全 文 ：第 32卷　第 1期
2010年 1月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNALOFBEIJINGFORESTRYUNIVERSITY
Vol.32, No.1
Jan., 2010
收稿日期:2009-02-24
基金项目:北京市自然科学基金项目(6072014)、国家环保部课题(物种 07--二--3--1)。
第一作者:张毓 ,博士生 ,高级工程师。主要研究方向:兰科植物。电话:010--62591283　Email:bjyzhang@hotmail.com　地址:100093　
北京香山卧佛寺路北京市植物园。
责任作者:张启翔 , 教授 ,博士生导师。 主要研究方向:园林植物资源与育种。电话:010--62338005　Email:zqx@bjfu.edu.cn　地址:
100083北京清华东路 35号北京林业大学园林学院。
本刊网址:htp:∥www.bjfujournal.cn;htp:∥journal.bjfu.edu.cn
大花杓兰种子形态特征与生活力测定
张　毓1, 2　张启翔 1　赵世伟2　凌春英 1
(1北京林业大学园林学院 ,国家花卉工程技术研究中心　2北京市植物园)
摘要:为建立濒危兰科植物大花杓兰的种子无菌萌发技术体系 , 该实验通过含水量测定 、TTC染色 、石蜡切片 、无菌
萌发等方法 , 综合研究种子授粉后 28 d(28 DAP)、56 DAP和 84 DAP的未成熟种子和成熟种子(97 DAP)的形态和
生理活性特征。结果表明:28 DAP的种子刚受精 ,含水量高达 92.97%;其他时期的种子均处于球形胚时期 , 随种
胚的发育 , 含水量从 85.32%降至 7.70%;28 DAP的幼嫩种子在 TTC中着色困难 , 但 TTC可以作为球形胚时期成
熟种子的生活力指示剂;在相同的无菌培养条件下 , 56DAP的种子萌发率为 31.44%, 其余时期的种子均未观察到
种子萌发 , 28DAP的种子过于幼嫩而不能萌发 , 84 DAP和 97 DAP的种子则是受次生抑制因子的影响。 说明大花
杓兰无菌萌发的适宜采种时机为种胚已发育至球形胚阶段 、次生抑制因子起作用前的时期。
关键词:兰科;杓兰;种子;形态特征;含水量;生活力测定
中图分类号:S682.31　　文献标志码:A　　文章编号:1000--1522(2010)01--0069--05
ZHANGYu1, 2;ZHANGQi-xiang1;ZHAOShi-wei2;LINGChun-ying1.Morphologicalcharacteristics
andviabilitytestingofCypripediummacranthosseed.JournalofBeijingForestryUniversity(2010)32
(1)69-73 [ Ch, 11 ref.]
1 NationalEngineeringResearchCenterforFloriculture, ColegeofLandscapeArchitecture, Beijing
ForestryUniversity, 100083, P.R.China;
2 BeijingBotanicGarden, 100093, P.R.China.
InordertoestablishinvitroseedgerminationtechniquesofCypripediummacranthos, anendangered
orchidspecies, weinvestigatedmorphologicalcharacteristicsandphysiologicalviabilityofmatureand
immatureseedsat28, 56, 84 and97 daysafterpolination(DAP)throughwatercontenttesting, TTC
viabilitytesting, parafin-sectionandinvitrogermination.Theresultsshowedthatseeds, colectedat28
DAP, werejustfertilized, inwhichthewatercontentwasashighas92.97%.Seedscolectedatother
timeswerealatastageofglobalembryoandthewatercontentvariedfrom85.32% to7.70%.TTC
testingwasnotabletotestseedviabilityat28DAPsincetheembryowastooyoungtobestained.Under
thesameinvitrogrowingconditions, 31.44% oftheseedscolectedat56 DAPgerminated, whileno
germinationwasobservedinseedscolectedatothertimes.Seedscolectedat28 DAPwereprobablytoo
youngtogerminateandseedscolectedat84 DAPand97 DAPcouldbepreventedfromgerminatingin
vitrobysomesecondaryfactors.Asuitablecolectiontimeforseedgerminationinvitrowouldbebetween
thetimesaftertheseedsreachedtheirglobalembryostageandbeforesecondarycontrolfactorsstartedto
function.
