond cold resistance, drought resistance,
such as resilience in the process, as well as to lay a foundation for the enhancement AlsCBF resistance genes in
the genetic improvement of almond, while Amygdalus Ledebouriana Schleche breeding and protection is also of
great importance.
Keywords Amygdalus Ledebouriana Schleche, CBF gene, Promoter, Genome walking
收稿日期：2015-02-09 接受日期：2015-03-12 网络出版日期：2015-05-01
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/3028
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31260186; 31360473)、新疆自治区十二五重大科技专项(201130102-1)和新疆自治区果树
学重点学科基金共同资助
野扁桃 (Amygdalus Ledebouriana Schleche)也称
矮扁桃或野巴旦杏，属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属
植物。它原产于欧洲东南、亚洲中西部，在欧洲已无
现存分布，多呈化石，在中国也残存不多，是珍贵的
图 1 AlsCBF基因启动子克隆
注 : A,B: 启动子的 2 次巢式 PCR 扩增 ; M: DL2000 DNA
marker; 1:第 1次 PCR产物电泳检测; 2:第 2次 PCR产物电
泳检测; 3:第 3次 PCR产物电泳检测
Figure 1 Cloning of AlsCBF promoter
Note: A,B: The two nested PCR amplification of the promoter re-
spectively; M: DL2000 DNA marker; 1: Electrophoresis of the
first-round PCR product; 2: Electrophoresis of the second-round
PCR product; 3: Electrophoresis of the third-round PCR product
图 2野扁桃 AlsCBFpro启动子的 PCR扩增
注: M: DL2000 DNA marker; 1: AlsCBFpro; 2:阴性对照
Figure 2 Amplification of AlsCBFpro promoter
Note: M: DL2000 DNA marker; 1: AlsCBFpro; 2: Blank
第三纪孑遗植物种类。低温会使植物细胞内自由水
减少，从而间接对植物造成高渗透压、机械损伤和干
旱等逆境伤害(Chinnusamy et al., 2007)。CBF (C-re-
peat binding transcription factor/dehydrate responsive
element binding factor, DREB)基因的主要功能是调控
大量抗冷基因的表达，作为植物 CBF抗冷途径的枢
纽，该基因对加强植物抵抗低温的能力极为重要(吕
胜男等, 2011)。CBF基因作为植物冷驯化信号转导途
径中至关重要的基因之一，在低温、干旱等逆境诱导
下 CBF基因能够表达，因此认为该启动子有可能具
有非生物逆境的诱导型启动子的功能，而逆境诱导
型启动子在植物基因工程中起重要作用。在与逆境
相关的基因启动子序列中，存在许多与逆境诱导相关
且能够参与基因转录调控过程的顺式作用元件(刘群,
2009)。其中研究比较多的有：低温响应元件(Yam-
aguchi and Shinozaki, 2005)、茉莉酸类物质应答元件
(Vom et al., 2007)、脱落酸响应元件(Uno et al., 2000)
和干旱应答元件(Yamaguchi and Shinozaki, 1994)等。
本研究基于本实验室对野扁桃抗寒基因 AlsCBF
的研究，拟采用染色体步移法克隆新疆野扁桃 CBF
基因启动子，并验证其功能，可为揭示 CBF基因在
野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理，以
及为增强野扁桃 CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改
良中的作用奠定一定的基础，同时对野扁桃的繁育
和保护也有极为重要的意义。
1结果与分析
1.1 AlsCBF基因启动子克隆
以野扁桃基因组 DNA为模板，通过染色体步移
法扩增 AlsCBF启动子序列，并进行 2次 PCR扩增
