全 文 ：收稿日期:2009-07-16;　修订日期:2009-10-23
基金项目:教育部春晖计划项目(No.Z2008-1-75014);
宁夏回族自治区自然科学基金(No.NZ0892)
作者简介:张振华(1986-),男(汉族), 山西临汾人 ,现为宁夏医科大学在
读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学研究工作.
＊通讯作者简介:王　妍(1958-),女(汉族),陕西西安人 ,现任宁夏医科
大学教授 ,硕士研究生导师 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学研究工作.
沙枣花超临界二氧化碳萃取物清除自由基的研究
张振华1 , 俞　维 1 , 王基云1 , 王晶霞 2 , 王　妍1＊
(1.宁夏医科大学 ,宁夏 银川　750004;　2.山西医科大学 ,山西 太原　030001)
摘要:目的 通过 DPPH·法测定沙枣花超临界萃取物各组分的清除自由基的能力。 方法 采用超临界 CO2萃取技术对
沙枣花进行萃取 ,对萃取物依次用石油醚 ,醋酸乙酯 , 正丁醇进行萃取 ,通过 DPPH法测定分离釜 I和分离釜 II的萃取物
各组分的清除自由基的能力 ,进行定性和半定量的研究。结果 分离釜 II总的萃取物的清除能力明显大于分离釜 I总的
萃取物的清除能力 ,但是分离釜 I的经石油醚萃取后的水层 , 醋酸乙酯层 , 正丁醇层 , 经醋酸乙酯和正丁醇萃取后的水层
的清除能力分别大于了分离釜 II各组分的清除能力。 结论 沙枣花超临界萃取物各组分对 DPPH· 均具有一定清除作
用 ,且与体积浓度呈量效关系。
关键词:沙枣花;　超临界二氧化碳萃取;　DPPH·
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)06-1335-02
ScavengingActivityofSupercriticalCO2 ExtractofFlowerofElaeagnusAngustifoliaa-gainstFreeRadicals
ZHANGZhen-hua1 , YUWei1 , WANGJi-yun1 , WANGJing-xia2 , WANGYan1＊
(1.NingxiaMedicalUniversity, Yinchuan750004, China;2.ShanxiMedicalUniversity, Taiyuan030001,
China)
Abstract:ObjectiveTostudythescavengingactivityofsupercriticalCO2 extractofflowerofElaeagnusangustifoliaagainstDP-PH.MethodsTheextractionwasperformedbyligroin, acetidinandn-butanolinturn, andthemethodofDPPHwasadoptedto
comparethescavengingactivityagainstfreeradicalsbydiferentpartsofextractsofextractedcaldronⅠ andⅡ , andcarriedout
qualitationandsemiquantitativestudy.ResultsThescavengingactivitybyotherpartsofextractsofextractedcaldronⅡ wasbetter
thanthatofextractedcaldronⅠ .ConclusionSupercriticalCO
2
extractofflowerofElaeagnusangustifoliacanscavengeDPPH,
andthescavengingactivityhasdose-effectrelationshipwithvolumeconcentration.