Keywords　 Orchidaceae;Cypripediummacranthos;seed;morphologicalcharacteristics;watercontent;
viabilitytesting
DOI :10.13332/j.1000-1522.2010.01.008
　　兰科植物种子结构简单———由一个仅发育至球
形胚阶段的胚和外面包被着的种皮构成 ,缺乏在种
子萌发初期提供营养的储存器官 ———胚乳。因此 ,
在野外需要由合适的共生真菌提供营养才能萌发生
长 [ 1] 。
兰花分株繁殖的效率很低 ,但一个蒴果内却含
有成千上万的种子 ,目前兰花种子人工繁殖一般采
用非共生的无菌萌发方式 [ 2] ,大花杓兰(Cypripedium
macranthos)也不例外 。在兰花无菌播种前往往需要
进行种子活力测定 ,以了解种胚的发育情况和生理
活性 ,避免因使用播种材料不当而造成的人力 、物力
和时间浪费 。通过染色反应来确定种子的生理活性
在兰花保育和离体培养中是十分重要的环节 [ 3] ,荧
光染色法(fluoresceindiacetate)和红四氮唑 (TTC:
triphenyltetrazoliumchloride)化学染色法都可以用
来测定兰花种子的活性 ,但是在实际应用中 TTC染
色法更为广泛[ 4-5] 。
大 花 杓 兰 是 兰 科 (Orchidaceae)杓 兰 属
(Cypripedium)一种地生兰 ,在我国主要产于黑龙
江 、吉林 、辽宁 、内蒙古 、河北 、山东和台湾 ,具有较高
的观赏价值及药用价值。由于过度采集 ,我国大花
杓兰自然种群生存状况不容乐观 ,迫切需要采取有
效繁殖措施 ,扩大野生种群[ 6] 。以杓兰属为代表的
温带地生兰种子的萌发十分困难 ,而且往往存在成
熟种子难以萌发 ,但发育过程中某一阶段的未成熟
种子却可以萌发的现象 [ 7-8] 。为研究大花杓兰的种
子无菌萌发的适宜采种时期 ,需要了解种子相关生
物学特性和生理活性 ,但是大花杓兰的种子十分细
小 ,长轴方向也不足 1 mm,肉眼能观察到的信息十
分有限 。对其内部种胚是否败育 、生活力及发育进
程等情况需要在体视显微镜和光学显微镜下进行观
察 。因此 ,本研究结合显微镜和外部形态观察 ,通过
TTC染色和石蜡切片等方法对不同发育阶段的种子
进行研究 ,以了解其种子形态特征 、生理活性以及其
发育成熟度与无菌萌发的关系 ,为大花杓兰种子无
菌萌发研究提供选择依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
大花杓兰是濒危兰科植物 ,没有人工栽培植株
可供实验。本实验种子材料来自北京郊区海拔
1 700 m左右的百花山大花杓兰自然种群植株。
1.2　方　法
1.2.1　种子采集
大花杓兰从授粉后到蒴果成熟开裂需要 14周
左右。在盛花期对大花杓兰进行人工授粉 ,分别于
授粉后第 28、56和 84天及第 97天蒴果成熟开始开
裂时前往百花山采集不同发育阶段的健康蒴果。
1.2.2　种子预处理
未成熟的蒴果先切除两端多余的果柄和宿存花
瓣 ,肥皂水清洗 3次 ,流水冲洗 30 min后 ,将蒴果转
移到超净工作台内 , 用 2.5%的次氯酸钠浸泡 10
min,无菌水冲洗 3次 ,滤纸吸干多余水分 ,在培养皿
中切开蒴果 ,露出种子。同一个蒴果中 ,取出部分种
子用于播种 ,余下部分种子用于 TTC染色。成熟种
子没有果皮的密封包被 ,需要对种子直接灭菌 。在
超净工作台内将种子放入洁净的容器 ,采用 1%的
次氯酸钠灭菌 ,无菌水冲洗数次 ,滤干水分 ,取出部
分种子用于播种 ,余下部分用于 TTC染色备用。