(图 1)。图 1A中为以 AP3为正向引物时，第三轮巢
式 PCR 扩增中成功扩增出 AlsCBF 基因启动子序
列，长度约为 900 bp，产物(箭头所示片段)链接至 T
载体后，进行菌液 PCR检测挑选阳性克隆测序。将
获得的序列与已知野扁桃的 CBF基因的序列比对
两者间有 71 bp的重复序列，对长度为 894 bp的序
列进一步分析，表明该序列即为 AlsCBF基因的启动
子序列。根据已经获得的序列再次设计下游巢式引
物进行染色体步移，图 1B中为以 AP1为正向引物
时第三轮巢式 PCR扩增出成功扩增出启动子序列，
长度约为 350 bp，产物(箭头所示片段)链接至 T载体
后，进行菌液 PCR检测随机挑选阳性克隆测序。将获
得序列与第一次步移获得的序列比对两者间有 78 bp
的重复序列，将已获得的序列拼接后获得长度为
1 391 bp的序列，对其进一步分析，表明该序列即为
AlsCBF基因的启动子序列(登录号为 KP662710)。根
据已获得的序列设计上游引物 YZF，并采用下游引物
AC-SP1，以野扁桃基因组 DNA为模版扩增启动子
序列(图 2)，回收扩增产物，测序结果 1 391 bp与两次
步移后拼接所获得的序列重合部分比对完全一致。
1.2 AlsCBF基因启动子序列分析
将染色体步移后获得的 AlsCBFpro启动子序列
运用 PLANTCARE软件进行序列的分析，结果显示
AlsCBFpro启动子序列中含有很多转录因子结合位
点，这说明 AlsCBFpro启动子的调控特性较为复杂。
在 AlsCBFpro启动子的上游序列中含有 CAAT-box，
该作用元件在启动子、增强子区域中常见的作用元
件，控制转录起始的频率，并以此来增强转录，该作
用元件的转录激活作用的特点是双向性，且作用距
新疆野扁桃 CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析
Cloning and Transient Expressing the Promoter of AlsCBF Gene Amygdalus ledebouriana Schleche in Xinjiang 1215
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 3野扁桃 CBF基因启动子 AlsCBFpro的序列分析
Figure 3 CBF gene promoter AlsCBFpro nucleotide sequence analysis
离不定。AlsCBFpro 启动子具有多个 TATA-box 元
件，作为结合 RNA聚合酶Ⅱ的位点该元件能够保证
精确的转录起始，并且可对上游激活蛋白进行调控。
对 AlsCBFpro 启动子序列的顺式作用元件运用
PLACE软件进行分析，结果表明该序列包含若干与
植物的非生物胁迫有关的响应元件，如：ABA响应
元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和 LTRE低
温应答元件等(图 3;表 1)。
1.3植物表达载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro构建
植物双元表达载体 pCAMBIA1304 包含有
CaMV35S-GUS的融合系统，将已获得到的启动子序
列替换植物表达载体 pCAMBIA1304 中 CaMV35S
启动子，构建表达载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro，
采用 SalⅠ和 NcoⅠ内切酶对重组质粒进行双酶切鉴
定。结果显示酶切后获得了 1 391 bp大小的预期目
的片段(图 4)，将双酶切正确的载体送样上海生工经
测序鉴定与启动子序列完全一致，表明 AlsCBFpro，
启动子片段已经正确插入至 pCAMBIA1304 载体
中，表达载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro构建完成。
1.4瞬时表达技术检测启动子在逆境胁迫下的活性
重组载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro 转入农杆
菌之后，进行瞬时表达分析，将 EHA105空菌株设置
为阴性对照，将含有 pCAMBIA1304载体的菌株设
置为阳性对照，已构建完成的含有野扁桃 AlsCBF启
动子的重组载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro。结果表
明，阴性对照在未胁迫处理及逆境处理后均未检测
1216
新疆野扁桃 CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析
Cloning and Transient Expressing the Promoter of AlsCBF Gene Amygdalus ledebouriana Schleche in Xinjiang
表 1启动子区的调控元件分析
