全 文 ：上海农业学报 1 2 99, 8 ( 3 ) : 3 0~ 35
A以。 八g 八邝 lt o ar e S h a ,动 a i
上海地区香石竹斑驳病毒的理化特性 ’
尤`学仁 沈菊英 龚祖埙
(中国科学院上海生物化学研究所 , 上海 2。。。 3 1)
张 爱 平
〔上海市园林科学研究所 , 上海 2。。 2 3 2)
摘 要 从上海地区栽培的香石竹上分离到一种直径为 34 一 3 5n m 等轴对称的病毒颗粒 ,在
SDS
一聚丙烯酞胺凝胶电泳中病毒外壳蛋白分子量为 40 0 0 道尔顿 , 并由约 3 72 个氨基酸残基组
成 。 病毒核酸经 D N as e l 、 R N as e l 和核酸酶 1S 等酶切试验证明为单链 R N A , 在 1 . 0 % 的琼脂糖凝
胶电泳 中病毒核酸呈现一个分子量为 1 . 2 x l 。` 道尔顿的基因组分和一个较弱的分子量为 0 . s x
1。` 道尔顿的组分 。 根据病毒上述的理化特性以及免疫双扩散实验 ,证明目前在上海地区分离获得
并引起本地区香石竹主要病毒病害的是香石竹斑驳病毒 。
关键词 香石竹病毒 ;病毒形态 ;理化性质
香石竹病毒广泛发生于世界各地香石竹种植区 , 而且香石竹病毒种类很多 ,常见的有香石
竹叶脉斑驳病毒 ( C a r V M V ) 〔’ 」; 香石竹潜隐病毒 ( e a r L v ) 仁公」 ;香石竹坏死斑病毒 ( e a r N F v ) 仁, J ;
香石竹蚀环病毒 ( C a r E R V ) t` J ;香石竹斑驳病毒 ( e a r M v ) LS , 6 J ; 香石竹环斑病毒 ( e a r R v ) 仁? 〕 ,这
些病毒病常造成香石竹植株生长衰弱 , 花朵变小 ,杂色 ,花苞开裂等危害 , 从而使其商品价值降
低 。 近年来各地 从国外引进的香石竹 , 往往在种植数年后 ,终因病毒病一年比一年严重而最后
毁种 。 由于香石竹病毒多为混合侵染 ,分离研究比较困难 , 因此以前对我国的香石竹病毒研究
较少 。 1 9 8 8年于嘉林等困对北京 、 上海的一种香石竹斑驳病毒 ( C a r M v )进行寄主范围及其血
清学特性的研究 , 最近又报道了 C a r M V 北京株系 ( B )S 的生化特性和 。 D N A 的合成阁 。 本文报
道在上海地区引起香石竹病害的球状病毒 ,及其形态 、 理化性质和抗血清反应等研究结果 。 `
1
. 材料与方法
1
.
1 主要生化试剂
低分子量标准蛋白为上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品 : D N a s e l ( R N as ef r e )
2 4一 9 . s k b单链 R N A 标准分子量为 B e t h e s d a R e a s e a r e h L a b o r a t r i e s 公司产品 ; 5 1 核酸 酶
B o e h r i n g e
: 公司产品 ; R N a s e 一为西德 M a r e h 公司产品 ; D N A 质粒 p u e 1 8 为华美公司的产
.0为品
1
.
2 病毒的抽提与纯化 参见文献 [ 10 〕。
1
.
3 电镜观察 纯化的病毒样品用 2%的磷钨酸负染 , 在 日本的 J EM 一 I Oo c x 电子显微镜下
进行观察 。
1
.
4 病毒核酸的提取 按常规酚和氯仿提取 ,并用乙醇沉淀已“ 〕。
本 文于 1 9 9 1 年 5 月 14 日收到 , 19 9 2 年 4 月 2 3 日收到三改稿 。
感 谢上海生化所陈德明和上海市农科院食用菌研究所陈明杰两 位先生对本工作的帮助 .
3 期 沈学仁等: 上海地区香石竹斑驳病毒的理化特性
1
.
5 病毒核酸的鉴定
1
.
5
.