1.2.3　种子无菌播种
培养基选择 VW改良种子无菌萌发培养基 ,即
在 VW基本培养基中加入 1.2mg/L的 6-BA和 100
mL/L椰乳 。将灭菌处理好的种子均匀播种于培养
基中;授粉后 28天(28DAP)的种子未开散 ,播种时
分成小团接种;56 DAP、84 DAP和成熟(97 DAP)的
种子已开散 , 均匀分散接种于同样的培养基中 。
20℃条件下暗培养。接种后统计每瓶中的播种数
量 ,萌发数以播种后第 9周的统计数据为标准 。
1.2.4　种子 TTC染色
按常规标准方法配制 1%的 TTC溶液 ,完全溶
解后置于冰箱闭光冷藏备用。将种子放入带盖子的
玻璃小瓶中 ,每瓶加入 10 mLTTC溶液 , 放在 20℃
黑暗条件下染色 ,着色后取出种子用水彻底冲洗干
净;在尼康体视显微镜下观察种子染色情况 ,随机选
取 3个视野 ,分别计算每个视野的种子总数 、败育种
子数和种胚未着色的种子数量 。
1.2.5　石蜡切片观察
将不同发育期的种子用 FAA固定液浸泡 ,真空
抽气固定 ,常温室内保存 。常规石蜡切片法制片 ,尼
康光学显微镜下观察。
1.2.6　数据统计与处理
相关数据采用 SAPSS13.0软件进行统计分析 。
各百分数数据进行了反正弦转换 , 转换后采用
Duncan新复级差法检验大花杓兰不同发育阶段含
水量 、染色率 、有胚率和无菌萌发率等生理指标的差
异显著性 。
2　结果与分析
2.1　大花杓兰不同发育时期的种子形态特征
在超净工作台内用肉眼观察:28DAP的蒴果细
长 ,不饱满;种子白色 ,幼嫩 ,未开散 ,与胎座等组织
贴生紧密 ,不易分开(图 1A)。 56 DAP的蒴果比 28
70 北　京　林　业　大　学　学　报 第 32卷　
DAP的蒴果体积明显增大 ,饱满;种子开散呈细粉
末状 ,水分含量高 ,比较湿润;不同果荚内种子颜色
有所不同 ,多为浅黄色 、黄色 ,偶见浅褐色 ,处于一个
渐变期(图 1B)。 84 DAP的蒴果接近成熟;种子开
散 ,含水量比第 8周时明显下降;种子颜色为棕褐
色 。 97 DAP的蒴果颜色由绿转黄 ,成熟开裂 ,棕褐
色的种子从窄长的裂隙中逸出(图 1C),肉眼观察
84 DAP和 97 DAP的种子区别不明显。
不同发育时期采集的种子经 TTC染色后在体视
显微镜下观察:28 DAP的种子聚集成团 ,与其着生的
胎座组织不易分离;种子体积小 、十分幼嫩 ,饱含水
分 ,种皮薄 ,呈白色或整个种皮被染成浅红色;种子内
观察不到胚(图 1D)。 56DAP的种子呈单粒分散状;
透过半透明的浅褐色种皮 ,能清楚地观察到圆球形胚
的形态 ,正常发育的胚大多能染成红色或橙红色(图
1E)。 84DAP的种子单粒分散状 ,种皮颜色呈较深的
褐色 ,遮盖性比 56 DAP的种皮强 ,但仍能清楚地观察
到胚的发育情况 ,胚体在种皮内所占空间比 56 DAP
时增大 ,颜色加深;正常发育的胚大部分能染成深红
色 ,颜色深浅会略有不同(图 1F)。
A.28DAP的未成熟绿色蒴果剖开图 , 在 90mm培养皿中;B.56DAP的未成熟绿色蒴果剖开图 ,在 90mm培养皿中;C.成熟种子在 90mm
培养皿中;D.体视显微镜下 28DAP的种子 ,比例尺 =100μm;E.体视显微镜下 56DAP的种子 ,比例尺 =200μm;F.体视显微镜下 84DAP
的种子 ,比例尺 =200μm;G.28DAP的种子纵切面 ,示刚受精的胚囊和合子 ,比例尺 =20 μm;H.56DAP的种子纵切面 ,示内珠被紧贴球
形胚生长 ,比例尺 =100μm;I.84DAP的种子纵切面 ,示未分化的球形胚和内外种皮间的空气腔 ,比例尺=50μm
图 1　大花杓兰不同发育时期的种子形态特征