Keywords:flowerofElaeagnusangustifolia;　SupercriticalCO2 extraction;　DPPH·
　　沙枣花为胡颓子科植物沙枣 ElaeagnusangustifoliaL.的花 ,
主产于西北地区。宁夏沙枣树抗旱耐碱 , 具有很强的生命力 , 也
是宁夏防风固沙的重要植物。每年 5 ～ 6月 , 淡黄色的小花朵释
放出浓郁的芳香气味 , 深受人们喜爱。椐宁夏中药志记载 , 沙枣
花主要含山萘酚 、花白素 、脂肪油和少量挥发油 , 具有止咳平喘的
功能 ,可用于治疗慢性气管炎 [ 1] 。已有学者以食用酒精为提取
剂提取沙枣花中黄酮类化合物 [ 2] , 另有王永宁等 [ 3]对黄酮化合
物的清除羟基自由基进行了初步研究。本课题组的王妍教授对
沙枣花进行了超临界萃取并对其芳香成分进行了研究 [ 4] 。 本文
对沙枣花进行了 CO2超临界萃取 , 应用DPPH法对不同分离釜萃
取物的不同组分进行了清除自由基的研究 , 为进一步对其清除自
由基活性成分的筛选提供基础 , 以及为沙枣花的深度开发和综合
利用提供技术支持和理论依据。
1　仪器与材料
HA062502221 型超临界萃取仪(南通华安超临界萃取有
限责任公司制造);721分光光度计 (北京瑞利分析仪器公
司);电子分析天平 , 分液漏斗。 1, 1二苯基 -2 -苦肼基自由
基(DPPH· )(日本东京化成工业株式会社);无水甲醇(天津
天江);沙枣花采自宁夏银川地区 , 采回后立即在 -20 ℃冷冻
保鲜 。
2　方法
2.1　超临界萃取沙枣花 [ 5] 称取 100 g新鲜冻存的沙枣花放入 1
L的萃取釜中 , 萃取压力 20 MPa, 萃取温度 45℃,流量 30L/min,
动态萃取 120min。从分离釜 I(压力 10MPa, 温度 55℃)接收
分离物 I共 12.3ml, 标记为总萃取物 1;从分离釜II(压力 5MPa
,温度 30℃)接收分离物 II共 21.7 ml, 标记为总萃取物 2。
2.2　各组分的制备 将总萃取物 1倒入分液漏斗中 , 加入等体
积的石油醚进行萃取 ,充分振荡 , 放置分层后 , 得到下层水液 ,
同法再次萃取 , 最后的水层标记为水层 1, 保存石油醚层。 同
法对总萃取物 2进行萃取 , 最后水层标记为水层 2, 保存石油
醚层 。
量取 5 ml的水层 1于分液漏斗中 , 加入等体积的醋酸乙酯
进行萃取两次 , 合并 ,得到醋酸乙酯层 , 自然挥发至 5 ml,标记为
醋酸乙酯层 1;剩余水层中加入等体积的正丁醇萃取两次 ,合并 ,
得到正丁醇层 10 ml, 自然挥发至 5 ml, 标记为正丁醇层 1, 最后
剩余水层标记为萃后水层 1。
量取 5 ml的水层 2于分液漏斗中 , 加入等体积的醋酸乙酯
进行萃取两次 ,合并 , 得到醋酸乙酯层 , 自然挥发至 5 ml, 标记为
醋酸乙酯层 2;剩余水层中加入等体积的正丁醇萃取两次 ,合并 ,
得到正丁醇层 , 自然挥发至 5 ml,标记为正丁醇层 2,最后剩余水
层标记为萃后水层 2。
2.3　DPPH·标准曲线的制作 准确称取 [ DPPH· ] 2.5 mg, 用甲
醇定容到 100ml, 配制成质量浓度为 2.5 ×10-2mg/ml的标准溶
液 ,置冰箱中备用(现用现配)。分别取 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml标准溶
液 ,用甲醇定容至 10 ml, 最终质量浓度分别为 0, 5, 10, 15, 20, 25
μg/ml。测定上述标准溶液在 515nm波长处的吸光度 ,制作标准
曲线(见图 1)。其线性回归方程为:
Y= 0.030 4X+2E-16 , R2 =0.999 7
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图 1　DPPH·标准曲线
2.4　清除 DPPH·的测定方法 DPPH·在有机溶剂中是一种稳
定的自由基 ,其甲醇溶液显深紫色 , 在 515nm处有强吸收。当其
与抗自由基活性物质的孤对电子配对时 , 其吸收消失或减弱 , 通
过测定吸收减弱的程度 ,可评价自由基清除剂的活性。
对 DPPH· 自由基清除方法的测定参阅 Brand-William
