全 文 ：侧金盏花 CBF 转录激活因子基因片段的克隆
邓传良1 , 秦瑞云1 , 王连军1 , 高武军1 , 卢龙斗1 , 王兆龙2
(1.河南师范大学生命科学学院 ,河南新乡 453007;2.山东省费县第二中学 ,山东费县 273400)
摘要　[目的]探索 CBF 转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板 ,根据拟南芥 CBF 基因序列
的保守区设计 1对特异性引物 ,通过 PCR扩增获得 1个DNA片段 ,将其克隆到 pUCm-T载体中 ,转化大肠杆菌 TG1 ,筛选阳性克隆并对其
进行测序鉴定。[结果] 测序结果显示通过 PCR扩增获得的基因片段长 448 bp。在GenBank中检索 ,该序列与从拟南芥和其他作物中克
隆的 CBF 同源基因序列同源性较低 ,说明是一个新的基因片段 ,初步认定该片段是侧金盏花 CBF 基因片段。[结论] 该研究为进一步
克隆侧金盏花 CBF 转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。
关键词　侧金盏花;CBF转录激活因子;CBF 基因;克隆
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)27-11686-02
Cloning of a Fragment of CBF Transcriptional Activator Gene from Adonis amurensis
DENG Chuan-liang et al　(College of Life Sciences ,Henan Normal University , Xinxiang ,Henan 453007)
Abstract　[ Objective] The aim was to explorewhether the CBF transcriptional activator gene existed in Adonis amurensis.[Method] With the genomic
DNA of A.amurensis as template, a DNA fragment was obtained by PCR amplification using 1 pair of specific primers designed from conservative region of
Arabidopsis thaliana CBF gene sequence.The fragment was cloned into pUCm-T vector, then transformed into Escherichia coli TG1 , and then sequenced
and identified through screening the positive clones.[ Result] The sequencing result showed that a fragment with the length of 448 bp was obtained by PCR
amplification.The sequence shared lower homology with the CBF homologous gene sequences cloned from A.thaliana and other crops ,which showed that
it was a new gene fragment and the fragment was identified as CBF gene fragment from A.amurensis preliminarily.[ Conclusion] The research laid the
foundation for the further study of the clone of CBF transcriptional activator gene with full length sequence from A.amurensis and the identification of its
biological significance.
Key words　Adonis amurensis;CBF transcriptional activator;CBF gene;Clone
基金项目　河南省教育厅自然科学基金项目(2007180028);河南师范大学青年科学基金项目(2006037)。作者简介　邓传良(1975-),男 ,山东定陶人 ,博士 ,副教授 , 从事植物种质资源及分子遗传学研究。收稿日期　2008-08-26
　　CBF 转录激活因子是近几年从拟南芥[ 1-5] 、油菜[ 6-7] 、
水稻[ 8] 、大麦[ 9]以及小麦 、黑麦与番茄[ 7]等多种植物中分离
和鉴定出来的一类受低温诱导的反式作用因子。它们能与
CRT/DRE DNA调控元件特异结合 ,激活启动子中具有这一
调控元件的冷诱导和脱水诱导基因的表达 ,从而引起植物体
内的多种生理生化变化[ 2 , 7 , 10] 。转基因实验证明 ,CBF 基因
在拟南芥和油菜中超表达 ,转基因植株对低温干旱和高盐胁
迫的耐性显著增强[ 10-12] 。由于 CBF 基因超表达能同时诱
导多个目的基因在非胁迫条件下表达 ,在提高植物抗逆性方
面效果要比单一功能基因的转化好得多[ 11-12] ,所以这类转
录激活因子的发现 ,为基因工程综合改良大田作物和园艺植
物的抗逆性提供了一种全新而有效的技术途径。
侧金盏花别名冰凉花 、顶冰花 、早春花 ,属毛茛科 、侧金
盏花属[ 13] 。此种植物有傲春寒的特性 ,金黄色的花朵顶冰
而出。在冬末春初的北方地区没有其他植物萌生的情况下 ,
它一花独放 ,因此有很好的观赏价值[ 14-15] 。克隆其 CBF 转
录激活因子并通过基因工程技术将其导入花卉或者农作物 ,
对提高花卉或者农作物的抗寒性有重要的意义。该研究首
次获得侧金盏花 CBF 转录激活因子的基因片段 ,为进一步
克隆其全长序列 、鉴定其生物学意义奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　材料　侧金盏花采自河南省辉县市关山国家地质公
园 ,采集后液氮迅速保存。根据在 GenBank中登录的 3个拟
南芥 CBF 基因(登录号:ATU77378、AF074601 、AF074602)序列
的保守区设计 1对特异引物 ,并委托上海生物工程公司合
成。上游引物:TTCTGAAATGTTTGGCTCCGA ;下游引物:
CCAAGCCGAGTCAGCGAA。10 ×PCR缓冲液 、MgCl2 、dNTP 、
Taq 酶等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司 ,用于纯化