Fig.1　MorphologicalcharacteristicsofseedsofC.macranthosatdiferentdevelopmentalstages
　　石蜡切片染色后在光学显微镜下观察:28 DAP
的种子胚囊发育成熟 ,部分胚囊的卵细胞受精产生
合子;细胞核位于合点端 ,核大 ,有一个大核仁;液泡
在珠孔端(图 1G)。 56 DAP的种子种胚处于球形胚
期 ,内珠被细胞紧贴胚体(图 1H)。 84 DAP的种子
接近成熟 ,形态结构和 97 DAP的成熟种子形态基
本相同 ,二者均有内外双层种皮 ,没有胚乳;胚体仍
处于球形胚时期 ,未能进一步分化;外珠被发育成的
外种皮细胞形成次生壁 ,支撑起纺锤形的轮廓 ,内外
种皮间是巨大的空气腔 ,有利于该微小种子成熟后
的散布(图 1I)。
2.2　大花杓兰不同发育时期的种子含水量和生活力
大花杓兰不同发育时期的种子含水量 、TTC染
色率 、有胚率和萌发率 4个生理性状指标如表 1。
从表 1中可以看出:28DAP的种子平均含水量高达
(92.97±0.43)%;随着种子的发育 ,含水量迅速降
低 , 84 DAP的接近成熟种子平均含水量降至
(52.77±1.03)%,成熟时的种子平均含水量骤降
至 10%以下 ,低至(7.70±0.74)%,达到安全含水
量以下。 4个发育时期之间含水量差异极显著 。
71　第 1期 张　毓等:大花杓兰种子形态特征与生活力测定
28 DAP的种子过于幼嫩 ,透过种皮观察不到内
部种胚的情况 ,在 TTC染色时种胚也不能着色 。后
面 3个发育时期的平均有胚率分别为 (93.63 ±
4.74)%、(93.87±4.02)%和(96.38±2.48)%,相
互之间差异不显著;而且种胚均能被 TTC溶液染成
红色 , 平均染色率分别为 (59.15 ±4.86)%、
(57.87±4.24)%和(55.71±2.81)%,三者之间的
差异不显著 。
在种子无菌萌发实验中 ,种子萌发的标准以种
胚膨大突破种皮 ,露出圆球胚为标准。在采用相同
的无菌培养条件下 , 28 DAP的种子在播种后外植
体很快褐化 ,基本不能萌发 ,偶见 1 ～ 2粒萌发也在
短期内死亡 ,不能发育长大;56 PDA的种子平均萌
发率为(31.44 ±0.93)%;84 DAP接近成熟和 97
DAP成熟的种子萌发率均为零。
表 1　大花杓兰不同发育时期的种子生理特点比较
Tab.1　ComparisonofwatercontentandviabilityofseedsofC.macranthosatdifferentdevelopmentalstages %
含水量 染色率 有胚率 萌发率
28DAP (92.97)74.65±0.43 aA — — 0bB
56DAP (85.32)67.51±0.70 bB (59.15)50.44±4.86aA (93.63)79.64±4.74aA (31.44)34.09±0.93aA
84DAP (52.77)46.59±1.03 cC (57.87)49.86±4.24aA (93.87)78.64±4.02aA 0bB
97DAP (7.70)16.03±0.74 dD (55.71)48.49±2.81aA (96.38)80.47±2.48aA 0bB
注:表中各指标数据经反正弦转换 ,括号内为转换前数据。同列中不同小写字母表示在 5%水平上差异显著 ,不同大写字母表示在 1%水平上
差异显著。
3　结论与讨论
大花杓兰的种子从授粉到成熟 ,根据环境条件
和天气变化 ,大约需要 14周左右 。本研究以不同的
角度研究 28 DAP、56 DAP、84 DAP、96 DAP的未成