2R Na s el 和D Na s el 酶解试验: l 拼 g的 pu e1D N 8A 质粒( 先用内切酶E eoRI 酶
解为线状分子) , 1拌g 的家蚕细胞质多角体病毒双链 R N A (C P v 一ds R N A ) ,如 9 c a r M v 核酸分
别与 3 5 单位的 D N a s e l ( R N a s e 一 f r e e )和 1单位的经 1 0 0 ,C l o m i n 处理去除 D N a s e 的 R N a s e l
混合 , 37 ℃保温反应 30 m i n 。 酶解结果通过 1 . 0 %琼脂糖凝胶电泳进行观察 。
1
.
5
.
2 5 1 核酸酶酶解试验 : 在 l拜g 的 C P V 一d s R N A 、 1卜g 烟草花叶病毒核酸 ( T M V 一 s s R -
N A )
、
1拌g e a r M V 核酸中分别加入 2单位的 5 1 核酸混合后 ,与对照 l 拜g 的 C P V 一 d s R N A 、 l “ g
T M v
一 s s R N A
、
1拼9 e a r M v 核酸同时于 3 7℃ 保温反应 1 5 m i n ,酶解结果通过 1 . 0%琼脂糖凝胶
电泳观察 。
1
.
6 病毒核酸分子量的测定
病毒核酸加入样品缓冲液后 , 加在含 。 , 5拌g /ml E B 的 1 . 0 %琼脂糖凝胶电泳 2 . 5h ,核酸
参照物选用 B R L 公司的 0 . 2 4~ 9 . s k b s s R N A 标准分子量 , 电泳用 T B E 缓冲系统 [` 2 · ` 3 ] 。
1
. 了病毒外壳蛋白亚基分子量的测定
将提纯的病毒样品加入样品裂解缓冲液后 ,在 1 0 ℃水浴中加热 Zm in 后 , 上样于 12 %的
· 含 S D S 的不连续聚丙烯酞胺垂直板凝胶 中电泳 3 . h5 。 电泳缓冲液按 iK gn 和 L ae m m il 的系
统 , 用低分子量标准蛋白计算病毒外壳蛋白的分子量队〕。
1
.
8 病毒蛋白的分离及氨基酸组成的测定
按 rF a e ln e d一 C on ar t 仁` 5」方法制备病毒外壳蛋白 ,用 日立 8 3 5一 5。 型氨基酸 自动分析仪测定
病毒外壳蛋白氨基酸组成 ,按 S p ie d[ ` 6] 的方法测定色氨酸 。
1
.
9 病毒 RN A 的电子显微镜制样和观察
取分 离纯化 的病 毒 R N A 制剂 (浓 度约 为 32 0拼g / m l) 上相 液 50 川 ( 内含 甲酞胺 80 % ,
p H s
.
5的 T r i , o : I M , E D T A o . o 1M , 细胞色素 e zm g / m l , 病毒 R N A 3拜g /m l )铺展于下相溶液
( 内含 甲酞胺 5 0% , p H S . 5 的 T r is 0 . o 1 M , E D T A 0 . o o l M )之上 , 喷碳一火棉胶膜的铜 网取
样 , 2 %醋酸铀乙醇液染色 ,铂把 9 。角旋转投影 , 在 J EM 一 l 0 0 0 x 电镜下观察 〔` 7」。
1
.
10 病毒的免疫双扩散
以上海地区栽培的香石竹上分离纯化的病毒 为抗原 , e a r R V ( C a r n a t i o n R i n g s p o t V i r u s )
香石竹环斑病毒抗血清由英国 Br u nt 博士提供 , C ar M V 抗血清分别由北京植检实验所和英 国
B r 。 nt 博士提供 。 在 1%琼脂糖凝胶培养基上打数个小孔 ( 图 6 ) ,分别注入抗原和稀释 2 0 倍的
抗血清 ,在 37 ℃恒温箱中保温 2 4 h 。
2
. 试验结果
2
.
