全 文 ：山 东 农 业 科 学 2013，45(11):7 ～ 11 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2013 －07 －29
基金项目:科技部科技基础工作资助项目“国家核桃板栗种质资源平台”(2013 － 048) ;农业部种质资源保护项目(2013 － 26) ;山东
省农业良种工程项目［鲁科农字(2011 － 086) ］
作者简介:张建朋(1981 －) ，男，硕士，农艺师，主要从事农业技术推广工作。E － mail:zjp_1015@ 163. com
* 通讯作者:刘庆忠，男，研究员，主要研究方向为果树种质资源与生物技术育种。E － mail:qzliu001@ 126. com
麻核桃 CBF基因的克隆与生物信息学分析
张建朋1，张士刚2，陈 新3，徐 丽3，贾建云3，张力思3，刘庆忠3*
(1. 龙口市农业技术推广中心，山东 龙口 265701;2. 泰安市农业局，山东 泰安 271000;
3. 山东省果树研究所 /山东省果树生物技术育种重点实验室，山东 泰安 271000)
摘 要:CBF基因是植物 CBF抗冷途径的枢纽，对增强植物抗冷能力极为重要。本研究根据已知的核桃
CBF基因序列设计通用性引物，对麻核桃 cDNA进行 PCＲ扩增，成功获得麻核桃 CBF基因全长序列，命名为
JhCBF。JhCBF全长 820 bp，包含一个 645 bp的开放读码框(OＲF) ，编码 214 个氨基酸。序列分析表明 JhCBF
与其他物种来源的 CBF具有较高的同源性，其中，与桦木科白桦的同源性最高，为 61. 22%;JhCBF 含有一个
预测的 AP2 结构域及 CBF特有的两段短肽序列。系统进化树分析表明 JhCBF 与桦木科白桦的亲缘关系最
近，最先聚为一类。
关键词:麻核桃;CBF基因;克隆;生物信息学分析
中图分类号:Q785 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2013)11 －0007 －05
Cloning and Bioinformatic Analysis of CBF Gene
from Juglans hopeiensis Hu
Zhang Jianpeng1，Zhang Shigang2，Chen Xin3，Xu Li3，Jia Jianyun3，Zhang Lisi3，Liu Qingzhong3*
(1． Longkou Agricultural Technology Promotion Center，Longkou 265701，China;
2． Taian Agricultural Bureau，Taian 271000，China;3． Shandong Institute of Pomology /
Shandong Provincial Key Laboratory of Fruit Tree Biotechnology Breeding，Taian 271000，China)
Abstract CBF gene plays a central role in CBF cold － response pathway in plant． It is very important in
increasing plant cold tolerance． Universal primers were designed according to published walnut CBF genes，
and then PCＲ amplification was carried out using Juglans hopeiensis cDNA． Finally，the Juglans hopeiensis
CBF gene was obtained，named JhCBF． The full － length of JhCBF was 820 bp，containing an opening read-
ing frame (OＲF)of 645 bp． The deduced protein had 214 amino acids． Sequence analysis showed that Jh-
CBF shared high homology with CBF from other plants． Among them，the homology with CBF from Betula
platyphylla (Betulaceae)was the highest of 61． 22% ． JhCBF contained a predicted AP2 domain and two pep-
tide sequences which were specific to CBF． Phylogenetic tree analysis indicated that JhCBF had the closest re-