Table 1 Cis-acting regulatory elements analysis of the promoter sequences
编号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
位点名称
Site name
TATA-BOX
CAAT-BOX
5UTRPy-rich stretch
ABRE
ACE
ARE
ATCT-motif
BoxⅠ
BoxⅡ
CGTCA-motif
G-Box
G-box
位置
Location
+193, -414, -439, +440, +452, +453,
+463, +520, +619, -622, -657, +682,
+717,-723,-730, +877,-888,-895,
-929, -974, +999, +1 000, -1 002,
-1 057,+1 144,+1 294,-1 296,-1 348,
+1 367
-197,-216,-323,-346, +373,-374,
-375,-409,-415,-456, +609, +610,
-775,-832,-833,-977,-978, +996,
-1037,-1038, +1 167, +1 168, +1 282,
+1 318, +1 319, +1359, +1 360
+521, +526, +524
-1 116, +1 119, +1 118
+305
+293,-641
+1133
-324,-636
-1 116, +1 117
-303,-318
+632, +1 118, +1116
+303, +1 116, +632, +1 118, -304,
-1 117,-1116
核心序列
Core sequence
TATA
CAATT/CAAT/CAAAT/CCAAT
TTTCTTCTCT
ACGTGGC
ACGTGGA
TGGTTT
AATCTAATCT
TTTCAAA
CCACGTGGC
CGTCA
CACGTT(G)/GCCACCTGGCA
CACGTT(G)
位点功能
Function of site
转录起始处是启动子核心元
件
Core promoter element around
-30 of transcription start
启动子,增强子区域普通顺式
作用元件
Common cis-acting element in
promoter and enhancer regions
提高转录水平顺式作用元件
Cis-acting element conferring
high transcription levels
脱落酸应答顺式调控元件
Cis-acting element involved in
the abscisic acid responsiveness
光应答元件
Cis-acting element involved in
light responsiveness
厌氧诱导的必须顺式调控元件
Cis-acting regulatory element
essential for the anaerobic in-
duction
部分光应答元件保守序列
Part of a conserved DNA mod-
ule involved in light respon-
siveness
光响应元件
Light responsive element
部分光应答元件
Part of a light responsive ele-
ment
茉莉酸甲酯响应顺式作用调
控元件
Cis-acting regulatory element
involved in the MeJA-respon-
siveness
光响应顺式作用调控元件
Cis-acting regulatory element
involved in light responsiveness
光响应顺式作用调控元件
Cis-acting regulatory element
involved in light responsiveness
1217
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
位点功能
Function of site
部分光应答元件
Part of a light responsive element
赤霉素应答元件
Gibberellin-responsive element
GT-1结合起关键作用与光应答有关元件
Light responsive element
热应答元件
Cis-acting element involved in heat stress responsiveness
部分光应答元件
Part of a light responsive element
与干旱相关的MYB结合位点
MYB binding site involved in drought-inducibility
光响应过程中MYB结合位点
MYB binding site involved in light responsiveness