1病毒形态
纯化病毒颗粒的紫外吸收 A 2 6 0 / 2 8 0一 1 . 54 , A 2 6 o / 2 4 2一 1 . 21 为核蛋 白峰 。 经纯化的病毒
样品在 电镜下观察 ,病毒颗粒直径为 34 ~ 35 n m 等轴对称球状病毒颗粒 , 表面光滑无外膜 (图
版 一 1 ) 。 常呈晶格排列 。
3 2上 海 农 业 学 报 8卷
图版吐 电镜视野 中提纯的病毒 ( x 1 8。 。0 0 )
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e r o ga r ph yo王 pu r i f ie dy ;r u sn e ga tic vl y s ta in e dw i th a u rn yl毛 e e l ta te 0 1 8o o o X
图版 一 N 2 Da se l RN a se l酶解图谱
( A )经 RN a e sl处理的 pe u l s质拉 N D A(B )经 DN a se l处理 的 pe u l s质粒 N D A
(C )经 RN a * 1处理的病毒核酸 ( D )经 N Da se l处理的病毒核酸
(E )经 N Ra e sl处理的 C P V一 RN ( F A )经 N Da e sl处理的 C P V一 N R A
Pl
a te 一 2 Di ge s tio朋 o f via r ln e u le ie a e i da n de on tr ow l i th N Ra se 1a n dDN a se l
( A ) pe u 1 8 pla sm记 a f te r di ge s ti on sw i th RN a se 一 B ( ) pue 1 5 pla s!n i da f te r i dge s ti on w i th n N a e sl
( C ir ) Va ln e u le c ia e i da f te r i dge s tin ow i th RN a e sl ( D )ir Va ln e u le ie a
e i da f te
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di ge s tin ow i th DN
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(E C ) P V
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RN Aa f t
e r i dg
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图版 一 3 1 5酶解图谱
( A )经 51处理的 C P V一 dsRN A(B )未经 1 5处理 的 C P V一 dsN R A
(C )经 l s处理 的病毒核酸 ( D )未经 l s处理 的病毒核酸
(E )经 51处理的 T M V一 s sRN A( F )未经 5 2处理 的 T M V一 s sN R A
Pl
a te 一 3 i D ge
s ti on so f vi r
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( C A ) P V
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( C ) Vira ln c u le c i
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一 s sN R A
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f te r di ge s tin ow i th 51 ( F )T M V
一 s sRN A
图版 一 4 1 % 2 sD s不连续 P AE ( G A )病毒外壳蛋白 (B )低分子量标准蛋白
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a te 一 4 1 2写 S D S一 po l ya e r yla mi de ge le le e tr o ph oe r si so f Via r le oa tpr o te in
( A ) Vi
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标准蛋白 : 1 .磷酸 化酶 b ; 2.牛血清白蛋白 , 3 . 肌动蛋白 ;
4
. 碳酸酥酶 ; 5 . 烟草花叶病毒外壳蛋白
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f e r e n e e por t e i n
:
1
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P h o s p h o r y l
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C a r b o n i c a n h y d r
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i e v ir u s e o ; I t p r o t e i n
图版一 5 病毒核酸电子显微镜照片
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一
5 E I只c t r o n m i e or g ar p h y o f v i r a l n u e l e i e a e id 50 o o o x
图版一 6 病毒免疫双扩散图谱
P l a t e
一
6 1
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o g ic a ! d o u b le d i f f u s 亏o n p a t t e r n o f v i r u s
中心孔 ,抗原为从上海地区 患病毒病的香石竹上分离纯化得到的病毒
l
,
c a r M v 抗血清 }
2 , C a r R V 抗血清 J ( 由英国 B rtl n t 博士提供 )
3 , C ar M V 抗血清 ( 由北京植检 实验所提供 )
孔
3期 沈学仁等 :上海地区香石竹斑驳病毒的理化特性
2
.
2病毒理化特性
病毒核酸在 DNa s e l酶切降解试验中和对照 R N A一样不被 DNa s e l酶解 , 而被 R N as e
1所酶解 ,表明该病毒核酸为 R N A (图版 一 2 ) 。 在核酸酶 5 1 消化试验中 ,该 R N A 与等量对照的
T M v
一 s s RN A 表现相同结果 ,均被核酸酶 5 1 消化 , 而等量的 C P V 一 ds R N A 不能被 1S 酶解 ,证
明该病毒核酸为 s R N A (图版一 3 ) 。
在 1 . 0%琼脂糖凝胶 电泳中 , 病毒核酸除呈现一条带外 , 尚有一条含量较低 , 较为模糊 的
低分子量核酸带 (图版 一 3 ) ,用 BR L 公司的 s s R N A 标准分子量为参照 ,测出病毒核酸分子量 为
1
.