lationship with CBF from Betula platyphylla(Betulaceae) ，and they were clustered into one group firstly．
Key words Juglans hopeiensis Hu;CBF gene;Clone;Bioinformatic analysis
麻核桃(Juglans hopeiensis Hu)属胡桃科
(Juglandaceae)胡桃属(Juglans) ，主要分布在河
北、天津、山西和北京的部分山区。麻核桃集纹路
多变、皮质良好、造型优美等优点于一身，在文玩
核桃中属于最高档次的品种。低温冻害是影响核
桃生长发育、造成核桃产量和质量下降的主要因
素之一。南方的泡核桃引种到北方种植时，多数
因低温胁迫致死，而我国独有的麻核桃能够在河
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2013.11.042
北、北京等山区林地正常生长，因此，对麻核桃的
抗寒性进行研究具有重要的理论和实践意义。
CBF(CＲT /DＲE － binding factor)基因是一种
低温响应转录因子基因，其主要的抗冷机制为:当
植物受低温驯化后，ICE(Inducer of CBF expres-
sion)转录因子被激活，与位于 CBF基因上游启动
子中的 ICE 盒相结合，诱导 CBF 基因表达，而后
CBF 基因表达产物与下游一系列 COＲ(Cold －
regulated gene)基因启动子中的 CＲT /DＲE(C －
repeat binding factor /dehydration － responsive ele-
ment binding protein)元件结合，诱导系列抗冷基
因表达，从而提高植物抗冷性［1］。自 1997 年
Stockinger等［2］在拟南芥中克隆到 CBF1 基因以
来，之后相继从油菜［1，3］、水稻［4］、大麦［5］等多种
作物中分离和鉴定出 CBF 转录因子基因。迄今
为止，在樱桃［6］、杨树［7，8］、葡萄［9］、柑橘［10］、榛
子［11］等多种木本植物中也已克隆得到 CBF 基
因。研究表明，CBF基因过量表达或异源表达能
增加下游抗冷功能基因的表达，增加抗寒代谢物
(包括抗氧化物质和渗调物质等)的积累量从而
对提高植物的抗寒性发挥重要作用［12 ～ 14］。本试
验根据已公布的核桃 CBF 基因序列设计通用引
物，成功克隆 JhCBF 基因，并对其进行生物信息
学分析，为 JhCBF基因的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
供试品种为麻核桃‘百花山狮子头’，采自泰
安国家核桃种质资源圃，取材后立即投入液氮冻
干，存于 － 80℃冰箱备用。
EASYspin植物 ＲNA 快速提取试剂盒购自北
京艾德莱生物科技有限公司;DNA 凝胶回收试剂
盒、ＲNase － Free DNaseⅠ和 Mix 均购自天根公
司;引物及克隆载体 pMD19 － T Vector 购自宝生
物(大连)有限公司;反转录试剂盒购自 Thermo
Scientific公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 CBF 基因的克隆 ＲNA 提取纯化按照
EASYspin植物 ＲNA 提取试剂盒及 ＲNase － Free
DNase Ⅰ纯化说明操作。cDNA 第一条链的合成
利用 Thermo Scientific 公司 ＲevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit，以 Oligo(dT)18为引物反转录
合成 cDNA第一链。根据 NCBI 已经公布的核桃
CBF基因序列设计通用引物:CBF F1:5 － CAC-
TATCTACTTCTATTACACAAGC － 3和 CBF Ｒ1:
5 － ATTATGGTACTATAAAAACAGAAAC － 3对
麻核桃 cDNA 产物进行扩增。反应体系:ddH2O
9. 5 μl，Mix 12. 5 μl，10 μmol /L 引物 CBF F1 和
CBF Ｒ1 各 1 μl，cDNA 模板 1 μl，总体积 25 μl。
PCＲ反应程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，
72℃ 1 min，35 个循环;72℃ 10 min，4℃保存。
1%琼脂糖凝胶检测，回收与预期片段大小一致的
泳带，连接克隆载体并转化感受态细胞，通过蓝白
斑筛选及质粒酶切鉴定阳性克隆后，送上海生工
生物工程股份有限公司测序。
1. 2. 2 生物信息学分析 将测序结果通过 NCBI
数据库(http:/ /www. ncbi. nlm. nih. gov． /)进行
Blast比对分析;用 DNAMAN 软件分析 CBF 基因
核苷酸序列及相应的氨基酸序列，将 JhCBF 与其
他物种来源的 CBF进行同源性分析，并构建系统