PCR产物的UNlQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒购自上海生物
工程公司。
1.2　实验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取 。采用改良 CTAB 法 ,琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.2.2　PCR扩增及目的片段的分离。PCR扩增在 TC-16/H
型 PCR仪上进行 ,采用 25.0 μl反应体系 ,其组成为:10×PCR
缓冲液(不含Mg2+)2.5 μl ,MgCl2(5 mmol/L)2.0μl , dNTP混合
物(10 mmol/L)0.5μl ,上下游引物(均为 20μmol/L)各 1.0μl ,
基因组 DNA(20 ng/μl)2.0 μl , Taq 酶(5 U/μl)0.2 μl , ddH2O
15.8μl。扩增参数为:94 ℃预变性 5 min 后 ,按 94 ℃变性
30 s ,52 ℃退火45 s ,72 ℃延伸 90 s ,共进行 30个循环 ,最后 72
℃延伸 7 min。
电泳分离 PCR产物中的目的条带 ,并用 UNlQ-10柱式
DNA胶回收试剂盒纯化。取适量纯化的PCR产物与 pUCm-T
载体在T4-DNA连接酶催化下 ,16 ℃连接过夜。连接产物转
化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞 ,通过氨苄西林钠筛选和菌
液 PCR扩增检测重组质粒 。
委托上海生物工程公司采用ABI 377全自动 DNA序列
分析仪测序。用所得序列在GenBank中进行Blast检索。
2　结果与分析
2.1　PCR产物的扩增和克隆　以侧金盏花基因组 DNA为
模板 ,用所设计的 1对特异引物进行 PCR反应 ,得到 1条与
预计长度相当的约 500 bp 的条带。将经回收纯化后的PCR
产物与 pUCm-T载体连接 ,连接产物转化大肠杆菌 TG1菌株
感受态细胞后 ,在含氨苄西林钠 X-gal及 IPTG的 LB平板上
涂布获得白色菌落。挑取这些菌落培养 ,以菌液为模板 ,用
上述上下游引物进行PCR反应 ,结果扩增出了长度约 500 bp
的DNA片段(图 1),说明PCR产物已克隆到载体 pUCm-T中 。
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(27):11686-11687　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　傅真治
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.27.067
注:M为 Ladder DNA;C为对照;S为样品。
Note:M , Ladder DNA;C ,Control;S , Samples.
图 1　PCR扩增片段重组入 pUCm-T
Fig.1　Recombining PCR amplified fragment into pUCm-T
2.2　基因序列与同源性分析　序列测定表明克隆片段长
448 bp ,登录号为EF514695 ,其碱基序列见图 2。
注:图中黑框部分是ORF的序列;画线部分是引物的序列。
　Note:The parts with black frame are ORF sequences;The underlined
parts are the sequences of the primer.
图 2　目的片段的序列
Fig.2　The sequences of target fragment
　　由图 2可知 ,片段编码区域较短 ,3′和 5′端存在非编码
区。在GenBank中检索 ,该序列与从拟南芥和其他作物中克
隆的 CBF 同源基因同源性较低 ,说明是一个新的基因片段 ,
其功能有待进一步研究。
3　讨论
CBF 在植物冷驯化过程中起关键性的调节作用 ,深入研
究 CBF 低温效应途径对揭示植物抗冻机制有重要意义[ 16] 。
CBF 广泛存在于各种高等植物中 ,包括抗冻和不抗冻植物 ,
因此 ,通过比较这 2类植物中 CBF 途径的区别 ,可以更深刻
地理解植物抗冻/寒的分子机制。
CBF 基因属于耐逆相关基因 ,但其作用并不是表达后直
接产生 ,而是通过激活启动子中含有 CRT/DRE DNA 调控元
件的冷诱导和脱水诱导基因的表达引起的 。因此 ,植物中的
CBF 耐逆机制包含 2个基本组成元件 ,一是 CBF 基因;二是
目的基因。该研究结果的意义首先在于证明了侧金盏花中
存在有 CBF 基因 ,这为利用 CBF 基因进行花卉的基因工程
改良提供了依据和前提条件;其次 ,侧金盏花 CBF 基因片段
的获得为该基因全长序列的克隆奠定了基础。目前 ,笔者正
在通过RACE法克隆全长基因 cDNA。
参考文献
[ 1] STOCKINGER E J , GILMOUR S J , THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana
CBF1 encodes anAP2 domain containing transcriptional activator that binds to
the C-repeat PDRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates tran-
scription in response to low temperature and water deficit[ J] .Proc Natl Acad
Sci USA , 1997 ,94:1035-1040.[ 2] GILMOUR S J ,ZARKA D G ,STOCKINGER E J ,et al.Low temperature regula-
tion of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early
step in cold induced COR gene expression[ J] .Plant J, 1998,16(4):433-442.
[ 3] LIU Q ,KASUGAM , SAKUMA Y , et al.Two transcription factors , DREB1 and
DREB2 ,with an EREBPP AP2DNA binding domain separate two cellular signal
transduction pathways in drought and low temperature responsive gene expres-
sion, respectively , in Arabidopsis[ J] .Plant Cell , 1998 ,10(8):1391-1406.