(1995)[ 6]研究。分别取以上制备不同组分各 20, 40, 60, 80, 100
μl, 量取相应体积的浓度为 1.01×10 -1 mol/L的 DPPH·溶液至
4 ml。立即混匀 , 用比色皿 , 在 515 nm波长处进行测定 , 在一定
时间间隔内测定吸光度 ,直到读数稳定。
通过公式来计算自由基抑制率
清除率(%)=[ 1-A1 /A0] ×100%
式中 A0为未加式样的 DPPH·在 515 nm处的吸光度 , A1为
抗氧化性物质与 DPPH·反应后的 515 nm处的吸光度。
3　结果
按上述方法 ,测定其不同体积浓度 ,即 4, 8, 12, 16, 24, 32 μl/
ml的各组分清除 DPPH·的能力。结果见表 1及图 2 ～ 3。
表 1　沙枣花 CO2 超临界萃取物自由基清除能力的比较
分离Ⅰ 体积浓度C/μl· ml-1
清除率
(%) 分离Ⅱ
体积浓度
C/μl· ml-1
清除率
(%)
总萃取 1 4 16.77 总萃取 2 4 24.63
8 22.56 8 32.78
12 29.62 12 46.23
16 37.25 16 59.65
20 46.32 20 70.50
水层 1 4 9.87 水层 2 4 7.12
8 17.56 8 13.45
12 27.18 12 20.57
16 36.41 16 27.68
20 44.87 20 34.28
醋酸乙酯层 1 4 2.35 醋酸乙酯层 2 4 3.99
8 5.23 8 6.31
12 7.45 12 8.24
16 12.03 16 10.17
20 18.17 20 11.97
正丁醇 1 4 2.62 正丁醇 2 4 2.45
8 5.9 8 3.60
12 7.73 12 4.38
16 10.22 16 9.01
20 13.76 20 13.13
萃后水层 1 4 6.28 萃后水层 2 4 5.15
8 12.69 8 9.28
12 18.21 12 13.4
16 24.62 16 17.68
20 30.38 20 21.91
由表 1可看出 ,分离釜 II总的萃取物的清除能力明显大于
分离釜 I总的萃取物的清除能力 , 但是经石油醚萃取后分离釜 I
的水层 ,醋酸乙酯层 , 正丁醇层 ,萃后水层的清除能力分别大于了
分离釜 II各组分的清除能力。
由图 2 ～ 3可以看出 , 分离釜 I和 II的各组分对 DPPH自由
基均有不同程度的清除活性 , 且与体积浓度具有明显的量效关
系;并可以看出总萃取物经过石油醚萃取后自由基清除能力都有
所减少 ,分离釜 II的减少尤为明显;萃后水层的自由基清除能力
明显强于醋酸乙酯层 , 正丁醇层 , 但醋酸乙酯层和正丁醇层之间
的清除能力相差不大。
图 2　分离釜Ⅰ各组分清除 DPPH·的能力
图 3　分离釜Ⅱ各组分清除 DPPH·的能力
4　讨论
DPPH自由基法是判定药物体外抗氧化活性的经典实验方
法。本研究结果表明 , 沙枣花各组分都可以清除 DPPH自由基 ,
但清除能力存在差异 , 其中水总萃取物 >水层 >萃后水层 >醋酸
乙酯层≈正丁醇层。总萃取物 2的清除率明显大于总萃取物 1,
但经石油醚萃取后的水层 2的清除能力大大减少 , 并小于水层
1, 说明总萃取物 2的石油醚萃取物中也含有大量的清除 DPPH
自由基的物质。同时分离釜 I与 II的各组分对 DPPH自由基的
清除能力相比 , 两者之间有差异 ,可能是由于 CO2超临界提取分
离釜 I和 II的压力和温度的不同导致了各组分所含物质种类或
含量的不同引起的。从结果可以看出 , 分离釜 I和 I的水层和萃
后水层的清除自由基的能力都比较强 , 为以后的抗氧化活性成分
的筛选提供了方向。
本次实验结果说明了沙枣花中含有能够清除 DPPH自由基
的物质 ,具有抗氧化活性 ,可在定性 , 半定量的基础上作进一步的
定量和筛选活性物质的研究;同时提醒我们 , 在利用超临界提取
时可以通过控制分离釜 I和 II的压力和温度来达到初步的分离
的效果 ,为我们进一步的清除自由基活性成分的筛选提供基础。
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 6期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21 NO.6