醇溶蛋白代谢有关的顺式作用调控元件
Cis-acting regulatory element involved in zein metabolism
regulation
胚乳表达必须的顺式调控元件
Cis-acting regulatory element required for endosperm ex-
pression
光响应元件
Light responsive element
胁迫相关应答元件
Cis-acting element involved in defense and stress respon-
siveness
水杨酸响应顺式作用元件
Cis-acting element involved in salicylic acid responsive-
ness
部分光应答元件
Part of a light responsive element
茉莉酸甲酯响应顺式作用调控元件
Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-re-
sponsiveness
SEF4转录因子结合位点
SEF4 factor binding site
部分光应答元件
Part of a light responsive element
核心序列
Core sequence
AGAGAGT(TG)
AAACAGA
GGTTAA
AAAAAATTTC
GATAAGATT
TAACTG
AACCTAA
GCCACCTGGCA
GTCAT
GGGCGG/CC(G/A)CCC
ATTTTCTTCA
CCATCTTTTT
TCTCCCT
TGACG
GCATTTTTATCA
TCCACGTGGC
位置
Location
-477,-1 157
-1 181
+828
+623
-486, +549
-809
+1 053
+238
-239,-317,-302
+68,-764, +644, +1 073
-392, +697
-1 391
+1 306
+303, +318
+678
+1 116
位点名称
Site name
GAG-motif
GARE-motif
GT1-motif
HSE
I-box
MBS
MRE
O2-site
Skn-1-motif
Sp1
TC-rich repeats
TCA-element
TCCC-motif
TGACG-motif
Unnamed_6
boxⅡ
编号
No.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
续表 1
Continuing table 1
到 GUS基因的产物，阳性对照在未胁迫处理及逆境
处理后均可检测到 GUS基因的产物(图 5)。在对含重
组载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro 的 EHA105 农杆
菌注射后的未胁迫烟草叶片中可见无 / 极少量的
GUS 基因的表达，而进行 4℃，200 mmol/L NaCl，
20% PEG逆境胁迫处理后均可明显检测到 GUS基
因的表达，表明在 4℃，200 mmol/L NaCl，20% PEG
逆境胁迫条件下，该启动子均具有驱动下游报告基
因表达的能力，说明所克隆的启动子序列 AlsCBFpro
具有非生物胁迫诱导型启动子的功能。
2讨论
低温、干旱、高盐等逆境条件不仅仅限制了植物
的栽培范围并且每年导致生产上的重大损失，因此
1218
图 4表达载体 pCAMBIA1304-AlsCBFpro的 SalⅠ和 NcoⅠ双
酶切验证
注: M: Maker (D15000+2000); 1: 表达载体质粒 pCAMBIA1-
304-AlsCBFpro双酶切
Figure 4 The identification of pCAMBIA1304-AlsCBFpro by di-
gesting with SalⅠ and NcoⅠ
Note: M: Maker (D15000+2000); 1: pCAMBIA1304-AlsCBFpro
by digesting with SalⅠ and NcoⅠ
图 5 AlsCBFPro启动子的瞬时活性检测
Figure 5 Detection of transient expression of AlsCBFPro promoters
培育具有抗逆性的作物新品种在理论上及现实中都
具有较为深远的意义。CBF转录因子不仅能够调控
一组抗干旱、抗低温基因的表达，有效地提高植物抗
干旱、抗低温的能力。李宁(2012)克隆了 AlsCBF基因
序列，并利用实时荧光定量 PCR方法分析了野扁桃
AlsCBF 基因在低温胁迫处理下不同时间的表达差
异，说明野扁桃 CBF基因能对低温胁迫做出快速应
激反应，进一步说明 AlsCBF基因可能属于抗寒蛋白
基因。为获得野扁桃 AlsCBF基因启动子，本研究采用
TaKaRa GenomeWalking Kit试剂盒，其基本原理与
Liu和Whittier (1995)等提出的热不对称交错式 PCR