2 X 1 0 6 和 0 . 5 只 1 0 6 道尔顿 。
纯化的病毒样品经 12 写的 S D S一聚丙烯酞胺凝胶电泳 ,测 出病毒外壳蛋白由一种多肤组
成 , 以标准蛋白分子量为对照 , 测出病毒的外壳多肤的分子量为 40 0 0 道 尔顿 (图版 一 4 ) 。
2
.
3 病毒蛋白氨基酸组成
病毒蛋白的氨基酸组成如表 1 所示 ,与香石竹环斑病毒 ( C a r R V )〔`剑有所不同 ,酪氨酸 , 丝
氨酸 ,赖氨酸和色氨酸的个数有所差异 。
表 1 氨基酸组成
T a b l e 1 A m i n o
a e i d s e o m P o s i t i o n o f v i
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G l u G ly A生a C y s V a l M e t ] l e u
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e o a t P r o t e i n 3 6 2 9 1 9 3 7
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3 6 3 5 2 3 4 1 0 1 7
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e o a t P r o t e i n 3 4 3 7 3 7 2 3 2 0 2 4 3 3 6 7 16
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P h e L y s H i s A
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e o a t P r o t e i n 2 7 8 1 3 2 5 2 1 9 2 2 1 37 2
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·
2 6 1 6 12 1 5 2 几6 2 0 4 34 7
.
2
.
4 病毒核酸电镜照片
应用高甲酞胺变性 、 斜面展开法获得了病毒 s s R N A 的电镜照片 ,病 毒 s s R N A 为线状分
子 (图版一 5 ) ,用地图测距仪测定 R N A 分子长度分别为 2 . 5 x l少人 , 1 . 6 X I少人 。
2
.
5 病毒的免疫双扩散试验
从 (图 6) 的结果表 明 , 经我 们分离纯化的球状病毒只与香石竹斑驳病毒抗血清有交叉反
应 ,而与香石竹环斑病毒的抗血清无交叉反应 。
3
. 讨 论
从上海地区分离纯化得到的香石竹球状病毒 , 其形态 、大小 ,和 已经报道的香石竹斑驳病
毒及香石竹环斑病毒相似 。 此两种病毒的生物学特性 、 病毒粒子大小和形态极为相似 ,外壳蛋
白均为单一多肤 ,斑驳病毒外壳蛋白的分子量略大于环斑病毒 。我们的结果证明两者不仅氨基
酸总数有区别 ,而且赖氨酸 、酪氨酸 、 丝氨酸和色氨酸的个数也有较大差异 。 过去的研究证明 ,
此两病毒最大区别点在于斑驳病毒仅含有一个分子量约 l 、 4 x 1 0 6 道尔顿左右的单一 R N A 基
因组 , 而环斑病毒则含有两个分子量约为 1 . 5 x 1 0 6 ( R N A )I 道 尔顿及 0 . s x l护 ( R N A 2) 道 尔
顿左右的基因组 ,且为同一外壳蛋白分别包裹于二种病 毒颗粒之内 , 包裹 R N A Z 的病 毒颗粒
内可含有 2一 3 个拷贝数川 。 但近年来 , 不少研究者报道在香石竹斑驳病毒的制剂内 , 除分子量
约 1 . 4 x l护 道 尔顿左右的基因组外 , 尚存在一个低分子量的核酸条带 ,其大小和环斑病毒的
3 4 上 海 农 业 学 报 8卷
N R AZ 相似 [., 川 ,我们的实验结果再次证实了这一点 。关于此低分子量 R N A 的来源 , 目前尚未
能完全肯定 ,但有作者认为可能是基因组 R N A 3 ’ 未端转录产生的亚基因组 R N A[ 川 。 如果此
说成立 , 那么 , 为何香石竹斑驳病毒与其它的植物病毒不同 ,其亚基因组 R N A 也稳定地被包
裹于病毒颗粒之内 , 则尚有待于研究 。 病毒抗血清的免疫双扩散试验结果进一步证明 ,上海地
区危害最为严重的病毒病是 由斑驳病毒所引起的 。
由于该病毒极易广泛传播 ,在生产中带毒母株的繁殖为主要传播途径 。随着我国香石竹栽
培面积的扩大 以及 国内外交流的增加 (其中包括一些新引进品种和组织培养苗 ), 更易引起病
毒病的传播 ,造成生产上的重大损失 。 因此应用纯化的病毒制备成高效价的抗血清川 ,用于生
产单位的种苗带毒的检测 , 以防止该病毒的广泛扩散 ,极为重要 。 我们的实验结果为进一步建
立早期诊断方法和防止病毒病的传播提供了理论依据 。
参 考 文 献
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( 2 0 )
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3 0~ 3 9
.