进化树。
2 结果与分析
2. 1 麻核桃 CBF基因 cDNA全长的获得
以麻核桃 cDNA 为模板，用通用引物进行
PCＲ扩增，获得了长约 820 bp 的特异性条带(图
1)。将测序结果在 NCBI 网站进行 Blast 比对发
现，该 cDNA序列与已注册其他植物的 CBF 基因
具有较高的同源性，命名为 JhCBF。JhCBF cDNA
全长 820 bp，包含一个 645 bp 的开放读码框
(OＲF) ，编码 214 个氨基酸。在第 149 个核苷酸
处有起始密码子 ATG，在第 791 个核苷酸处有终
止密码子 TAG(图 2)。
M:DNA分子量标准 DL 2000;1:PCＲ扩增产物
图 1 JhCBF基因 PCＲ扩增结果
8 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
注:粗体为转录起始密码子 ATG，* 标记为终止密码子 TAG，下划线部分表示非编码区。
图 2 JhCBF的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
2. 2 JhCBF编码蛋白序列分析及系统进化树构
建
利用 DNAMAN 软件对 JhCBF 和其它物种来
源的 CBF蛋白进行同源比对(图 3) ，结果发现，
JhCBF与部分其他已知植物的 CBF 蛋白具有较
高的同源性，其中与桦木科白桦的同源性最高，为
61. 22%;与芸香科柑橘和粗柠檬同源性均为
57. 14%;与桑科鲁桑、茄科甜椒、马铃薯、多毛番
茄、醋栗番茄同源性分别为 55. 92%、54. 69%、
52. 65%、51. 02%和 50. 61%;与大戟科木薯、桃
金娘科巨桉和杨柳科毛果杨同源性分别为
53. 88%、50. 61%和 50. 20%。
序列分析结果(图 3)显示，JhCBF 存在预测
的 AP2 结构域，约由 60 个氨基酸组成，在不同的
植物中非常保守［15］。拟南芥 CBF 基因 CBF1 ～ 3
分属一个类群，主要在冷胁迫响应过程中具有重
要功能［16］。研究发现，AtCBF1 ～ 3 蛋白中都含有
两段 短 肽 序 列 (PKK /ＲPAGＲxKFxETＲHP 和
DSAW) ，前者位于 AP2 DNA 结合域的上游，后者
位于 AP2 DNA 结合域下游，被认为是 CBF 的特
征序列，且两段序列在进化程度不同的物种中高
度同源［3］。JhCBF含有此特征序列，此外，其 AP2
结构域中还有保守的氨基酸残基 V14，据报道该
氨基酸残基在 DＲEB亚族中是相对保守的［17］。
为进一步了解 JhCBF 与其它植物 CBF 之间
的进化关系，在多重比对的基础上，用上述 12 个
物种的 CBF 蛋白序列构建系统进化树(图 4)。
结果显示，JhCBF 与桦木科白桦 CBF(BpCBF)亲
缘关系最近，最先聚为一类;芸香科的柑橘和粗柠
檬聚为一类;茄科的甜椒、马铃薯、多毛番茄和醋
栗番茄聚为一类，CBF 的进化基本符合植物分类
学规律，具有明显的种属特性。
9第 11 期 张建朋等:麻核桃 CBF基因的克隆与生物信息学分析
注:黑色代表相同的氨基酸，方框处表示 AP2 DNA结合位点;侧翼 CBF特征序列用虚线表示;保守的氨基酸残基 V14 用箭头表示。
BpCBF:白桦(Betula platyphylla) ;MaCBF:鲁桑(Morus alba var. multicaulis) ;PtCBF:毛果杨(Populus trichocarpa) ;ShCBF:多毛番茄
(Solanum habrochaites) ;StCBF:马铃薯(Solanum tuberosum) ;CaCBF:甜椒(Capsicum annuum) ;SpCBF:醋栗番茄(Solanum pimpinellifoli-
um) ;CsCBF:柑橘(Citrus sinensis) ;MeCBF:木薯(Manihot esculenta) ;CjCBF:粗柠檬(Citrus jambhiri) ;EgCBF:巨桉(Eucalyptus grandis)。
下图同。
图 3 JhCBF与其它物种来源 CBF的氨基酸序列比较
图 4 JhCBF与其它物种来源 CBF系统进化树
3 结论
本研究首次获得了麻核桃 CBF 基因的全长
cDNA，并对其进行了生物信息学分析，揭示出
CBF在核桃种属之间保守存在。本研究为下一步
深入探讨 JhCBF基因的功能，揭示麻核桃响应低
温胁迫的分子机制提供了基础，为增强核桃的抗
寒性及培育具有抗寒能力的核桃新品种提供理论
依据。下一步将抗寒基因与传统抗冷育种技术相
01 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
结合，培育抗冷植物新品种，对农业生产具有十分
重要的意义。
参 考 文 献:
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11第 11 期 张建朋等:麻核桃 CBF基因的克隆与生物信息学分析