熟和成熟种子形态特征 ,这 4个采种时期基本能代
表发育早期 、发育中期 、接近成熟期和成熟期 4个发
育阶段。结果表明:大花杓兰 28 DAP的种子饱含
水分 ,含水量高达 92.97%;随着种子的发育含水量
逐渐降低 , 到 84 DAP接近成熟时含水量为
52.77%;在蒴果成熟前种子自然脱水 ,导致成熟种
子含水量骤然下降到 7.70%。一般种子成熟时的
安全含水量要低于 12%才能达到安全临界含水
量 [ 9] ,说明大花杓兰种子在成熟时已达到安全含水
量以下 ,有利于种子成熟后在较长一段时期内保持
活性 ,为度过漫长而严寒的冬季 ,寻找适宜的萌发环
境提供可能 。
在种子不同发育时期的 TTC染色实验中 ,所选
用的材料都是发育正常 、无虫眼的饱满蒴果中的种
子 。 28 DAP的种子刚开始受精 ,这一时期的种胚过
于幼嫩 ,即使它们都具有将来发育成正常成熟种子
的潜力 ,但与 TTC溶液不能进行正常的还原反应 ,
染色情况在体视显微镜下观察不到 , TTC不能作为
这一时期种子活性测定的指示剂。在后面 3个发育
时期 ,在体视显微镜下能观察到大部分种胚大而饱
满 ,有胚率均在 90%以上 ,而且相互之间差异不显
著 ,说明他们都是发育正常的健康种子 ,其中大部分
种胚能够被 TTC染成红色 ,染色率稳定在 50% ～
60%之间 ,三者之间的染色率差异不显著 。其中大
约 1 /3胚体形态特征正常的种子未能被 TTC染色
的原因还未知 ,有待进一步研究 。与本课题组相关
研究中经过储藏活性降低的种子染色情况比较 ,该
TTC染色反应方法可以较为客观地反映种子的活性
情况 。TTC可以作为发育中 、晚期至成熟期种子生
活力测定的有效指示剂 。
TTC染色是通过化学反应间接手段测定种子的
生活力 ,种子萌发实验是一种常规的 、更为直接的种
子生理活性测定方式 。在植物胚培养研究中 ,比球
形胚更早时期的幼胚培养对培养基和培养条件等的
要求非常复杂 ,而且成功概率低 [ 10] 。本研究对不同
发育阶段的大花杓兰种子在相同培养条件下进行无
菌播种实验 ,统计结果表明 ,在播种的几千粒 28
DAP种子中仅有 1 ～ 2粒萌发 ,而且不能发育长大 。
28DAP的种子刚受精 ,对其进行无菌播种相当于在
种皮包被下的极早期胚拯救 ,由于过于幼嫩 ,基本不
具有萌发能力 。
56DAP的种胚已发育至球形胚阶段 ,其平均无
菌萌发率为 31.44%;但是在相同条件下进行的 84
DAP的未成熟种子和 97 DAP的成熟种子无菌播种
实验 ,萌发率却为零 。如果仅考虑种胚的发育进程 ,
应该是种子成熟度增加 ,萌发率越高 ,但本研究的结
果与此相反 ,说明在 56 DAP以后 ,伴随种胚的进一
步发育 ,有次生抑制因子阻止种胚萌发。在台湾杓
兰(Cypripediumformosanum)的胚发育与萌发率关
系研究中 ,也有类似的情况出现 ,其种子发育后期的
内种皮被认为是阻止种子萌发的抑制因子 [ 11] 。大
花杓兰种子也具有双种皮 ,发育中期的种子萌发正
常 ,而发育晚期和成熟种子萌发困难 ,也支持这一结
论 ,说明大花杓兰无菌萌发需要在未成熟种子的某
一发育阶段采集种子进行播种 ,才能成功萌发。 56
72 北　京　林　业　大　学　学　报 第 32卷　
DAP的种子可以萌发 ,但授粉后第 56天是否是最
佳采种时期还需要进一步的细胞学实验和更密集采
样的无菌萌发实验来验证 。
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(责任编辑　董晓燕)
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