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2 2 7~ 2 3 7
·
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1 98 6
,
( 1 5 0 )
:
1 96一 2 0 6 .
3期 沈学仁等 : 上海地 区香石竹斑驳病毒的理化特性 3 5
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A b s t r a e t A n i e o s a h e d r o n v i r u s w i t h a d i
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n a t io n d is e a s e d p l a n t s i n S h a n g h a i a r e a
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T h e S D S
一
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-
t a i n s a s i n g l e e a p s id e p o l y p e p t id e b a n d w i t h m o l e e u l a r w e i g h t a b o u t 4 0 k d
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T h e a m i n o a e id s
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T h e n u e l e
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T ll e im m u n o l o g i e a l d o u b le d i f f u s i o n t e s t e o n f i
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V l r U S
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K e y w o r d s C r a n a t i o n m o t t l e
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S i z e a n d m o
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P
r o p e r t ie s
【成果摘要】
兔 ’ (病 毒 性 出 血 症 ) 1 号 疫 苗
陈舟棣 陈 谊 黎济 申 赵洪兴 周智爱 类英远
余 鸣 王先丈 盛度纯 徐泉兴 杨惠萍 张从平
(上海市农业 科学院畜牧兽 医研究所 , 上海 2。。0 3 0)
免病毒性出血症是一种致家免急性死亡的传染病 , 1 9 8 4 年于江 、浙 、 沪一带流行 , 以后波及我国大陆许多
省市 。 本研究采用不影响病毒抗原成份的新型灭能齐J灭能病毒 , 辅以佐剂配制疫苗的新工艺研制成兔 1 号疫
苗 , 作用于病毒核酸的灭能剂不仅灭能效果确实 , 而且对病毒的抗原性无影响 ,使疫苗具有较好的免疫原性 ;
应用佐剂则可加强对机体的刺激 , 延缓抗原吸收 , 使其对机体的刺激作用比较强而持久 , 从而加强疫苗的免疫
作用 ,免 1 号疫苗给家兔接种后无死亡 、精神萎顿等不良反应 , 肌肉注射吸收 良好 , 无局部反应 ,用于怀孕母兔
不会引起流产 , 有 良好的安全性 ,兔 1 号疫苗免疫家兔后保护力产生快 , 实验室测得保护力最早产生时间是
36 ~ 4 8 h
, 用于发病群 , 一般 3d 能控制病情 , 免疫力持续时间长 , 免疫后 8 个月保护力 10 % , 12 个月“ . 7 % ,
最小免疫量为灭能寂毒液稀释 1 00 倍配苗免疫兔 10 %保护 , 免疫效果极好 ,在 4℃ 及室温保存 5个月以上
仍有免疫力 。 兔 1 号疫苗经实验室试验 、 区域试验及中间试验结果 ,表明符合试制新疫苗要求 。 试验期间在上
海 、江苏 、 山东 、 江西 、 北京等 12 省市试用 30 多万头份 , 观察到了一致的良好效果 ,兔 1号疫苗试行规程草案
是由中国兽药监察所向农业部生物药品规程委员会建议列为试行办法 , 试制 , 试用 .
兔 1 号疫苗在兔病毒性出血症流行期间 , 在结束了实验室试制试验阶段后 . 即在生产中边试验边应用 ,不
仅能有效地预防疾病的发生 , 而且用于发病群能迅速地控制疾病 ,兔 1 号疫苗试用至今已有直接收益 30 万元
以上 , 社会效益 6 0 0 万元以上 .