技术相同，此方法可以高效快捷地克隆未知启动子
序列，且有效地降低了非特异性产物的扩增，提高了
目标产物地浓度，对已知序列的旁侧未知启动子的克
隆研究具有重大意义。使用 TaKaRa GenomeWalking
Kit试剂盒中提供了可直接使用的简并引物，减少了
设计简并引物的难度，使启动子序列的获得得到了
一定的简化。
高盐、干旱、低温等非生物胁迫,这些胁迫会诱导
植物体内相关的抗逆基因的表达，在这些非生物逆
境胁迫下与之相关的转录因子会与基因上游启动子
中关键的顺式作用元件特异性结合，这会增强启动
子的活性，进而提高逆境中目的基因的表达量，这是
转录调节主要机制中的一种(聂丽娜等, 2008)。rd29A
是目前在抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型
启动子之一，李新玲等发现 rd29A启动子在干旱、低
温和 ABA等非生物胁迫下具有驱动目的基因表达
的功能(Kim et al., 2002;李新玲等, 2007)。有许多抗
逆基因能够同时被多种逆境诱导表达，原因在于在
这些抗逆基因的启动子序列中存在一些与基因转录
调控及逆境诱导相关的顺式作用元件。基因的表达
模式和水平取决于启动子的顺式作用元件。通过比对
后发现 AlsCBF 启动子不仅包含 TATA-box、CAAT-
box等启动子、增强子区域常见作用元件，同时含有
ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件、
新疆野扁桃 CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析
Cloning and Transient Expressing the Promoter of AlsCBF Gene Amygdalus ledebouriana Schleche in Xinjiang 1219
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
LTRE低温应答元件以及 ICEr2的保守结构域等。研
究发现与冷诱导有关的顺式作用元件有：CRT/DRE
元件(Kasuga et al., 1999; Narusaka et al., 2003)、ICEr1、
ICEr2 (Zarka, 2003)、ABRE 元件(Uno et al., 2000)、
G-box (Dolferus et al., 1994)、TCA-like element (Brown
et al., 2001)等。ICEr2的保守结构域在拟南芥 AtCBF2
启动子中被发现，该保守结构域在冷诱导中起决定
性作用(Zarka, 2003)。
对 AlsCBFPro瞬时表达烟草进行 4℃，200mmol/L
NaCl，20% PEG逆境胁迫处理后，烟草叶片中 GUS
表达量较未处理的叶片显著提高说明该启动子具有
在低温、高盐、干旱这类非生物胁迫下驱动报告基因
表达的能力。本研究在分析这些逆境胁迫下瞬时表
达差异的过程中，发现在逆境胁迫处理中采用完全
相同的胁迫处理方法和时间后，同种胁迫处理采样
的各个叶盘间的显色反应存在一定差异，这个现象
说明瞬时表达的 GUS活性染色分析仅能定性确定
启动子具有驱动报告基因表达的功能，即具有启动
子活性，但 GUS活性染色分析不能够精确反映启动
子在各种非生物逆境胁迫环境下驱动目标基因表达
的能力强弱，同时也不能准确显示在不同胁迫下启
动子驱动目标基因表达能力的强弱。本研究中的瞬
时表达检测为启动子在低温、高盐、干旱等逆境胁迫
条件下驱动目标基因表达差异的定性及进一步的稳
定表达、缺失分析奠定了一定的基础。
3材料与方法
3.1材料
供试样品野扁桃幼嫩叶片采自新疆裕民县巴尔
鲁克山野扁桃自然保护区。农杆菌浸染所用烟草为
本塞姆氏烟草(Nictiana benthamiana)无菌苗。大肠杆
菌感受态细胞 DH5ɑ、植物表达载体 pCAMBI-
A1304、根癌农杆菌菌株 EHA105均由本实验室保
存。TaKaRa Genome Walking Kit、Taq DNA聚合酶以
及克隆载体 pMD19-T等购自 TaKaRa公司(大连)；
PCR引物合成以及 DNA测序均由上海生工生物工
程有限公司完成；抗生素均购自上海生工生物工程
有限公司；其它试剂为国产分析纯。
3.2野扁桃 AlsCBF基因启动子的克隆
以野扁桃幼嫩叶片为试材，采用 CTAB法(王军
等, 2006)，并稍加改进提取总 DNA。
根据 AlsCBF基因的 5端序列设计 3个巢式的
特异性引物作为反向引物，其序列分别为：AC-SP1：
5-GAGTCGGAAAGTTGAGAGAAGAACATG-3；
AC-SP2：5-GGTCGGAATGTGGATCAGCAAGTCC-
3；AC-SP3：5-CACGTGGCGGTTAACACAGGCTG-
3；分别以 Genome Walking Kit试剂盒中的 4个 AP
引物作为正向引物。1 μL DNA 为模板、AP Primer
(100 μmol/L)和 AC-SP1 (10 μmol/L)各 1 μL为上下