[ 4] MEDINA J , BARGUESM , TEROL J , et al.The Arabidopsis CBF gene family is
composedof three genes encoding AP2 domain containing proteins whose ex-
pression is regulatedby low temperature but not by abscisic acidor dehydration
[ J] .Plant Physiol, 1999,119(2):463-470.
[ 5] KITASHIBA H , ISHIZAKA T , ISUZUGAWA K , et al.Expression of a sweet
cherry DREB1/CBF ortholog in Arabidopsis confers salt and freezing tolerance
[ J] .J Plant Physiol ,2004, 161:1171-1176.
[ 6] ZHOU N ,WUG ,GAO Y P , et al.Molecular cloning of a cDNA encoding dehy-
dration responsive element(DRE)binding protein in Brassica napus[ EB/OL] .
[ 1998-01-01] .http://www.ncbi.nlm.nih.Gov.
[ 7] JAGLO K R ,KLEFF S, AMUNDSEN K L , et al.Components of the Arabidopsis
C-repeat dehydration responsive element binding factor cold response pathway
are conserved in Brassica napus and other plant species[ J] .Plant Physiol ,
2001, 127(3):910-917.
[ 8] CHOI DW, CLOSE T J.Rice(Oryza sativa , cv.Somegawa)DREPCRT binding
factor(CBF)[ EB/OL] .[ 2000-01-01] .http://www.ncbi .nlm.nih.gov.
[ 9] CHOI DW,CLOSE T J.Isolation of CBF1 like mRNA(BCBF1)from Barley
(Hordeum vulgare , cv.Morex)[ EB/OL] .[ 2000-01-01] .http://www.ncbi.
nlm.nih.gov.
[ 10] GILMOUR S J , SEBOLT A M , SALAZARM P , et al.Over expression of the
ArabidopsisCBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes
associated with cold acclimation[ J] .Plant Physiol , 2000 ,124(4):1854-1865.[ 11] JOGLO-OTTOSEN K R,GILMOUR S J, ZARKA D G ,et al.Arabidopsis CBF1
over expression induces COR genes and enhances freezing tolerance[ J] .Sci ,
1998, 280:104-106.
[ 12] KASUGAM , LIUQ ,MIURA S ,et al.Improving plant drought , salt , and freezing
tolerance by gene transfer of a single stress inducible transcription factor[ J] .
Nat Biotech ,1999, 17:287-291.
[ 13] 江苏新医学院.中药大辞典[M] .上海:上海人民出版社, 1977:2517.
[ 14] 王守君,郑学良 ,郑维春.侧金盏花研究[ J] .中国林副特产 , 2002 , 62
(3):50.
[ 15] 郑学良,原理 ,王守君,等.侧金盏花观赏与药用[ J] .特种经济动植物 ,
2002, 10(1):21.
[ 16] 任艳利 ,崔百明,卫海滨,等.转录激活因子 CBF在植物调节冷驯化中
的作用[ J] .植物生理学通讯 ,2006,42(3):589-594.
(上接第 11681页)
[ 6] 曾莉娟 ,郑成木.SSR技术及其应用[ J] .热带农业科学 , 2001 ,91(3):56
-59.
[ 7] 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M] .北京:化学工业
出版社 ,2005:131-161.
[ 8] 郭小平,赵元明 ,刘毓侠.SSR技术及其在植物遗传育种中的应用[ J] .华北农学报 ,1998, 13(3):73-76.
[ 9] 梁红.和平红阳中华猕猴桃高产优质栽培技术[ J] .中国种业, 2006
(10):62-63.
[ 10] 刘忠平 ,邹梓汉 ,梁红 ,等.和平一号猕猴桃及其高产优质栽培[ J] .中
国种业 ,2006(5):51-52.
[ 11] 柯辉鹏,李小丹 ,梁红.猕猴桃叶 DNA 的AFLP 初报[ J] .生物技术通
报 , 2006(1):55-58.
[ 12] 柯辉鹏 ,李小丹 ,梁红 ,等.不同猕猴桃品种雌雄植株的AFLP分析[ J] .仲恺农业技术学院学报, 2007 ,20(3):7-12.
[ 13] 徐小彪,陈华 ,张秋明.样品不同保存方法对猕猴桃总 DNA提取效果
的影响[ J] .江西农业大学学报, 2004 ,26(3):321-328.
[ 14] 李国柱,陈光彩.核技术生物科学及农业应用[M] .北京:中国林业出
版社 ,2005:178-198.
[ 15] 黄宏文,龚俊杰 ,王圣梅 ,等.猕猴桃属 Actinidia 植物的遗传多样性
[ J] .生物多样性 ,2000, 8(1):1-12.
[ 16] 董晓莉,汤浩茹,丁建,等.彩色猕猴桃与美味猕猴桃的遗传差异分析
[ J] .果树学报, 2006 ,23(5):678-680.
[ 17] 陈晓玲,谢振文,梁红.广东和平县猕猴桃遗传多样性研究[ C] //黄宏文.猕猴桃研究进展 III.北京:科学出版社 ,2005:148-157.
1168736卷 27期　　　　　　　　　　　　　　　　邓传良等　侧金盏花 CBF转录激活因子基因片段的克隆