游引物，按试剂盒的说明书进行 PCR扩增，总反应
体系为 50 μL，退火温度为 65℃。取第 1次 PCR产
物 1 μL为模版进行第 2次 PCR扩增，引物为 AP和
AC-SP2，退火温度为 65℃。取第 2次 PCR产物为模
版进行第 3次 PCR扩增，引物为 AP和 AC-SP3，退
火温度同上。电泳检测 3次 PCR产物后，回收、克
隆、测序第 3次 PCR产物。
测序结果确定为 AlsCBF基因的启动子后，根据
已经获得的序列重新设计下游巢式特异性引物作为
反向引物，其序列分别为 AC-SP4：5-TATGGTCTA
GAGAGGATGAGGTGTGA-3；AC-SP5：5-GAGGG
ATTTCTATGGAGGTCGATCAA-3；AC-SP6：5-CG
TCATTCCAAACCATGTAGCCATCT-3；分别以 G-
enome Walking Kit试剂盒中的四个 AP引物作为正
向引物。1 μL DNA为模板、AP Primer (100 μmol/L)
和 AC-SP4 (10μmol/L)各 1μL为上下游引物，按试剂
盒的说明书进行 PCR扩增，总反应体系为 50 μL，退
火温度为 65℃。取第 1次 PCR产物 1μL为模版进行
第 2次 PCR扩增，引物为 AP和 AC-SP5，退火温度为
65℃。取第 2次 PCR产物为模版进行第 3次 PCR扩
增，引物为AP和 AC-SP6，退火温度同上。电泳检测 3
次 PCR产物后，回收、克隆、测序第 3次 PCR产物。
将两次染色体步移获得的启动子序列进行拼
接，并根据已获得序列设计上游引物 YZF：5-CCT-
CAACTTTGCTGACTCGGCTT-3，AC-SP1为下游引
物，以基因组 DNA为模版扩增序列，回收 AlsCBF基
因启动子序列扩增产物，测序。综合运用 PlantCARE
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/
html/)和 PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)
等在线软件进行启动子分析，寻找可能的植物启动子
顺式作用原件(Higo et al., 1999; Rombauts et al., 1999)。
3.3植物表达载体的构建
对含有目的基因的 pMD19-T质粒和表达载体
质粒 pCAMBIA1304进行双酶切，采用 SalⅠ和NcoⅠ，
分别切胶回收双酶切产物，采用 T4连接酶，连接酶
切后的 1 304片段及启动子目的片段，转化大肠杆菌
DH5α，37℃过夜培养后挑取单菌落进行 PCR，并提
1220
取质粒进行双酶切鉴定，获得阳性克隆，将酶切验证
的载体送至上海生工测序鉴定，命名为 pCAMBI-
A1304-AlsCBFpro。将 pCAMBIA1304-AlsCBFpro阳
性质粒通过冻融法转入农杆菌 EHA105，PCR 鉴定
阳性菌落。
3.4农杆菌介导的瞬时表达
以 EHA105空菌株作为阴性对照，以含 pCAM-
BIA1304载体的菌株作为阳性对照，对已构建的含
有野扁桃 AlsCBF启动子片段的重组载体 pCAMBI-
A1304-AlsCBFpro进行瞬时表达分析。在培养 6~8
周的烟草苗中，选取位于植株中间偏上部位完全展
开的完整叶片，采用 1 mL塑料注射器将静置 3 h的
农杆菌悬浮液从叶背注入细胞间隙，选取的渗入组
织位于叶主脉及 2排次脉之间，面积约 2 cm2左右，
渗入农杆菌为 50 μL，每个叶片以叶脉分隔，渗入
8~12点，室内温度为 22℃~25℃，保湿黑暗培养条件
下培养 48 h后，对所有注射后的烟草进行逆境胁迫
处理。对烟草进行干旱、低温、高盐胁迫处理，分别采
用 20% PEG处理 4 h、4℃处理 4 h、200 mmol/L NaCl
处理 4 h。胁迫处理后对叶片进行的 GUS活性的染
色分析，参考 Jefferson (1987)所用的染色方法，分别
将各个处理待检测的植物叶片置于 2 mL的离心管
中，加入 GUS染色液 1.5 mL浸没组织块，于 37℃下
保温并振荡 16~24 h后，脱色液采用 75%的乙醇，脱
色至脱色液无色后，将植物组织叶片取出，观察染色
结果，并拍照保存。
作者贡献
余曦瑶是本研究的实验设计和实验研究的执
行人，完成数据分析，论文初稿的写作；姚正培和任
艳萍参与实验设计，试验结果分析；王敏参加部分
PCR试验；张亮参与生物信息分析和引物设计；李
疆和罗淑萍是项目的构思者及负责人，指导实验设
计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并
同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31260186; 313604-
73)、新疆自治区十二五重大科技专项(201130102-1)
和新疆自治区果树学重点学科基金共同资助。
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